Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotiea Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der neuen Antibiotica Verrucarin H und Verrucarin I, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Stämme der Pilzspecies Myrothecium verrucaria (Albertini et Schweinitz)
Ditmar ex Fries in einer saprophytisehen Kultur züchtet und hierauf Verrucarin H und Verrucarin I aus der Nährlösung isoliert.
Kolonien des Pilzes Myrothecium verrucaria wur den aus Bodenproben verschiedenster Herkunft iso liert. Morphologisch entsprechen alle diese Stämme den Umschreibungen der Species, wie sie beispiels weise in Gihnan, J.
C. 1957, A Manual of Soil Fungi, 2nd. ed., The Iowa State College Press, Ames. Iowa, USA, gegeben worden sind. Die einzelnen Isolationen, zum Teil aus den gleichen Bodenproben erhalten, kön nen sich sowohl morphologisch, z. B. durch grössere oder geringere Sporulationswilligkeit, als auch physio logisch, z.
B. in den Ansprüchen an das Nährmedium zur Produktion der Antibiotica, unterscheiden. Kul turen des lebenden Mikroorganismus Myrothecium verrucaria (Albertini et Schweinitz) Ditmar ex Fries, isoliert aus einer Bodenprobe von Bingerville, Afrika,
und aus einer Bodenprobe von Ceylon wurden bei der Fermentation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, deponiert und in die permanente Sammlung unter der Be zeichnung NRRL 3003 und NRRL 3019 eingereiht.
Für die Herstellung der neuen antibiotisch wirk samen Verbindungen lassen sich auch Stämme ver wenden, wie sie z. B. durch Selektion oder Mutation unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgen strahlen oder durch Anwendung anderer Massnahmen, z. B.
durch Behandlung von Laboratoriumskulturen mit geeigneten Chemikalien, leicht gewonnen werden können. Die Züchtung erfolgt beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder aber submers unter Schütteln oder in Fermentern mit Begasung durch Luft oder Sauerstoff unter Rühren. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 33 C.
Stämme von Myrothecium verrucaria lassen sich auf vielerlei Nährböden, die die üblichen Nähr stoffe enthalten, züchten. So verwenden solche Stämme die für Kohlenstoffheterotrophe Organismen üblicherweise benutzten Nährstoffe, beispielsweise Glucose, Stärke, Dextrin, Lactose, Rohrzucker usw.
als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton, Hefe- oder Fleischextrakte, Ammoniumsulfat, Ammonium nitrat, Aminosäuren usw. als Stickstoffquelle, sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenelemente.
Es wurde nun gefunden, dass sich aus Kultur lösungen einer Reihe von. Stämmen von Myrothecium verrucaria die neuen antibiotisch wirksamen Ver bindungen Verrucarin H und Verrucarin I in reiner und kristallisierter Form isolieren lassen.
Eine Durchführungsform der Erfindung zur Her stellung der neuen Antibiotica Verrucarin H und I besteht darin, dass ein flüssiges Nährmedium, welches die üblichen Nährstoffe enthält, mit einer Konidien- suspension eines Stammes von Myrothecium verrucaria beimpft und bei einer Temperatur von 21 bis 33 C während 3 bis 30 Tagen in. 500-ml-Erlenmeyerkolben auf einer Schüttelmaschine inkubiert wird.
Hierauf wird eine Anzahl solcher Kulturen zur Beimpfung von Fermentationsbehältern verwendet und die eigent liche Produktionszüchtung vorgenommen. Hierbei wird während 48 bis 72 Stunden bei einer Temperatur von 27 C unter Rühren und Begasen mit Luft oder Sauerstoff inkubiert. Die gewünschten Antibiotica können aus der Fermentationsflüssigkeit durch verschiedene Metho den isoliert werden.
Die Methode, die sieh als vor zugsweise geeignet erwiesen hat, ist die Extraktion mit Benzin und Essigester, jedoch können auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B. Benzol, Butyl- acetat, Chloroform, Butanol, verwendet werden.
An schliessend werden die Extrakte vom Lösungsmittel getrennt und der Rückstand zur Isolation des ge wünschten Antibioticums auf chromatographischem Wege, durch absorbierende Mittel, wie aktivierte Tonerde, Silikagel, Magnesiumsilicat und dergleichen oder mittels Gegestromverteilung gereinigt.
