Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotieums Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur H; rstellung des neuen Antibioticums Verrucarin K, da durch gzke.nnzeichnet,dass man Stämme der Pilzspecies Myrothecium verrucaria (Albertini et Schweinitz)
Dit mar ex Fries oder ihre Mutanten in einer Nährlösung züchtet und hierauf das Antibioticum Verrucarin K aus der Nährlösung isoliert. Die Isolierung erfolgt beispiels weise durch Extraktion aus der Nährlösung und an- schliessende Reinigung durch chromatographische Ab sorption oder Gegenstromverteilung. Kolonien des Pil zes Myrothecium verrucaria wurden aus Bodenproben verschiedenster Herkunft isoliert.
Morphologisch ent sprechen alle diese Stämme den Umschreibungen der Species, wie sie beispielsweise in Gilman, J. C. 1957, A Manual of Soil Fungi, 2nd, edl, The Iowa State College Press, Ames. Iowa, U. S. A., gegeben worden sind. Die einzelnen Isolationen, zum Teil aus den gleichen Bodenproben erhalten, können sich sowohl morpho logisch, z. B. durch grössere oder geringere Sporula- tionswilligkeit, als auch physiologisch, z.
B. in den An sprüchen an das Nährmedium zur Produktion des Anti- bioticums, unterscheiden. Kulturen des lebenden Mikro organismus Myrothecium verrucaria (Albertini et Schweinitz) Ditmar ex Fries, isoliert aus einer Boden probe von Bingerville, Afrika, wurden bei der Fermen tation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois,
deponiert und in die per manente Sammlung unter der Bezeichnung NRRL 3003 eingereiht.
Für die Herstellung der neuen antibiotisch wirksa men Verbindung lassen sich auch Stämme verwenden, wie sie z. B. durch Selektion oder Mutation unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder durch Anwendung anderer Massnahmen, z. B. .durch Behandlung von Laboratoriumskulturen mit geeigneten Chemikalien, leicht gewonnen werden können.
Die Züchtung erfolgt beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder aber submers unter Schütteln oder in Fermentern mit Begasung durch Luft oder Sau- erstoff unter Rühren. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 33 .
Stämme von Myrothecium verrucaria lassen sich auf vielzrlei Nährböden, .die die üblichen Nährstoffe enthal ten, züchten. So verwenden solche Stämme die für Koh- lenstoffheterotrophe Organismen üblicherweise benutz ten Nährstoffe, beispielsweise Glucose, Stärke, Dextrin, Lactose, Rohrzucker usw. als Kohlenstoffquelle, organi sche und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton,
Hefe- oder Fleischextrakte, Ammoniumsul- fat, Ammoniumnitrat, Aminosäuren usw. als Stickstoff quelle, sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenele mente.
Es wurde nun gefunden, dass sich aus Kulturlösungen einer Reihe von Stämmen von Myrothecium verrucaria die neue antibiotisch wirksame Verbindung Verrucarin K in reiner und kristallisierter Form isolieren lässt.
Eine Durchführungsform der Erfindung zur Herstel lung des neuen Antibioticums Verrucarin K besteht dar in, dass ein flüssiges Nährmedium, welches die üblichen Nährstoffe enthält, mit einer Konidiensuspension eines Stammes von Myrothecium verrucaria beimpft und bei einer Temperatur von 21 bis 33 C während 3 bis 30 Tagen in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben auf einer Schüttel maschine inkubiert wird.
Hierauf wird eine Anzahl sol cher Kulturen zur Beimpfung von Fermentationsbehäl tern verwendet und :die eigentliche Produktionszüchtung vorgenommen. Hierbei wird während 48 bis 72 Stunden bei einer Temperatur von 27 unter Rühren und Bega- sen mit Luft oder Sauerstoff inkubiert.
Verrucarin K kann aus ,der Fermentationsflüssigkeit durch vzrschiedene Methoden isoliert werden. Die Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erwiesen hat, ist die Extraktion mit Benzin und Essigester, jedoch können auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B. Äthylenchlorid, Benzol, Butylacetat, Chloroform, Buta- nol, verwendet werden.
