CH413235A - Verfahren zur Kultivierung von menschlichen Erkältungsviren - Google Patents

Description

  



  Verfahren zur Kultivierung von menschlichen Erkältungsviren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von menschlichen Erkältungsviren, die   als Vaccine-Zwischenprodukte zur Präparation    von Vaccinen dienen können. Solche Vaccine eignen sich zur Erzeugung von Immunität gegenüber ge  wöhnlichen    und üblichen   unspezifischen Erkältungen.   



   Bisher war es nicht möglich, im praktischen Ausmass, den Virus der gewöhnlichen und üblichen unspezifischen   Erkältung    in vitro zu kultivieren.



   Es wurde nun gefunden,   adass    der  bliche und unspezifische Erkältungsvirus in vitro gezüchtet werden kann, falls gewisse Bedingungen angewendet werden, welche von denjenigen abweichen, die nor  malerweise    zur Kultivierung von Viren in lebenden Zellen Anwendung finden.



   Die Kultivierung des Virus der üblichen unsp, ezifischen   Erkältung    ist insbesondere deswegen wünschbar, weil sie die Basis für eine inokulierbare Vaccine bilden kann, welche dem geimpften Subjekt einen gewissen Grad von Immunität gegenüber der gewöhnlichen und   üblichen unspezifischen Erkältung    verleihen kann.



   Es hat sich erwiesen, dass das Wachstum des Virus der   unspezifischen fErkältung,    zumindest in dessen frühen Stadien, durch die Wahl bestimmter Temperaturen und   pH-Werte,    welche von den   übli-    cherweise zur Viruskultivierung verwendeten abweichen, bestimmt ist.



   Es ergab sich, dass der Virus der gewöhnlichen und üblichen unspezifischen   Erkältung,    welcher direkt vom Menschen erhalten wurde, in   Nierengewebe      oder-zellen    von Affen oder von menschlichen Embryos bei einer Temperatur inkubiert werden sollte, welche unter derjenigen liegt, die üblicherweise für analoge Zwecke in Betracht gezogen wird, und dass ausserdem in einem engeren pH-Bereich als normal gearbeitet werden sollte.



   Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Kultivierung von menschlichen   Erkäl-    tungsviren durch Inkubation in einem   Gewebe-Kul-      tursystem,    bastehend aus einem   Kultivierungsme-      dium,    das Zellen menschlichen oder   äffischen    Ursprungs enthält, die als   Wachstumsgrundlage    des oder der ausgewählten   Virusstämme    dienen, und ist dadurch gekennzeichnet, dass das Kultivierungsmedium auf einer Temperatur von 30 bis   36  C    und bei u. einem pH-Wert zwischen 6, 4 und 7, 4 gehalten wind.



   Mit Vorteil wird die Inkubation unter relativer Bewegung des Mediums und der darin enthaltenen Gewebe oder Zellen zueinander ausgeführt.



   Vorzugsweise erreicht man dies durch   Umwäl-    zen des Reaktionsgefässes, welches das Medium und die darin enthaltenen Gewebe oder Zellen in sich birgt.



   Der einzuhaltende pH-Bereich wird mit Vorteil zwischen 6, 4 und 7, 2 und insbesondere zwischen 6, 8 und   7,    2 gewählt.



   Als   Salzmedium    wird mit Vorteil ein   fin      wesent-    lichen   isotonisches      Salzmedium    verwendet. Es eignen sich z. B. Parkers Medium 199 oder Hanks Salzmedium, welche z. B. mit einem Anteil an enzymatischem Hydrolysat von Lactalbumin verstärkt sind.



   Auf alle Fälle sollte das verwendete Medium derart beschaffen sein, dass es das Wachstum lebender tierischer Zellen oder Gewebe in vitro unterstützt.



     Virushaltiges    Material kann vom Menschen direkt, z. B. durch Auswaschen der Nase oder durch Gurgeln, erhalten werden. Die Wasch-oder Gurgelflüssigkeiten können fnemde Mikroorganismen   ent-    halten, und es empfiehlt sich deswegen sehr,   dal3    das Kultivationsmedium mindestens ein Antibiotikum enthält, welches diese Organismen   abtötet.      Deswe-    gen werden vorzugsweise Medien verwendet, welche geeignete Anteile an   Penicillin    und Streptomycin, sowie ein geeignetes   pilztötendes    Agens wie Mycostatin enthalten.