Die isolierten Substanzen können wie folgt chaxak- tersiert werden.: Das Antibioticum Verrucarin H bildet nach Um kristallisieren aus Benzol-Petroläther farblose Nadeln, und aus Dichlormethan-Äthanol farblose, rechteckige Platten, die nicht unterhalb 300 C schmelzen. Bei 240 C beginnen sich die Kristalle gelb und braun zu färben,
da Zersetzung eintritt. Sie sind unlöslich in Wasser, Diäthyläther, Dilsopropyläther und in flüssigen gesättigten Kohlenwasserstoffen (Pentan Hexan, Heptan, Cyclohexan), hingegen löslich in niederen Ketonen (Aceton, Methyläthylketon), nie deren Alkoholen (Methanol, Äthanol,
Propanol), in Dioxan, in niederen halogenierten Kohlenwasser- stoffen (Dichlormethan, Chloroform, Tetxachlorkoh- lenstoff), in Pyridin, Diäthylacetamid, Benzol und in Toluol. Die spezifischen Drehungswerte sind:
[a]D = +32 2 (Chloroform); [a112 = +59 2 (Benzol); [all' = +43 2 (Dioxan). Die Elementaranalysen haben folgende Werte ergeben: C: 67,88; 67,22; 67,62 %; H: 7,09; 6,99; 7,17 %; O: 24,64 %;
Das Antibioticum enthält weder N noch S noch Halogen. Die thermoelektrische Mikrobestimmung hat ein, Molekulargewicht von 490 (in. Dichlormethan) ergeben. Auf Grund dieser Befunde ist die Brutto formel C29H3e_3s0s (512,58-514,59) am wahrschein lichsten.
Das UV-Absorptionsspektrum (Fig. 1 der Zeichnung) in Äthanol setzt Maxima bei 195 mu (log a = 4,20); 223 mu (log a = 4,35) und 259 m,u (log a = 4,22) (ber. auf MG = 512).
Das IR Spektrum (Fig. 2 der Zeichnung) einer Lösung des Antibioticums in Dichlormethan zeigt Banden bei (wichtigste unterstrichen): 3,45;<U>5,85</U>; <U>6,07; 6,25</U>; 7,27; 7,40; 8,21; 8,52; 8,96; 9,08; 9,68; l0,10; 10,38; 12,10,u.
In festem Zustand (gepresst in KBr) sind. Banden erkennbar bei 2,92; 3,42; 5,85; 6,05; 6,24; 6,95; 7,28; 7,40; 8,20; 8,48; 8,71; 8,96; 9,08; 9,22; 9,70; 9,97; 10,34; 11,48; 12,01,u.
Verrucarin H besitzt keine Methoxylgruppen (Zeisel) und keinen aktiven Wasserstoff (Zerewitinoff), enthält 9,8 % C-Methyl (Kuhn-Roth), nimmt bei der Mikrohydrierung 4 bis 5 Mol H2 auf, liefert mit Tetranitxomethan in Chloroform keine Gelbfärbung, entfärbt Lösungen von Kaliumpermanganat in Aceton und Brom in Chloroform sofort.
Die Reaktionen nach Tollens, Fehling, Molisch, Legal, Zimmermann und Liebermann fallen negativ aus. Bei der alkalischen Hydrolyse liefert Verrucarin H das Verrucarol.
Die Rf-Werte in der Dünnschichtehromatographie (Flecke mit Jod sichtbar gemacht) sind: 0,83 (Fliessmittel: Chloroform-Methanol-:[98:2]; Träger: Aluminiumoxyd).
0,69 (Fliessmittel: Chloroform-Methanol-[97:3]; Träger: Silicagel).
0,47 (Fliessmittel: Chloroform-Methanol-[98:2]; Träger: Silicagel). Verrucarin H stellt demnach einen lipoidlösli- chen Neutralstoff dar, der chemisch mit Vermcarin A verwandt ist.
Das Antibioticum Verrucarin I gibt nach Um- kristallisieren aus Gemischen von Chloroform-Äther oder Aceton-Äther farblose Kristalle, die nicht unterhalb 320 schmelzen. Bei 270 beginnen die Kristalle zu sintern und werden ab 305 gelb.
Ver- rucarin I ist unlöslich in Wasser, Diäthyläther, Di- isopropyläther und in gesättigten Kohlenwasserstoffen (Pentan, Hexan, Heptan, Cyclohexan), hingegen lös lich in niederen Ketonen, niederen Alkoholen, Di oxan,
niederen halogenierten Kohlenwasserstoffen, Pyridin, Diäthylacetamid.
