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Verfahren zur Herstellung von Produkten mit Vitamin-Bo2-Aktivität
Die
Erfindung bezieht sich auf die Herstellung und Isolierung von therapeutisch wertvollen
Stoffen, insbesondere von Produkten, welche als therapeutisch wirksamen Bestandteil
eine bisher unbekannte chemische Verbindung enthalten, die als Vitamin B bezeichnet
werden soll.
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Die neue Verbindung »Vitamin B12« ist ein stark wirkender Wachstumsfaktor
für den Mikroorganismus »Lactobacillus lactis Dorner« (LLD) und besitzt ausgeprägte
effektive Wirkungen bei der therapeutischen Behandlung von perniciöser Anämie.
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Als Ausgangsstoffe werden LLD-aktive Rohmaterialien, d. h. Stoffe
verwendet, die eine Substanz enthaften, welche befähigt ist, das Wachstum von Lactobacillus
lactis Dorner zu begünstigen. LLD-aktive Rohstoffe können z. B. aus handelsüblichen
Leberpräparaten oder durch Züchtung des Mikroorganismus Streptomyces griseus auf
einem geeigneten Nährmedium durch Adsorption des aktiven Materials aus der Kulturbrühe,
Ausziehen des Adsorbats mittels einer wäßrigen Lösung von Pyridin oder alkylsubstituiertem
Pyridin und Überführung des Auszugs in ein Konzentrat gewonnen werden.
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Es ist zwar schon bekanntgeworden, aus der Leber Antiperniciosasubstanzen
herzustellen, wobei die für die Isolierung von Wirkstoffen üblichen Arbeits-
methoden
der Extraktion, der Fällung der Adsorption u. dgl. Verwendung fanden; diese bekannten
Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß sie umständlich und zeitraubend sind. Die
hierbei erhaltenen Leberpräparate weisen jedoch gewöhnlich 99,98 0to inertes Material
auf und enthalten Vitamin B12 höchstens in Spuren, das nach den üblichen Methoden
hieraus schwerlich isoliert werden kann.
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Allgemein betrachtet, kann die Herstellung von Produkten mit ausgeprägter
Vitamin-Bl2-Aktivität erfindungsgemäß derart erfolgen, daß ein LLD-aktives Rohmaterial,
z. B. ein Leberpräparat, oder ein Streptomyces griseus als Hauptbestandteil enthaltendes
Rohkonzentrat mit Hilfe eines Lösungsmittels extrahiert wird und durch Einführung
der so erhaltenen Lösung in eine mit adsorbierendem Material beschickte Kolonne
eine chromatographische Fraktionierung bewirkt wird, worauf die Kolonne zwecks fraktionierter
Extraktion der aktiven Substanz aus dem Adsorptionsmittel mit einem geeigneten Lösungsmittel
ausgewaschen wird und der Auszug in ein Vitamin-Bl2-Konzentrat übergeführt wird.
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Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Fraktion eines
Leberpräparats, welche mindestens IOOO Einheitenimg LLD aufweist, als Ausgangsmaterial
verwendet. Eine derartige Fraktion kann aus handelsüblichen Leberpräparaten gewonnen
werden. So kann man z. B. nach dem Verfahren von Daking und Weet (Journ. Biol. Chem.
109, 489 [I935]) aus einem wäßrigen Leberextrakt eine in 70°/Oigem Äthanol lösliche
Fraktion gewinnen. Das feste Ausgangsmaterial kann in wäßriger Lösung der chromatographischen
Behandlung in einer mit Holzkohle beschickten Kolonne unterworfen werden und das
aktive Material mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. 5001,igem Äthanol, ausgezogen
werden.
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Andere brauchbare Extraktionsmittel sind z. B.
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5001obiges Aceton, mit Butanol gesätilgtes Wasser, mit Benzylalkohol
gesättigtes Wasser und Eisessig.