   Das lebende Zell-oder Gewebematerial befindet sich vorzugsweise in der Form einer einschichtigen Lage von Zellen, die in einer Salzlösung wachsen.



  Es hat sich gezeigt, dass hinsichtlich wenigstens, des Grossteils der Virusstämme der gemeinen   Erkältung    die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn Zellen von den Nieren menschlicher   Embryos    verwendet werden, welch letztere bei der Hysterotomie von 3 bis 5 Monate   schwangeren    Frauen erhalten wurden. Gewisse Stämme der Viren der gewöhnlichen und üblichen unspezifischen   Erkältung    erwiesen sich unter den   obgenannten    Bedingungen als reproduzierbar, wenn Zellen-oder   Gewebematerial    von Affennieren z. B. von gewissen   Maoacusspecies,    wie   Rhesus    oder   Cynomolgusaffen    verwendet wurde.



   Es ist ausserordentlich wünschbar, an nach der vorliegenden Erfindung hergestellten   Viruspräpara-    tionen die relative Wirksamkeit ermitteln zu können, die sich unter varierten experimentellen Bedingungen bei der Herstellung ergibt. Wünschbar ist ferner der Basitz einer Testmethode, die als Kontrolle bei der Herstellung einer Vaccine oder eines Vaccine-Zwischenproduktas angewendet werden kann.



   Es hat sich nun gezeigt, dass   der cytopathische    Effekt, der von aktiven Viren der gemeinen   Erkäl-    tung nach Inkubation mit lebenden tierischen Zellen in einem geeigneten Medium ausgeübt wird, ein Mittel zur   Aktivitätsprüfung    einer gegebenen   Präpa-    ration darstellt. Wenn die Inkubation in   Uberein-    stimmung mit den Bedingungen gemäss vorliegender Erfindung durchgeführt wird, führt der cytopathische Effekt   infektiver    Viruspartikeln zur Bildung von Plaquen (auch Focalläsionen genannt), welche unter dem Mikroskop leicht beobachtet werden können.



  Nach einer   gewissen Inkubationspemode beginnen    die   Plaquen    in der Zellschicht als Resultat der Einwirkung individueller infektiver Viruspartikeln, mit denen die Kultur zuvor geimpft worden war, zu er  scheinen. Für Idie Zwecke    der vorliegenden   Beschrei-    bung werden diese Plaquen primäre Plaquen genannt. Während der Inkubation produzieren die Zellen ihrerseits weitere   Quantitiiten    an   Virusmaterial,    welches im Verlauf der Zeit sich durch die ganze   Zellschicht    ausbreitet und Anlass dazu gibt, dass sogenannte sekundäre Plaquen entstehen.

   Es ist zu bemerken, dass es lediglich die Zahl der primären Plaquen ist, welche den   Aktivitätsgrad    der ursprünglich verwendeten   Viruspräparation    richtig wiedergibt.



   Es ist venständlich, dass nicht alle   Virenstämme    der gewöhnlichen und üblichen unspezifischen Er  kältung    in den vorbeschriebenen Medien wachsen, jedoch kann leicht bestimmt werden, ob ein   besonde-    rer Stamm geeignet ist, indem man ihn in der nachbeschriebenen Weise prüft.



   Der Virus wird in der beschriebenen Weise inkubiert, und das Zellmaterial unter   idem    Mikroskop zu einer Zeit beobachtet, wenn eine wesentliche Anzahl primärer   Plaquen    gebildet wurde, jedoch vor der Bildung sekundärer Plaque. Die primären   Pla-    quen werden hierbei gezählt.



   Die geeignete Zeit zur Zählung der primären   Plaquen    kann nicht ohne weiteres zum voraus genau angegeben werden, da sie in jedem gegebenen Fall vom   verwendeten Zellenmaterial,    vom Virusstamm und vom Grad seiner Aktivität sowie von den Be  dingungen    der Kultivation abhängt. Die optimale Beobachtungszeit kann zwischen 2 und 12 Tagen (z. B. bei 5 bis 6 Tagen) nach Beginn der Inkubation liegen. Jedoch kann der Untersuchende mit einiger Erfahrung die günstige Zeit leicht einhalten.