Die spezifische Drehung beträgt: [a] D = 18' (c = 1,23 in Chloroform).
Die Elementaranalysen haben folgende Werte ergeben: C: 66,4;<B>65,7%;</B> H: 6,7; 6,8 %. Verrucarin I enthält weder Stickstoff noch Schwe fel noch Halogene.
Das UV Absorptionsspektrum (Fig. 3 der Zeich nung) in Äthanol zeigt Maxima bei 219 mu (E i @m gleich 545) und 261,5 mg (Ei @m = 404) (Fig. 3 der Zeichnung).
Das IR-Absorptionsspektrum (Fig. 4 der Zeich- nung) einer Lösung von Verrucarin I in Methylen- chlorid zeigt Banden bei: 3,39; 5,83; (Schulter), 5,87; 6,08; 6,29; 6,99; 7,09; 7,25; 7,38; 8,16; 8,30; 8,44; 8,70; 9,22; 9,57; 9,66; 10,0; 10,3; 10,8; 11,4; 11,5; 12,2,u.
Die Reaktionen nachRTI ID="0002.0230" WI="12" HE="4" LX="1525" LY="2066"> Tollens, Fehling, Moliseh, Legal, Zimmermann und Liebermann geben keine positive Reaktion. Dagegen entfärbt die Substanz Lösungen von Brom in Chloroform bzw. Kalium permanganat in Aceton sofort.
Die Rf-Werte in der Dünnschichtchromatographie (Flecke zeit Jod sichtbar gemacht) sind: 0,83 -(Fliessmittel: Chloroform-Methanol-[98:2]; Träger: Aluminiumoxyd).
0,69 (Fliessmittel: Chloroform - Methanol -<B>[97:</B> 3]; Träger: Silicagel).
0,47 (Fliessmittel: Chloroform-Methanol-[98:2]; Träger: Silicagel).
Die Verrucarin H und I zeigen in vitro eine ausge prägte antifungische Wirkung (s. Tabelle).
EMI0003.0001
Verrucarin <SEP> H <SEP> Verrucarin <SEP> I
<tb> Testorganismus
<tb> Art, <SEP> Stamm <SEP> Platten-Test <SEP> Verdünnungs-Test <SEP> Testmethode
<tb> t. <SEP> p.
<tb> Blas,tomyces <SEP> brasiliensis.
<SEP> Zürich <SEP> 14 <SEP> 18 <SEP> * <SEP> 5,0 <SEP> B
<tb> Botrytis <SEP> alii <SEP> ETH-M <SEP> 5016 <SEP> 11 <SEP> 22 <SEP> * <SEP> * <SEP> B
<tb> Botrytis <SEP> cinerea <SEP> ETH@M <SEP> 4291 <SEP> 13 <SEP> 22 <SEP> 'r <SEP> * <SEP> B
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> ETH <SEP> 5897 <SEP> 7 <SEP> 11 <SEP> * <SEP> * <SEP> A
<tb> Candida <SEP> krusei <SEP> London <SEP> Z <SEP> 70 <SEP> 11 <SEP> 19 <SEP> 4,5 <SEP> 6,0 <SEP> A
<tb> Candiida <SEP> tropicällis. <SEP> Zürich <SEP> 169 <SEP> 7 <SEP> 23 <SEP> A
<tb> Candvda <SEP> tropicals.
<SEP> S <SEP> 1063
<tb> (Thailandla <SEP> candhda) <SEP> 0 <SEP> 13 <SEP> 4,5 <SEP> - <SEP> A
<tb> Cryptococcus <SEP> neofornnans <SEP> Zürich <SEP> 13 <SEP> 28 <SEP> 5,0 <SEP> 5,5 <SEP> D
<tb> Endoma <SEP> parashica <SEP> ETH-M <SEP> 162 <SEP> 10 <SEP> 24 <SEP> * <SEP> 5,0 <SEP> C
<tb> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> S <SEP> 1345 <SEP> 17 <SEP> 21 <SEP> - <SEP> - <SEP> A
<tb> Sacchromyces <SEP> cerevisiae <SEP> ETH-M <SEP> 108 <SEP> - <SEP> - <SEP> 5,0 <SEP> 6,5 <SEP> A
<tb> Sporotrichum <SEP> schenckü <SEP> London <SEP> S <SEP> 432 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> * <SEP> * <SEP> B
<tb> keine <SEP> Hemmwirkung <SEP> bis <SEP> 10-45
<tb> Stämme:
<SEP> Zürich <SEP> = <SEP> Dermatologische <SEP> Universitätsklinik, <SEP> Zürich
<tb> London <SEP> = <SEP> Institute <SEP> of <SEP> tropical <SEP> Medicine, <SEP> London <I>Platten-Test:</I> Auf etwa 3,5 mm dicke, sterile Unterschichten in. Petrischalen (2% Malzextrakt Schweiz Fer ment AG, 0,75 % Ion Agar Nr.
2, Oxoid Co., ent- mineralisiertes Wasser) wurden 1 mm dicke Ober schichten, die im gleichen Medium Keime der Test organismen (Sprosszellen [bud cells] oder Konidien) in geeigneter Dichte (Konzentration) gleichmässig ver teilt enthielten. Als Mass für die Hemmwirkung diente der Durchmesser von Hemmzonen um Filterpapier rondellen von 6 mm Durchmesser, die in Lösungen der Verrucarine 1 :
1000 in Chloroform getränkt wor den waren, nach geeigneter Inkubation der Test platten. Es sind Hemmhofdurchmesser in Milli metern als Mittelwerte von mehreren Ablesungen angegeben. Verdünnungs-Test: Die Antibiotica wurden in N,N-Diäthylacetamid 1 : 100 gelöst und mit entmineralisiertem Wasser zum Zehnfachen der zu prüfenden Endkonzentration ver dünnt.
Die Testorganismen, geimpft als Keimsuspen sionen wie beim Plattentest, wuchsen in 2 % iger Malz brühe (Medium wie beim Plattentest, ohne Agar). Wachstum, partielle oder totale Hemmung wurden re lativ zur Lösungsmittelkontrolle bewertet. Angegeben ist die niedrigste noch hemmende Konzentration als negativer dekadischer Logarithmus. t. = totale, p. = partielle, aber deutliche Hemmung.
Die Prü fung erfolgte in halben Zehnerpotenzen.
EMI0003.0040
<I>Testmethoden:</I>
<tb> A <SEP> = <SEP> Inkubationstempwtatur <SEP> 37 C, <SEP> Ablesung <SEP> nach <SEP> etwa <SEP> 20 <SEP> Stunden
<tb> B <SEP> = <SEP> <SEP> 27 C, <SEP> <SEP> Plattentest <SEP> nach <SEP> etwa <SEP> 72 <SEP> Stunden
<tb> Verdünnungstest <SEP> nach <SEP> etwa <SEP> 48 <SEP> Stunden
<tb> C <SEP> = <SEP> <SEP> 27 <SEP> C, <SEP> <SEP> P1attentest <SEP> nach <SEP> etwa <SEP> 96 <SEP> Stunden
<tb> Verdünnungstest <SEP> nach <SEP> ;etwa <SEP> 48 <SEP> Stunden
<tb> D <SEP> = <SEP> <SEP> 27 C, <SEP> <SEP> nach <SEP> etwa <SEP> 48 <SEP> Stunden.
Die Wirksamkeit von Verrucarin H und Verru- carin I gegen tierische Tumore wurde durch die Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen in vitro (Zellen des Mäuse-Mastocytoms P 815) bestimmt:
In geeigneter Nährlösung vermehren sich diese Tumorzellen innert 40 Stunden auf das 4- bis 5fache der Ausgangszellzahl. Die DE-50 (Konzentration, welche diese Vermehrung um<B>50%</B> hemmt) von Verrucarin H gegenüber diesen Zellen ist 0,0010,ug/ml, die von Verrucarin I 0,
0012 Mg/ml. Die Wirkung auf Kulturen von embryonalen Fibro- blasten vom Huhn. ergab bei Vgrrucarin H und I einen totalen Mitosestop bis zur Konzentration von 0,01 yg/ml. Bei 0,003 yg/ml ist noch. eine angedeu tete Wirkung festzustellen.
Die akute Toxizität von Verrucarin H bei der weissen Maus beträgt DL-50 3 mg/kg i. v. bzw. von Verrucarin I<B>DL-50</B> mg/kg i. v.
Verrucarin H und I können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbin dungen nicht reagieren, wie z.