Anschliessend werden die Ex trakte vom Lösungsmittel getrennt und .der Rückstand zur Isolation von Verucarin K auf chromatographi- schem Wege, durch absorbierende Mittel, wie aktivierte Tonerde, Silikagel, Magnesiumsilicat und dgl. oder mit tels Gegenstromverteilung gereinigt.
Verrucarin K kann wie folgt charakterisiert werden: Es bildet aus Äther-Pentan farblose Nadeln vom Schmelzpunkt 177-178 . Eine isomorphe Form schmilzt bei 211-212 . Kristalle von Verrucarin K sind unlöslich in Wasser, Diäthyläther, Diisopropylätherund in flüssigen gesättigten Kohlenwasserstoffen (Pentan, Hexan, Heptan, Cyclohexan), hingegen löslich in niede ren Ketonen (Aceton,
Methyläthylketon), niederen Alkoholen (Methanol, Äthanol, Propanol), in Dioxan, in niederen halogenierten Kohlenwasserstoffen (Dichlor- methan, Chloroform, Tetrachlorkohlens:toff), in Pyridin, Diäthylacetamid, Benzol und in Toluol. Die spezifische Drehung beträgt: [a]j3 = 27 (c = 1,3 in Chloro form).
Die Elementaranalysen haben folgende Werte ergeben: C: 67,1 %, H: 7,6 %, O: 25,1 0/0. Das Anti- bioticum enthält weder N noch S noch Halogen.
Die thermoelektrische Mikromolekularbestimmung in Di- chlormethan hat ein Molekulargewicht von 519 er geben. Auf Grund dieser Befunde ist die Bruttoformel CZsH30_"08 (MG = 500,6 bzw. 502,6) am wahr scheinlichsten. Das UV-Absorptionsspektrum (Fig.1) in Äthanol zeigt Maxima bei 222,5 mu (log = 4.39) und 263 mu (log = 4.26).
Das IR-Absorptionsspektrum (Fig. 2) einer Lösung des Antibioticums in Dichlormethan zeigt Banden bei 3550, 2950, 2850,<B>1</B>700, 1640, 1600, 1220, 1180, 1145, 1090,<B>1</B>080, 1030, 990, 960, 920, 810 cm-1.
Verrucarin K besitzt keine Methoxylgruppe (Zeisel) und nimmt bei der Mikrohydrierung 4-5 Mol H2 auf. Es entfärbt eine Lösung von KMn04 in Aceton und von Brom in Chloroform sofort. Die Reaktionen nach Tol- lens, Fehling, Molisch, Legal, Zimmermann. und Lieber mann fallen negativ aus.
Bei der alkalischen Hydrolyse liefert Verrucarin K. Verrucarin K ist ein lipoidlöslicher Neutralstoff, der bei der alkalischen Hydrolyse Verrucarol liefert. Das neue Antibioticum besitzt ungewöhnliche therapeutische Eigenschaften. Besonders wertvoll sind seine antifungi- sche und citostatische Wirkung.
So entfaltet Verrucarin K in vitro eine ausgeprägte antifungische Aktivität <U>(siehe Tabelle).</U>
EMI0002.0085
Testorganismus <SEP> Verrucarin <SEP> K <SEP> Testmethode
<tb> <U>Art, <SEP> Stamm <SEP> Plattenbest</U>
<tb> Blastomyces <SEP> brasiliensis.
<SEP> 20 <SEP> B
<tb> Zürich
<tb> Botrytis <SEP> alii <SEP> 16 <SEP> B
<tb> ETH-M <SEP> <B>5016</B>
<tb> Botrytis <SEP> einerea <SEP> 20 <SEP> B
<tb> ETH-M <SEP> 4291
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 10 <SEP> A
<tb> ETH <SEP> 5897
<tb> Candida <SEP> krusei <SEP> 15 <SEP> A
<tb> London <SEP> Z <SEP> 70
<tb> Candida <SEP> tropicalis <SEP> 20 <SEP> A
<tb> Zürich <SEP> 169
<tb> Candida <SEP> tropicalis <SEP> S <SEP> 1063 <SEP> 10 <SEP> A
<tb> (Thailandia <SEP> candida)
<tb> Cryptococcus <SEP> neoformans <SEP> 30 <SEP> D
<tb> Zürich
<tb> Endothia <SEP> parasitica <SEP> 28 <SEP> C
<tb> ETH-M <SEP> 162
<tb> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> 13 <SEP> A
<tb> S <SEP> 1345
<tb> Saccaromyces <SEP> cerevisiae <SEP> 15 <SEP> A
<tb> ETH-M <SEP> 108 Stämme:
Zürich = Dermatologische Universitätsklinik, Zürich London = Institute of tropical Medicine, London ETH = Eidgenössische Technische Hoch schule, Zürich S = S;andoz AG, Basel Plattentest Auf ca. 3 mm dicke, sterile Unterschichten in Petri- schalen (2 0/0 Malzextrakt Schweiz.
Ferment AG.) wur den 1 mm dicke Oberschichten, die im gleichen Medium Keime der Testorganismen (Sprosszellen [bud Gelles] oder Konidien) in geeigneter Dichte (Konzentration) gleichmässig verteilt enthielten. Als Mass für die H--mmwirkung diente der Durchmesser von Hemmzo nen um Filterpapierrondellen von 6 mm Durchmesser, die in Lösungen des Antibioticums Verrucarin K 1:l000 in Chloroform getränkt worden waren, nach geeigneter Inkubation bei 37 C und Ablesung nach ca. 20 Std. der Testplatten.
Es sind Hemmhofdurchmesser in Millime tern als Mittelwerte von mehreren Ablesungen angege ben.
Die Wirksamkeit von Verrucarin K gegen tierische Tumore wurde durch die Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen in vitro (Zellen des Mäuse-Mastocy- toms P 815) bestimmt:
In geeigneter Nährlösung ver mehren sich diese Tumorzellen innert 40 Stunden auf das 4- bis 5fache der Ausgangszellzahl. Die DE-50 (Konzentration, welche diese Vermehrung um 50 0/0 hemmt) von Verrucarin K gegenüber diesen Zellen ist 0,001 ,ug/ml; beim Ehrlich-Ascites Tumor ergab die tägliche i-p. Verabreichung von 0,8 mg/kg eine 52 %-ige Tumorhemmung.
Die Wirkung auf Kulturen von embryonalen Fibroblasten vom Huhn ergab bei Verru- carin K einen totalen Mitosestop bis zur Konzentration von 0,01 ,crg/ml. Bei 0,003 @cg/ml ist noch eine ange deutete Wirkung festzustellen. Die akute Toxizität von Verrucarin K bei der weissen Maus beträgt DL-50 3 mg/kg i.v. Verrucarin K kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden.
Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Ap plikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstea- rat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi ara- bicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger.
Die pharmazeuti schen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Cremes, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthal ten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch an dere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in :den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne dass damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Tempera turen sind in Celsiusgraden angegeben. Die Verhältnis zahlen bei Lösungsmitteln beziehen sich immer auf Volumina.
<I>Beispiel 1</I> Der Stamm NRRL 3003 wird in 10 Litern einer Nährlösung, die im Liter 20 g Glucose (Cerelose purem SANDOZ), 2 g Malzextrakt (Schweiz. Ferment A.
G.), <B>2,g</B> Bacto yeast extract Difco, 2 g Pepton Cudahy, 2 g primäres Kaliumphosphat techn., 2 g Magnesiumsul fat >! 7H20 in einem 14-Liter Fermenter (New Brunswick Co., New Brunswick, USA, Typ FS 314)
96 Stunden lang bei 450 Umdrehungen des Rührers pro Minute und unter Belüftung (10 Liter pro Minute) bei 27 C gezüch tet. Zur Kulturbrühe werden 500 g Kieselgur (Celite) gegeben und filtriert. Das klare Kulturfiltrat wird mit zweimal 10 Litern Essigester extrahiert. Die mit einmal 5 Liter 3 %-Natriumbicarbonat-Lösung und einmal 10 Liter Wasser gewaschenen Auszüge werden über Natri umsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Der Rückstand, ein rotbraunes Öl, wird einer 30-stufigen Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen. Als System wird 80-proz. wässeriges Methanol-Tetrachlor- kohlenstoff-(1:1) verwendet, wobei die spezifisch leich tere Phase wandert. Pro Phase und Stufe werden je 40 ml benützt. Aus den Stufen 13-17 kann durch direkte Kristallisation reines Verrucarin A gewonnen werden.
Die Fraktionen 10-12, sowie die Mutterlaugen aus Fraktionen 13-14 werden an Kieselgel (0,05-0,2 mm) chromatographiert. Die Adsorptions- chromatographie an Kieselgel (Korngrösse 0,15-0,30 mm von Bender und Hobein, Zürich) er folgte nach der Durchlaufmethode (vgl. T. Reichstein & C. W. Shoppee, Discuss. Farad. Soc. Nr. 7, 305 (1949)). Die Elution der Substanzen wird mit Methylenchlorid- Methanol-(99:1) ausgeführt.
Pro Fraktion werden 10 ml aufgefangen. Fraktionen 121-180 geben krist. Verruca- rin <I>A,</I> die Fraktionen 181-216 aus Äther-Pentan reines krist. Verrucarin <I>K.</I>
<I>Beispiel 2</I> Der Stamm NRRL 3003 wird in 100 Litern einer Nährlösung, die im Liter 20 g Glucose (Cerelose purem SANDOZ), 2 g Malzextrakt (Schweiz. Ferment A.
G.), 2 g Bacto yeast extract Difco, 2 g Pepton Cudahy, 2 g primäres Kaliumphosphat techn., 2 g Magnesiumsul- fat X 7H.0 in einem Fermenter Typ FB 01 (Hch. Ber- trams Ä.
G., Basel, Schweiz) 113 Stunden lang bei 200 Umdrehungen des Rührers pro Minute und unter Belüf tung (100 Liter pro Minute) bei 27 gezüchtet. Die gelb, dickflüssige Kulturbrühe wird durch Zentrifuga- tion geklärt und die klare Lösung mit viermal je 25 Liter Essigester extrahiert.
Die Extrakte werden im Vakuum eingedampft und der ölartige Rückstand wird zwischen dreimal 200 m190 % wässerigem Methanol und dreimal 200 ml Petroläther im Gegenstrom verteilt. Die Petrol- ätherphasen werden verworfen. Die methanolischen Extrakte werden vereinigt und im Vakuum stark kon zentriert. Nach Zugabe von 100 ml Wasser wird ,der Rückstand mit 200 ml Chloroform extrahiert.
Die mit Wasser gewaschenen und über Natriumsulfat getrockne ten Auszüge werden im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird einer 10-stufigen Gegenstromverteilung nach Craig unterworfen. Als System wird 80-proz. wäs seriges Methanol-Tetrachlorkohlenstoff-(1:1) verwendet, wobei die spezifisch schwerere Phase wandert. Pro Phase und Stufe werden je 100 ml. benützt.
Die Stufen 1-4 geben 280 mg krist. Verrucarin A. Die Stufen 5-7 geben nur Kristallgemische, bestehend aus den Ver- rucarinen A, J und K.
Die Stufen 8-9 werden an Silicagel (0,2-0,5 mm) chromato-graphiert. Die Adsorptionschromatographie an Silicagel (Korngrösse 0,15-0,30 mm von Bender und Hob-,in, Zürich) erfolgte nach der Durchlaufmethode (vgl. T. Reichstein & C. W. Shoppee, Discuss. Farad. Soc. Nr. 7, 305 (1949)).
Die mit Methylenchlorid-Ätha- nol-(99:1) eluierte Fraktion 8 gibt krist. Verrucarin <I>J.</I> Die Fraktionen 9-10 geben aus Äther-Pentan krist. Verrucarin <I>K.</I>
Die Stufe 10 gibt krist. Verrucarin J.