  Zu jedem Zeitpunkt während der Dauer der Bildung primärer Plaquen kann deren Zahl im Vergleich mit der Zahl von PIaquen in einem   Kontrollexperi-    ment an einem Standardsatz von Viren als   angenä-    hertes Mass für die Aktivität der zu prüfenden   Prä-    paration relativ zur Aktivität des Standards dienen.



  Es ist klar, dass die Bestimmung dann am empfindlichsten ist, wenn eine Maximalzahl primärer   Pla-    quen gebildet wurde und bevor die Bildung von sekundären Plaquen eingesetzt hat.



   Das Verfahren der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich insbesondere von früheren bekannten Arbeitsweisen in der Wahl der einzuhaltenden Temperatur, bei welcher die Inkubation durchzuführen ist, wobei diese Temperatur merklich unter der normalerweise für Gewebekultivation verwendeten liegt und ferner in dem gleichzeitig einzuhaltenden pH Bereich.



   Das erfindungsgemässe Verfahren arbeitet vorzugsweise mit Medien, welche   Alkalimetallbikarbo-    nate, vorzugsweise   Natriumbikarbonat,    in 0,   001-bis    0, 01 molarer, vorzugsweise in 0,   0 () 2-bis    0, 005 molarer Konzentration enthalten. Es lassen sich indessen auch andere Substanzen zur   Einsbellung,    des gewünschten pH-Wertes im Medium verwenden, z. B. ein   Natriumphosphatpuffer,    welcher befähigt ist zur Einstellung eines pH-Wertes zwischen 7, 14 und 7, 69 bei   0,    05molarer Konzentration im Medium. Die bevorzugte Inkubationstemperatur liegt zwischen 31 und   35     C, z.

   B. zwischen 32 und   34  C.    Die besten Resultate werden erhalten bei ungefähr   33     C, d. h. im Bereich zwischen 32, 5 und 33,   5     C.



   Durch die vorgenannte   Kultivierungsweise    der Viren wird es möglich, ein wässriges Medium zu erhalten, welches die fraglichen Viren enthält, wobei die wässrige Lösung von festem Material, z. B. durch Zentrifugieren befreit werden kann, nachdem die Inkubation während 2 bis 14 Tagen und   vorzugs-    weise während 4 bis 12 Tagen ausgeführt worden war. Die geeignetste   Inkubationsdauer    liegt zwischen 6 und 9 Tagen.



   Falls das erfindungsgemäss hergestellte Produkt zur Präparation von Vaccinen gegen die   gewöhn-    liche und übliche   unspezifische Erkältung    Verwendung finden soll, kann es notwendig sein, das Antigen im Medium zu konzentrieren, was z. B. durch  Ultrazentrifugieren, Dialyse oder   Durchlaufentassen    durch eine   lonsnaustauscherkolonne    geschehen kann.



      Beispiel I   
Es wurde eine Suspension von Nierenzellen von Affen aus einer primären Kultur von Affen-Nieren  gewsbe    hergestellt. Diese Zellen wurden auf eine Konzentration von ungefähr 60 000/ml in einem Medium verdünnt, welch letzteres aus 5 %   Kälber-    serum, 0. 5   % Lactalbumin-hydrolysat    in   Hanks-Salz-    lösung, die 0, 035 %   Natriumbikarbonat,    100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 100   mcg    Streptomycin enthielt. 0, 5 ml Volumina dieser Suspension wurden in Walzenrohre eingefüllt, welche in   stillge-    legtem Zustand während 3 Tagen inkubiert wurden.