B. Gelatine, Milch zucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkdhole, Gummi arabicum, Polyalkylen- glykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Drage6s, Pulver, Cremes, Suppositoren oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenen falls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch an dere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Bei spielen beschrieben, ohne dass damit eine Einschrän- kung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in. Celsiusgraden angegeben.
Die Verhältniszahlen bei Lösungsmitteln beziehen sich immer auf Volumina. <I>Beispiel 1</I> Verrucarin H 500 ml-Erlenmeyer-Kolben zu je 100 ml. Nähr- lösung (pro Liter entmineralisiertes Wasser enthal- tend:
EMI0004.0072
primäres <SEP> Kaliumphosphat <SEP> pro <SEP> analysi <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> x <SEP> 7H20 <SEP> pro <SEP> analysi <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Malzextrakt <SEP> Schweiz. <SEP> Ferment <SEP> AG <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Bacto <SEP> Yeast <SEP> Extract <SEP> Difco <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Pepton <SEP> Cudahay <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> purum <SEP> 20,0 <SEP> g) werden nach Sterilisation bei 120 ,
20 Minuten und 1 atü mit einer Konidiensuspension von Myrothecium verrucaria NRRL 3019 beimpft und 6 Tage bei 27 auf einer reziprok arbeitenden Schüttelmaschine inkubiert.
Eine gut gewachsene Schüttelkultur wird zur Be- impfung eines 10-Liter-Fermenters (System Ultramix, Typ FU 001, Hoh. Bertrams AG, Basel), welcher 10 Liter des oben beschriebenen Mediums und Zu sätze von 3,0 g Natriumnitrat p. a/Liter und 10 ml Antifoam Silicone (Dow Corning Emulsion A) ent- hält, verwendet.
Die Sterilisation des Mediums er folgte unter gleichen Bedingungen wie oben. Die Kultur wird bei 1450 Umdrehungen pro Minute, einem Überdruck von 0,4 atü und unter Belüftung mit 10 1 Luft pro Minute bei 27 71 Stunden be brütet.
5 Liter dieses Ansatzes werden zur Beimpfung eines 50-Liter-Fermenters (System Ultramix, Typ FU 005, Hch. Bertrams AG, Basel), welcher 50 Liter Medium der gleichen Zusammensetzung wie beim 10-Liter-Fermenter, jedoch mit 50 ml Anti- foam Silicone, enthält, verwendet.
Man inkubiert bei 1400 Umdrehungen pro Minute, 0,4 atü und 50 1 Luft pro Minute bei 27 während 49 Stunden. Die sehr dickflüssige, leicht rötliche Brühe aus Mycel und Kulturlösung wird bei 4 abgekühlt.
Hierauf werden 50 Liter Fermentationsbrühe mit 3 X 15 Liter Benzin (Siedepunkt 65-80 ) und dann mit 3 X 15 Liter Essigester extrahiert. Die Aus züge werden je einmal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfonat getrocknet und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand aus der Benzin extraktion ergibt zwei Phasen, wovon die dünn flüssige abgetrennt wird.
12 g des. dickflüssigen Benzinextrakts werden an 600 g Silicagel chromatographiert. Zur Elution jeder Fraktion dienen je 1 Liter Lösungsmittel. Die Frak tionen 1-18 (eluiert mit Benzol) Methylenchlorid und Methylenchlorid-Methanol <B>(99:</B> 1) liefern 5,0 g Öl (verworfen).
Die Fraktionen 19-24 (eluiert mit Methylen chlorid-Methanol [99 : 1]) ergeben 5,61g Eindampf rückstand, der nach Versetzen mit Äther 766 mg rohes krist. Verrucarin A, das noch Verrucarin H enthält, liefert. Die Fraktionen 25-33 (eluiert mit Methylen- ohlorid-Methanol [98:2]) ergeben 1,9 g Öl (ver worfen).
Der Rückstand aus der Essigester-Extraktion er gibt ebenfalls zwei Phasen, wovon wiederum die leichtflüssige abgetrennt wird.
20,25 g des dickflüssigen Teiles des Essigextrak tes werden an 1 kg Silicagel chromatographiert. Zur Elution jeder Fraktion dienen je 1 Liter Lösungs mittel.
Die Fraktionen 1-11 (eluiert mit Benzol, Me- thylenchlorid und Methylenohlorid-Methanol <B>[99:</B> 1]) liefern 6,0 g Öl (verworfen).