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Nach einer anderen Ausführungsform wird die durch Extraktion des
festen Ausgangsmaterials mit einem niedrigen aliphatischen Alkohol erhaltene alkoholische
Lösung der chromatographischen Behandlung in einer Kolonne unterworfen, welche aktive
Tonerde enthält und das aktive Material mit Methanol oder wäßrigem Methanol extrahiert.
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Die Auszüge werden in kleinen Fraktionen gewonnen, und die Aktivität
der einzelnen Fraktionen durch mikrobiologische Prüfung mit Hilfe von Lactobacillus
lactis Dorner festgestellt. Die eine hohe Aktivität aufweisenden Fraktionen werden
entweder im gefrorenen Zustand getrocknet oder auf ein geringes Volumen eingeengt.
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Die z. B. aus der Tonerdebehandlung hervorgegangenen festen oder
konzentrierten Zwischenprodukte werden mit Äthanol extrahiert und die in Äthanol
unlöslichen Feststoffe ausgeschaltet. Die Äthanollösung wird zur Trockne gebracht,
der Rückstand in Methanol gelöst und alsdann durch Zugabe von Aceton oder Äther
ein Niederschlag erzeugt, der nach Abtrennung von der Flüssigkeit in Wasser gelöst
wird. Durch Zugabe von Aceton zu der wäßrigen Lösung wird wiederum ein Niederschlag
erzeugt, der in Methanol gelöst wird, worauf mehrere Raum teile Aceton zugefügt
werden. Der hierbei entstandene Niederschlag wird nach Abtrennung von der Flüssigkeit
in Wasser gelöst und durch sorgfältige Zugabe von Aceton bis zur Trübung zur Kristallisation
gebraucht. Die erhaltenen Kristalle. werden mit Aceton gewaschen und aus einem Wasser-Aceton-Gemisch
umkristallisiert.
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Nach einer Ausführungsform werden die Vitamin-Bl2-Konzentrate nach
den Lösungs- und Fällungsvorgängen einer weiteren Reinigung mit Hilfe einer bekannten
Gegenstromverteilung zwischen Wasser und einer Mischung von 75 0!o Toluol mit 25
01o o-Kresol unterworfen und das Produkt aus den besten Fraktionen durch Kristallisation
gewonnen (vgl. Craig: J. Biol. Chem. I6I, 32I bis 332 [I945] »Identification of
Organic Compounds by Destillation, Studies«).
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Gewünschtenfalls können die durch Behandlung mit Aktivkohle erhaltenen
Konzentrate in einem niedrigen aliphatischen Alkohol gelöst werden und die alkoholische
Lösung der chromatographischen Behandlung in einer mit aktiver Tonerde beschickten
Kolonne unterworfen werden.
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Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein vorwiegend
aus Streptomyces griseus bestehendes Rohkonzentrat mit Wasser oder einem niedrigen
aliphatischen Alkohol, wie Methylalkohol, extrahiert. Die Auswahl der Extraktionsflüssigkeit
ist abhängig von dem Adsorptionsmaterial, das für die Durchführung der chromatographischen
Fraktionierung verwendet wird. Als Adsorptionsmittel können Aktivkohle, aktive Tonerde
u. dgl. Verwendung finden. Aktive Tonerde hat sich als besonders geeignet erwiesen.
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Beim Arbeiten in Kolonnen, welche Aktivkohle enthalten, hat sich
die Anwendung wäßriger Extrakte, beim Arbeiten mit mit aktiver Tonerde beschickten
Kolonnen die Anwendung alkoholischer Extrakte als vorteilhaft erwiesen. Die Kolonne
wird vorzugsweise naß beschickt, z. B. derart, daß sie mit dem Adsorptionsmittel
und dem für die Extraktion dienenden Lösungsmittel gefüllt wird und das Lösungsmittel
abtropfen gelassen wird, bis sein Spiegel die Oberfläche des Adsorptionsmittels
in der Kolonne erreicht.