  Nach dieser Zeit wurde das Medium entfernt und ersetzt mit 1, 5 ml eines neuen Mediums, enthaltend   2'l,, Kälberserum,    0,   25 %    Lactalbumin und Natriumbikarbonat und Antibiotika, wie vorbeschrieben. Zu jeder Kulturlösung wurden 0, 2 ml einer Nasenwaschflüssigkeit zugefügt, welche einem Patienten oder Freiwilligen entnommen worden war, der zuvor mit HGP-Stämmen des Erkältungsvirus behandelt worden war. Die Kulturflüssigkeit wurde in die Walzentrommel eingefüllt und in einen Inkubator bei   33     C verbracht. Nach ungefähr 5 Tagen begann die Degeneration in der   Zellschicht.    Nach ungefähr 10 Tagen war die Degeneration gut ausgeprägt und das derart erhaltene Medium enthielt gro¯e Mengen an Virus.



   Beispiel 2
Das Verfahren des Beispiels 1 wurde   nachgearbei-    tet unter Verwendung eines Natriumphosphatpuffers mit einem pH-Bereich von 7, 2 bei einer molaren Endkonzentration von 0, 05.



   Im folgenden wird beschrieben, wie die Aktivi  tätsteste    durchgeführt werden können.



   Die Aktivität einer Präparation, enthaltend   HGP-Virus,    wird in einer   Gewebekultur    geprüft unter Verwendung sekundärer Kulturen von Rhesusnierenzellen. Zwischen 30 000 und 40 000 Zellen werden in stationären Rohren in 0, 5 ml Portionen eines Mediums inokuliert, welch letzteres aus 5 % igem Kälberserum und 0, 5 % eines   Laotalbumin-      hydrolysats    (LAH) in   Hanks-Salzlösung    besteht, wobei die letzteren 0, 03 % natriumbikarbonat, 100 Einheiten   Penicillin,    100   mcg    Streptomycin und 20 Einheiten   Mycostatin    pro Milliliter enthielt.

   Nach einer Periode stationärer Kultivation von 24 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von   36  C    wird das Kulturmedium entfernt und ersetzt durch 1, 5 ml eines Me  diums,    enthaltend 2 % Kälbe. rserum und 0, 25 % Lact  albuminhydrolysat    unter Einschluss der anderen Be  standteile,    die im : erst verwendeten Medium in den dort genannten Proportionen enthalten waren. Die   Kulturlösungen    werden hiernach mit einem Virusenthaltenden Material entweder sofort oder etwa im Verlauf eines Tages nach dem Wechsel der Medien inokuliert, worauf die inokulierten Kulturen bei 33  C in einer Walzentrommel unter den   Bedingun-    gen, die im Beispiel 1 genannt wurden, inkubiert werden.

   Die besten Resultate wurden erhalten mit Medien, welche einen mittleren pH-Wert im Bereich von 7, 0 bis 7, 4 aufwiesen. In einer Modifikation dieser Arbeitsweise kann der erforderliche pH-Wert unter Verwendung von einem Natriumphosphatpuffer des Bereichs 7, 14 bis 7, 69 bei einer   Endkonzen-    tration von 0, 05 Mol im Medium, anstelle von Natriumbikarbonat, erhalten werden. Nach der Inkubation wurden von Zeit zu Zeit   Testrohre      mikrosko-    pisch untersucht, um die Zahl der Plaquen   festzu-    stellen, welche sich in   ! der Zellschicht    gebildet hatten.



  Bei diesen Experimenten zeigte sich, dass bis ungefähr zu 3 Tagen der Inokulation die Zahl der   Pla-    quen direkt proportional der   Virenkonzentration in    der untersuchten Präparation war. Beim Zählen der   Plaquen    ist   es selb ; stverständlich erforderlich,, eine    minimale Zellenzahl einer   Fokalläsion    zuzuordhen, die als eine Plaque zu zählen ist. So mag z.

   B. angenommen werden, dass ein Fokus mindestens 10 Zellen enthalten mu¯, um als eine Plaque registriert zu werden und es ist selbstverständlich notwendig, das  selbe Zählsystem    sowohl bei den zu prüfenden   Prä-      parationen    als auch beim Standard-Satz von Viren für die Zwecke des Vergleichs in ein und dens ! elben Weise anzuwenden. Proben, die eine ungewöhnlich hohe Anzahl an   Plaquen    aufweisen, z. B. 15 oder 17, können nach   Übereinkunft    bei der Auswertung der Resultate verworfen werden. Nach 3 Tagen ergibt sich, dass die Zahl der   Plaquen    ansteigt und es kann angenommen werden, dass die letzteren   Plaquen    sekundärer Art sind.