Die Fraktionen 12-18 (eluiert mit Methylen- chlorid-Methanol <B>[99:</B> 1 und 98 : 2]) ergeben 466 mg amorphes Material (nicht untersucht).
Die Fraktionen 19-22 (eluiert mit Methylen- chlorid-Methanol <B>[98:</B> 2]) liefern 6,52g Eindampf rückstand, der aus Methylendhlorid-Methanol 1,78 g krist. Verrucarin H ergibt.
Die Fraktionen 23-41 (eluiert mit Methylen- chlorid-Methanol [98:2]) ergeben 4,0 g Öl (ver worfen). <I>Beispiel 2</I> Verrucarin I Mit einer Konidiensuspension von Myrothecium verrucaria NRRL 3003, isoliert aus einer Bodenprobe von Bingerville, Afrika,
werden 8 Penicillinflaschen mit je 250 ml Nährlösung (pro Liter entmineralisier- tes Wasser enthaltend,
EMI0005.0014
Malzextrakt <SEP> Schweiz.
<SEP> Ferment <SEP> AG <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb> Yeast <SEP> Extract <SEP> Difco <SEP> Bacto <SEP> 4,0 <SEP> g
<tb> Agar-Agar <SEP> 30,0 <SEP> g) nach Sterilisation bei 120 , 20 Minuten und 1 atü, beimpft und die Kolben während 10 Tagen bis zur guten Sporuherung bei 27 bebrütet. Man suspen diert die Konidien in 1600 ml entmineralisiertem Wasser und beimpft mit der Aufschwemmung einen Fermenter zu 1500 Liter Nährlösung (pro Liter ent- mineralisiertes
Wasser enthaltend,
EMI0005.0029
Ammoniumohlorid <SEP> purem <SEP> 3,0 <SEP> g
<tb> primäres <SEP> Kaliumphosphat <SEP> purem <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> x <SEP> 7H20 <SEP> purem <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Malzextrakt <SEP> Schweiz. <SEP> Ferment <SEP> AG <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Pepton <SEP> Cudahay <SEP> 2,0 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> purem <SEP> 20,0 <SEP> g) nach Sterilisation bei 120 , 20 Minuten, 1 atü.
Im mit zwei 8blättrigen Turbinenrührern (turbin mixer impeller) versehenen Gärtank wird mit 75 Um drehungen pro Minute gerührt, mit 1500 1 Luft pro Minute bei 0,5 atü belüftet und bei 27 während 45 Stunden bebrütet. Infolge starker Schaumbildung müssen von der Sterilisation 7,
5 Liter und während der Gärung jede Stunde weitere 270 ml Antifoam Silicone (Dow Comng Emulsion B), total 19,0 Liter Schaumbekämpfungsmittel, zugesetzt werden.
Die sehr viskose, leicht graue Brühe aus Kulturlösung und Mycel wird auf 12 abgekühlt. Hierauf wird das Mycel durch Zentrifugation vom Kulturfiltrat abge- trennt. Die klare Kulturflüssigkeit wird zweimal mit je 750 Liter Essigester extrahiert. Die Auszüge wer den einmal mit 300 Liter Wasser gewaschen und im Vakuum vollständig vom Lösungsmittel befreit.
Der Rückstand wird im Gegenstrom zwischen dreimal je 10 Liter Petroläther und dreimal je 3,5 Liter 90 % ig wässeriges Methanol verteilt. Die wässerig- methanolischen Phasen werden im Vakuum stark eingeengt und dann dreimal mit je 3 Liter Chloro form extrahiert. Die Chloroform-Auszüge werden der Reihe nach gewaschen mit 1 Liter Wasser, drei mal je 1 Liter 5 % wässerige Natriumbicarbonat Lösung, 1 Liter Wasser; über Natriumsulfat getrock net und am Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird einer lOstufigen Gegen stromverteilung im System 70 % wässeriges Methanol- Tetradhlorkohlenstoff (1 : 1) nach Craig unterworfen.
Aus den Fraktionen 5-8 erhält man 6 g rohes, kristallines Verrucarin A und das aus den Fraktionen 9-10 7,5 g rohes kristallines Verrucarin I.
Die Filtration von 1,0 g rohem Verrucarin I durch 50 g Silicagel (Merck, 0,2-0,5 mm) mit Hilfe von Methylenchlorid, ergibt nach Kristallisation aus Chloroform-Äther 700 mg reines Verrucarin I.