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Der alkoholische Extrakt wird auf die Oberfläche der in der Kolonne
befindlichen aktiven Tonerde aufgegossen und durchfließt das Adsorptionsmaterial
durch seine natürliche Schwere oder auch mit Hilfe von Druck. Die Kolonne wird alsdann
mit frischem Lösungsmittel beschickt, und geeignete Fraktionen des Extrakts werden
gewonnen. Die ausreichende Aktivitäten aufweisenden Fraktionen können mikrobiologisch
oder durch ihre Rosafärbung ermittelt werden und einzeln oder nach Vereinigung konzentriert
werden. Die konzentrierte Lösung wird mit einem damit mischbaren Lösungsmittel,
in dem die aktive Substanz unlöslich ist, wie z. B. Aceton, versetzt und der hierbei
entstehende rote Niederschlag gewonnen. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst und
dann Aceton zugegeben, wobei rote Kristalle von Vitamin B1, ausgeschieden werden.
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Die gemäß Erfindung angewandten Aufarbeitungsmethoden, wie beispielsweise
die chromatographische Fraktionierung, sind zwar schon an Präparaten, die
aus
der Leber gewonnen wurden, angewandt worden, wie jedoch gerade das Beispiel der
Bestimmung von Lipochromen in menschlicher Leber (vgl.
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Zechmeister und von Cholnoky, Die chromatographische Adsorptionsmethode
[I937]) zeigt, ist es auch bei Kenntnis dieser Methoden allein noch nicht möglich,
ein Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 aus der Leber zu entwickeln. Die Leber
wird nach dieser Veröffentlichung durch wiederholte Behandlung mit Alkohol dehydratisiert,
dann mit Äther extrahiert und der gewonnene Extrakt mit konzentrierter alkoholischer
K O H I6 bis 20 Stunden hydrolysiert; jedoch ein derart behandeltes Leberpräparat
kann kein Vitamin B12 mehr enthalten, da durch die Alkoholbehandlung beträchtliche
Mengen Vitamin B12 aus der Leber entfernt werden, überdies Vitamin B12 in Äther
unlöslich ist und schließlich durch die KOH-Behandlung das Vitamin B12, sofern überhaupt
welches in dem Ätherextrakt vorhanden ist, zerstört wird.
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Das erfindungsgemäß in wesentlich reiner Form gewonnene Vitamin Bla
ist eine rote Verbindung. Die Analyse von zwei im Vakuum bei 1000 während 2 Stunden
getrockneten Proben ergab folgende Werte: C .................. 56,35 % 56,II % H
.................. 6,72 % 6,72 % N .................. I4,5I % I4,76 % P ...................
2,24 °/o 2,27 0/o Co ................. 4,42 % 4,58% Es darf angenommen werden, daß
die geringfügigen Unterschiede zwischen der Summe der Prozentgehalte und 100 % auf
der Anwesenheit von Sauerstoff beruhen.
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Nach vorstehender Analyse dürfte dem Vitamin B12 etwa die empirische
Formel C616iHs69iNi4OiiPCo zukommen. Vitamin B12 ist löslich in Wasser, Methylalkohol,
Äthylalkohol und Phenol und im wesentlichen unlöslich in Aceton, Äther und Chloroform.
Vitamin B12 hat einen Verteilungskoeffizienten von etwa I,46 in dem System 75 01o
Toluol-25 01o o-Kresol-Wasser und einen Verteilungskoeffizienten von etwa 1,2 in
dem System Wasser-Benzylalkohol. Die Verbindung kristallisiert aus geeigneten Lösungen,
wie z. B. wäßrigem Aceton, in Form roter Kristalle, welche die folgenden kristallographischen
Zwischeneigenschaften aufweisen: Brechungsindex sa I,6I9, n I,649, nγ I,659.
Vitamin-Bl2-Kristalle haben keinen ausgesprochenen Schmelzpunkt; sie dunkeln bei
etwa 210 bis 2200.
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Das Absorptionsspektrum von Vitamin B12 in wäßriger Lösung ist gekennzeichnet
durch Maxima von 2780 A (E11," = 62,7).
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Das Spektrum ändert sich nicht merklich bei Änderung des pE-Wertes.
In saurer Lösung vermindert sich die Intensität von 3610 Ä um etwa 10%; in alkalischer
Lösung zeigen sich andere geringfügige Änderungen, und die feine Struktur wird weniger
ausgeprägt.
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Das infrarote Absorptionsspektrum wurde mit einem sorgfältigkalibriertenPerkin-Elmer
I2 A-Spektrometer bestimmt. Die folgenden Absorptionsmaxima wurden festgestellt.
In der nachfolgenden Zusammenstellung bedeutet »st« starke, »m« mittlere und »schw«
schwache Absorptionsintensitäten.
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Wellenlänge in My (IO-4 cm) 3,05 st 8,I5 st 4,62 schw 8,67 st 5,98
st 9,36 st 6,I3 m IO,OO st 6,70 st 10,80 schw 7,I4 st II,IO schw 7,35 st II,8I m
7,60 schw I2,35 m Es wurde festgestellt, daß erfindungsgemäß hergestelltes Vitamin
B12 eine solche biologische Aktivität besitzt, daß O,OOOOI3y pro ccm Kulturmedium
genügt, um die Hälfte des Maximalwachstums von Lactobacillus lactis Dorner unter
gebräuchlichen Bedingungen hervorzurufen. Vitamin B12 besitzt einen hohen therapeutischen
Wert bei der Behandlung von perniciöser Anämie und anderen makrocytischen Anämien.
Die erforderlichen Dosierungen variieren je nach den individuellen Fällen und sind
abhängig von der Schwere und Dauer der pathologischen Bedingungen und der therapeutischen
Widerstandsfähigkeit des Patienten. Die therapeutisch wirksame Mindestdosis dürfte
bei intramuskularer Verabreichung in Form einer wäßrigen Salzlösung oder isotonischen
Lösung etwa 1 g pro Tag oder ein Vielfaches dieser Menge, z. B. etwa 7 e6g in der
Woche bei Verabreichung in größeren Zwischenräumen betragen.
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Veröffentlichungen über die Ergebnisse klinischer Prüfungen von Vitamin-Bl2-Therapien
bei der Behandlung makrocytischer Anämien sind mehrfach erfolgt. Es wird u. a. verwiesen
auf T. D. Spies, R. E. Stone, G. Carcia Lopez, F. Milanes, R. Lopez Toca und T.
Arambu, Folic Acid und Vitamin B12 in »Nutritional Macorcytic Anemia, Tropical Sprue,
and Pernicious Anemia«, Lancet, 2, 5I9 bis 522, October 2, I948; B. R. Hall und
D. C.
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Campbell, »Effect of Vitamin B12 On the Hematopoietic and Nervous
Systems in Addisonian Pernicious Anemia.« Journal of Laboratory and Clinical Medicine,
33, I646, December I948.
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Vitamin B12 ist auch befähigt, das Wachstum junger Hühner beträchtlich
zu fördern. Bei Vergleichsversuchen, bei denen der Grundnahrung, die gereinigtes
(sogenanntes vitaminfreies) Casein als Eiweißquelle enthielt, 30 Teile Vitamin B12
pro Billion zugesetzt wurden, zeigten die damit gefütterten Hühnchen nach I6 Tagen
ein Gewicht von I27 g, während die mit der gleichen, aber Vitamin-BI2-freien Nahrung
gefütterten Hühnchen im Durchschnitt nur ein Gewicht von 99 g hatten.
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Die Aktivität der in vorliegender Anmeldung erwähnten Produkte wurde
durch mikrobiologische Versuche unter Verwendung von Lactobacillus lactis Dorner
als Testmaterial ermittelt.
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Beispiel I 1 g eines Leberkonzentrats mit einer mikrobiologischen
Potenz von 5200 LLD-Einheiten/mg wurden in 10 ccm Wasser gelöst und in einer Kolonne,
die mit 10 g vorzugsweise sauer gewaschener Holzkohle
beschickt
war, chromatographisch behandelt. Die Kolonne wurde alsdann mit Wasser gründlich
gewaschen und das aktive Material mit 50 °/Oigem Äthanol extrahiert. Der Auszug
wurde in einer Reihe von Fraktionen von je IO ccm gesammelt. Die Fraktionen, welche
bei mikrobiologischen Prüfungen die höchste Potenz hatten, wurden vereinigt und
im Gefrierzustand getrocknet. Das getrocknete Material (Ir5mg) hatte eine mikrobiologische
Potenz von etwa IO OOO Einheiten/mg, entsprechend einer Ausbeute von etwa 60 O/o.
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Beispiel 2 I4,6 g eines Konzentrats mit 6000 LLD-Einheiten/mg Leberkonzentrat,
enthaltend insgesamt 87000000 LLD-Einheiten wurden dreimal etwa 30 Minuten lang
mit 200 ccm Methanol unter Umrühren extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden
durch eine Kolonne geleitet, die etwa 7,5 cm Durchmesser hatte und 600 g aktive
Tonerde enthielt. Nachdem der Rest der Lösung in die Tonerde eingedrungen war, wurde
Methanol zugefügt und zwecks chromatographischer Behandlung durch die Kolonne sickern
gelassen.
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Während dieser Operation bewegte sich ein rosafarbenes Band abwärts
durch die Kolonne, während die braungelbe Farbe der Ursprungslösung im wesentlichen
im Oberteil der Kolonne zurückblieb. Der Ausfluß wurde in einer Reihe von Fraktionen
gesammelt. Die Fraktionen, welche eine ausgeprägte Rosafärbung zeigten, wurden abgetrennt
und miteinander vereinigt. Die so erhaltene Lösung, welche gemäß mikrobiologischer
Prüfung etwa 65000000 LLD-Einheiten aufwies, wurde im Vakuum bei einer Temperatur
unter 250 zu einem dünnen Sirup eingedampft, der pE-Wert, der während des Eindampfens
die Neigung hat, anzusteigen, wurde durch Zufügung verdünnter Salzsäure (2,5 olo
N) auf etwa 6 bis 7 gehalten; Der Rückstand wurde bei geringem Druck (r mm Quecksilber)
bei Raumtemperatur getrocknet.
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Beispiel 3 245 mg des roten Rückstands aus der chromatographischen
Behandlung mit Tonerde, die nach Beispiel 2 erhalten wurde, wurde mit 15 ccm absolutem
Äthanol extrahiert, wobei 54 mg eines farblosen unlöslichen Rückstands und eine
rote Lösung erhalten wurden. Die rote Lösung lieferte 218 mg eines roten Öls, das
in 0,5 ccm Methanol gelöst wurde. Durch Zugabe von Aceton entstand ein roter Niederschlag,
während die Lösung eine Gelbfärbung annahm. Der Niederschlag (31 mg) hatte einen
Wert von I bis 7000000 LLD-Einheiten/mg und ein Absorptionsmaximum von 3600 Å, E:e,
= 26,9. Er wurde aus Wasser (0,75 ccm) durch Aceton (15 ccm) erneut niedergeschlagen.
Das erhaltene rote 01 (I2,8 mg) wurde nochmals aus einer Methanollösung mit Aceton
niedergeschlagen, wobei keine weiteren Gewichtsverluste auftraten. Das Produkt zeigte
ein Absorptionsmaximum bei 3611 Å, Elq,6" = 51,1. Etwa 12 mg dieses Materials wurden
in 0,7 ccm Wasser gelöst und Aceton (3 bis 4 ccm) bis zur Trübung zugefügt. Beim
Stehen über Nacht schieben sich dunkelrote nadelartige Kristalle ab. Nach 2 Tagen
wurde die Mutterlauge entfernt und die Kristalle mit Aceton gewaschen und getrocknet.
Die Ausbeute betrug 2 mg; weitere 1,4 mg von Kristallen wurden aus der Mutterlauge
gewonnen.
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Beispiel 4 6 mg des Vitamin-Bl2-Konzentrats, das nach Beispiel 3
erhalten wurde, mit einer Aktivität von etwa I bis 2 mal Io6 Einheiten/mg wurden
in einem Zehnplattengegenstromverteiler mit Wasser und einem Gemisch von 75 0/0igem
Toluol und 250/,igem ortho-Kresol fraktioniert. 2 ccm von jeder Phase wurden pro
Zentrifugierrohr verwendet und die unteren (wäßrigen) Phasen transferiert. Nach
Beendigung der Verteilung wurden die Produkte durch Zufügung von 8 ccm Chloroform
pro Zentrifugierrohr in die wäßrigen Phasen verdrängt. Die wäßrigen Phasen aus den
Zentrifugierrohren 2 bis 5 wurden miteinander vereinigt; mit Chloroform gewaschen
und der Gefriertrocknung unterworfen. Die Ausbeute betrug I,I mg von rotem amorphem
Vitamin-Bl2-Konzentrat von 7 X 106 Einheiten/mg mikrobiologischer LLD-Aktivität.
Durch Umkristallisieren in Wasser unter Zufügung von Aceton werden o,6 mg kristallines
Vitamin B12 erhalten.
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Beispiel 5 3,2 mg von einmal kristallisiertem Vitamin B12 aus Leber
wurden in Methanol gelöst, filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene gebracht.
Der Rückstand wurde in O,I5 ccm Wasser gelöst und etwa I ccm Aceton bis zur Trübung
zugefügt. Die Lösung wurde geimpft und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen.
Die hierbei gebildeten Kristalle wurden von der Mutterlauge getrennt, mit Aceton
gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute an umlcristallisiertem Vitamin B12 betrug
etwa 2 mg.
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Beispiel 6 Durch Züchten eines Stammes von Streptomyces griseus in
einem geeigneten Nährmedium, Gewinnung des aktiven Materials durch Adsorption aus
der Kulturbrühe, Extraktion des Adsorbats mit einer wäßrigen Lösung von Pyridin
oder eines alkylsubstituierten Pyndins wurde ein Rohkonzentrat gewonnen, das in
getrocknetem Zustand eine mikrobiologische Potenz von etwa I500 bis 2000 LLD-Einheiten/mg
aufwies.
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750 g des getrockneten Konzentrats wurden in 2,5 1 trockenen Methylalkohols
eingetragen, die Mischung etwa 30 Minuten lang gerührt und dann filtriert. Alsdann
wurden 2,5 1 trockenen Methylalkohols dem festen Rückstand zugesetzt und die Mischung
gerührt und filtriert. Dieses Verfahren wurde unter Anwendung von je 2,5 1 trockenen
Methylalkohols wiederholt. Die vereinigten Filtrate hatten eine mikrobiologische
Aktivität von etwa 1,2 Billionen LLD-Einheiten.
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Die vereinigten Filtrate wurden chromatographisch fraktioniert nach
der Adsorption mit Hilfe aktiver Tonerde, die mit Methylalkohol angefeuchtet war.
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Alsdann wurde Methylalkohol durch die Kolonne durchsickern gelassen
und eine Anzahl von Fraktionen
des Auszugs gewonnen. Diese Fraktionen,
welche eine ausreichende Aktivität (im allgemeinen wenigstens In 000 LLD-Einheiten/ccm
aufwiesen) wurden vereinigt und bei einer Temperatur unter ;,on bei vermindertem
Druck auf etwa ein Zehntel des Ursprungsvolumens konzentriert. Wenn sich hierbei
eine geringe Menge von weißem unlöslichem Material bildet, wird das konzentrierte
Gemisdt filtriert. Das Filtrat wird dann im Vakuum zu einem dicken Sirup eingeengt,
absoluter Äthylalkohol zugesetzt und der hierbei entstehende weiße Niederschlag
von der Lösung getrennt.
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Durch Zusatz von Aceton zu der klaren alkoholischen Lösung wird ein
roter flockiger Niederschlag erzeugt, der in etwa 2 ccm Wasser gelöst und durch
Zufügung von etwa 24 ccm Aceton in Form eines roten Öles ausgeschieden wird. Das
Öl wird abgetrennt, in etwa I ccm Wasser gelöst und die Lösung mit Aceton behandelt,
bis Trübung auftritt. Beim Stehen wird Vitamin B,2 in Form kleiner roter nadelförmiger
Kristalle ausgeschieden.
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Beispiel 7 Bei einer alternativen Arbeitsweise wird ein roter flockiger
Niederschlag, der durch Zugabe von Aceton zu der klaren roten äthylalkoholischen
Lösung entstanden ist, wie bei Beispiel 6 erhalten. Durch Waschen des Niederschlags
mit Aceton und Trocknen, wobei eine Substanz erhalten wird, die eine mikrobiologische
Potenz von etwa 4 Millionen LLD-Einheiten/mg aufweist. Eine zweite Ausbeute von
gleicher Potenz kann durch Zufügung von Aceton zu der Mutterlauge gewonnen werden.
Die weitere Zufügung von Aceton zu der Mutterlauge ergibt eine Ausscheidung eines
roten Öles. Durch Behandeln dieses Öls mit einer Mischung von Äthylalkohol und Aceton
wird ein amorpher roter fester Körper gewonnen, der eine mikrobiologische Potenz
von etwa I,5 Millionen LLD-Einheiten/mg besitzt.
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Die verschiedenen getrockneten, in Aceton unlöslichen Fraktionen
werden miteinander vereinigt und in etwa 4 ccm Methylalkohol gelöst. Die alkoholische
Lösung wird in einer Kolonne, die mit IO g mit Methylalkohol durchfeuchteter aktiver
Tonerde beschickt ist, adsorbiert. Die Kolonne wird alsdann mit Methylalkohol beschickt,
wobei ein dunkelrotes Band durch die Kolonne wandert. Sobald die rote Farbe in dem
Auszug in Erscheinung tritt, werden aufeinanderfolgend Io-ccm-Fraktionen abgenommen,
bis der Abfluß im wesentlichen farblos ist. Die ersten drei Fraktionen enthalten
den größeren Anteil des roten Farbstoffs; sie werden miteinander vereinigt und bei
einer Temperatur unter 250 und vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der
Trockenrückstand wird mit etwa 2 ccm Methylalkohol gelöst und die Lösung mit etwa
I6 ccm Aceton behandelt, wobei ein roter amorpher Niederschlag entsteht, der durch
Zentrifugieren abgetrennt werden kann. Dieser Niederschlag wird nochmals der gleichen
Behandlung mit Alkohol und Aceton unterworfen. Hierauf wird ein Teil des Materials
(5 mg von 2I,6 mg) in etwa 5 ccm Wasser gelöst und die Lösung mit etwa 5 ccm Aceton
behandelt.
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Beim Stehenlassen scheiden sich Klumpen von roten nadelförmigen Kristallen
von Vitamin Bu aus, die eine mikrobiologische Potenz von etwa II Millionen LLD-Einheiten/mg
aufweisen.
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Beispiel 8 Etwa I880 g eines getrockneten Konzentrats eines Streptomyces-griseus-Präparats
mit einer mikrobiologischen Potenz von etwa 2000 Einheiten/mg werden in etwa 16
1 trockenen Methylalkohols eingetragen, die Mischung etwa 30 Minuten gerührt und
filtriert.
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Das Filtrat wird in etwa 15 kg aktiver Tonerde, die mit Methylalkohol
durchfeuchtet ist, in einer chromatographischen Kolonne zur Aufsaugung gebracht,
die Kolonne alsdann mit Methylalkohol beschickt und eine Anzahl von Fraktionen des
Ausflusses aus dem Unterteil der Kolonne gewonnen. Die chromatographischen Fraktionen,
welche die ausgeprägteste mikrobiologische Aktivität aufweisen, werden zusammengegossen
und im Vakuum auf etwa ein Zehntel des Ursprungsvolumens eingeengt. Das Konzentrat
wird filtriert und das Filtrat im Vakuum zu einem dicken Sirup weiterkonzentriert.
Alsdann wird Alkohol zugegeben, wiederum filtriert und das Filtrat unter Rühren
mit so viel Aceton vermischt, daß ein vollständiger Niederschlag des darin vorhandenen
roten Materials stattfindet. Der rote Niederschlag wird gewonnen und wieder in IOO
ccm Methylalkohol gelöst.
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Diese Lösung wird langsam unter Rühren in etwa 1 1 Aceton einfließen
gelassen, wobei ein leichtroter flockiger Niederschlag gebildet wird, der abgetrennt,
gewaschen und getrocknet wird. Man erhält 7,8 g eines roten Pulvers mit einer mikrobiologischen
Potenz von etwa 65000 LLD-Einheiten/mg oder etwa o,6 0/o Vitamin B12.
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Bei diesem Beispiel ist der Vitamin-Bl2-Gehalt des bei der chromatographischen
Verfahrensstufe erhaltenen Produkts (o,6 0/o Vitamin B12) viel geringer als bei
den anderen Beispielen und sehr viel geringer, als es nötig wäre. Auch wenn sie
nicht unter Bedingungen verwirklicht wird, welche Produkte von maximaler Potenz
ergeben, werden Ausbeuten an Produkten erhalten, deren Potenz erheblich höher ist
als die der bisher bekannten Konzentrate für die Bekämpfung perniciöser Anämien.
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Das Beispiel soll lediglich die Tatsache veranschaulichen, daß die
Erfindung, auch wenn sie unter Bedingungen durchgeführt wird, bei denen Produkte
erhalten werden, die keine maximale Potenz besitzen, immerhin Konzentrate liefert,
die erheblich wirksamer sind als die bisher bekannten, zur Bekämpfung perniciöser
Anämien dienenden Konzentrate und welche gewünschtenfalls ohne weitere Konzentration
für klinische Zwecke Verwendung finden können.
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Beispiel 9 IO g eines Konzentrats der in Beispiel 8 beschriebenen
Art mit einer Durchschnittspotenz von 80 ovo LLD-Einheiten/mg werden in Methylalkohol
gelöst und die Lösung in etwa 500 g von mit Methylalkohol durchfeuchteter aktiver
Tonerde in einer chromatographischen Kolonne aufsaugen gelassen. Alsdann wird die
Kolonne durch Zufuhr von Methylalkohol in den Oberteil in Betrieb gesetzt und getrennte
Fraktionen des unten abfließenden Auszugs gewonnen. Diejenigen
Fraktionen,
die ausgesprochene mikrobiologische Aktivität haben, werden ausgewählt, zusammengebracht
und bei vermindertem Atmosphärendruck eingedampft. Der Rückstand wird mit absolutem
Äthylalkohol extrahiert und die weiße Substanz, die nicht in Lösung geht, abgetrennt.
Die rote äthylalkoholische Lösung wird mit einem Überschuß von Aceton versetzt,
wodurch ein unlösliches rotes Öl ausgeschieden wird. Dieses Öl wird abgetrennt und
in etwa IO ccm Wasser gelöst. Das aktive Material, das mit geringen inerten Begleitstoffen
versetzt ist, wird erneut durch Zugabe von überschüssigem Aceton als Ö1 niedergeschlagen.
Das hochaktive rote Material wird in etwa 3 ccm Wasser wieder aufgelöst und die
Lösung mit Aceton behandelt, bis eine schwache Trübung auftritt. Beim Stehenlassen
scheiden sich rote, nadelartige Kristalle von Vitamin B12 aus der Lösung aus.