   Bei der Anwendung des vorbeschriebenen Pr fverfahrens auf HGP-Viren in   Kulturlösungen    von   Affennierenzellen    hat sich gezeigt, dass von den vorbeschriebenen Bedingungen zur Züchtung der Viren der pH-Wert wichtiger ist als die Ionenart, die zur Einstellung des geeigneten pH-Wertes verwendet wird. Es ist bemerkenswert, dass das Bikarbonation kein wesentlicher   B, estandteil    des erfindungsgemässen Verfahrens oder der vorbeschriebenen Priifmethode ist, und da¯ geeignete Puffer, z.   B.,    Phosphatpuffer der obengenannten Art, ebensogut Verwendung finden können.



   Es hat sich ferner gezeigt, dass, wenn   HGP-Virus    vor ! der Inokulation in das Kulturmedium mit einem spezifischen   Hyperimmun-Antiserum    gemischt wird, welches in Kaninchen erzeugt wurde, die   Plaqwen-    Zahl sich vermindert. Deswegen kann die vorbe  schriebene    Testmethode nicht allein zur Kontrolle bei der Herstellung von Vaccinen verwendet werden, sondern ebenso auch in Verbindung mit einem spezifischen Immunserum für die Identifizierung und die Prüfung der Virenstämme, welche der Vaccine einverleibt wurden. Die Methode kann weiterhin dazu verwendet werden, das Ansprechen von Antikörpern auf experimetell erzeugte oder zu prüfende Vaccine, welche Tieren oder Menschen verabreicht werden, abzuschätzen.



   Als Alternative zur Verwendung von Affen gekennzeichnet, dass die Inkubation bei einer Temperatur zwischen 31 und 35 C, vorzugsweise zwischen   32,    5 und 33,   5     C durchgeführt wird.

Claims (1)

1. 4. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium ein Alkalimetallbikarbonat z. B. Natriumbikarbonat in 0, 001- bis 0, 005molarer, vorzugsweise in 0, 002- bis 0, 005molarer Konzentration enthält.

   5. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium mindestens ein Antibiotikum enthält.

   6. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium ein Antifungi-Agens enthält.

   7. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Gewebe oder Zellmaterial in einer einschichtigen Lage von wachsenden Zellen im Medium befindet.

   8. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium einen Natriumphosphatpuffer enthält, der bei 0, 05molarer Kon zentration einen pH-Wert zwischen 7, 14 und 7, 69 aufweist.

   PATENTANSPRUCH II Verwendung des nach Patentanspruch I hergestellten Kultivierungsproduktes zur Aktivitätsprüfung von Virenpräparationen.

   Nierenzellen können bei der vorbeschriebenen Prüf- methode menschliche Amnion-und menschliche Nierenzellen ebenfalls verwendet werden. Jedoch ist hierbei die Zahlung der gebildeten Plaquen schwieriger. Die vorbeschriebene Testmethode und das er findungsgemässe Herstellungsverfahren ist. anwendbar auf PK-und andere Stämme von Viren ebensogut wie auch den HGP-Stamm.

   PATENTANS, PRUCH I Verfahren zur Kultivierung von menschlichen Erkältungsviren durch Inkubation in einem Gewebe Kultursystem, bestehend aus einem Kultivierungs- medium, das Zellen menschlichen oder äffischen Ursprungs enthält, die als Wachstumsgrundlage des oder der ausgewählten Virusstämme dienen, dadurch gekennzeichnet, dass das Kultivierungsmadmm auf einer Temperatur von 30 bis 36 C und bei einem pH-Wert zwischen 6, 4 und 7, 4 gehalten wird.

   UNTERANSPRUCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäss mit dem darin befindlichen Medium während der Inkubation umgewälzt wird.

   2. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation bei einem m pH-Wert zwischen 6, 4 und 7, 2, vorzugsweise zwischen 6, 8 und 7, 2 durchgeführt wird.

   3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch