CH421028A

CH421028A - Verfahren zur Durchführung mikrobiologischer Synthesen

Info

Publication number: CH421028A
Application number: CH7828159A
Authority: CH
Inventors: Glenn Knight Stanley
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 1958-09-15
Filing date: 1959-09-15
Publication date: 1966-09-30
Also published as: DE1181703B

Description

Verfahren zur Durchführung mikrobiologischer Synthesen Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf mikro biologische Synthesen durch während der Gärung entstandene Sporen. Die erfindungsgemäss erzielbare Verbesserung besteht darin, dass die Sporen bei der Synthesereaktion im wesentlichen frei von vegeta tiven Wuchsstoffen wie Mycel und Gärbrühe sind und in einem im wesentlichen nährstofffreien, wäs serigen Medium vorliegen. Das Verfahren eignet sich z.

B. für die Einführung von Sauerstoff in Steroide oder in Steroidzwischenprodukte, zur Einführung von Doppelbindungen in Steroide oder deren Zwi schenprodukte, für die Umwandlung von Fettsäuren in Ketone usw.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Durch führung mikrobiologischer Synthesen vermittels Sporen, welche mit vegetativem Wuchsmaterial wäh rend der Gärung in einem Nährmedium entstehen, ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Sporen von dem vegetativen Wuchsmaterial und von dem Nährstoff, der in dem Gärungsmedium enthalten ist, abtrennt und dass die mikrobiologische Synthese mit den Sporen in einem wässrigen Medium durchgeführt wird, welches im wesentlichen von vegetativen Wuchsstoffen und Nährstoffen frei ist.

Bisher wurde die mikrobiologische Synthese chemischer Verbindungen vom Steroidtyp meistens in einem Nährmedium, wie Maisquellwasser, Sojaboh nenmehl u. a., zusammen mit Melasse, Sucrose, usw. durchgeführt, um assimilierbare Quellen sowohl für Stickstoff als auch für Kohlenstoff zu haben, ferner in Gegenwart des sich während der Gärung bildenden Mycels und der Gärbrühe. (Vgl. hierzu US-Patente Nrn. 2 753 290 und 2 793 l62). Die mikrobiologi sche Synthese von Steroiden wurde ferner sowohl unter Verwendung des Mycels allein als auch der Gärbrühe allein durchgeführt.

Auch die Verwendung der über zerkleinertem Mycel überstehenden Flüssig- keit wurde bereits vorgeschlagen, vgl. Muray et a1. US-Patent Nr. 2 602 769, insbesondere Beispiel 18. Wie in diesem Beispiel ausgeführt, ergab die über stehende Flüssigkeit (S11) eine erhebliche Umwand lung, die Gärbrühe (BF) bessere und der Mycel- rückstand eine vollständige Umwandlung.

Bei der sogenannten Oxydationsaktivität, die für die Um wandlung massgebend war, spielen auch die Enzyme eine Rolle, wie dies in dem Murray et a1. Patent ge zeigt wurde. Auch die während der Gärung herge stellten Enzyme sind dafür bekannt, dass sie sowohl mit dem Mycelium als, auch mit dem Bier assoziiert sind.

Die Isolierung der Umsetzungsprodukte (Ste- roide u. dgl.) aus einem komplexen Gärungsmedium gab natürlich Probleme auf. Auch gab es Probleme, wenn man eine Isolierung in guter Ausbeute aus den pflanzlichen Wuchsstoffen vornahm, die Mycelium enthielten, oder aus dem Bier, in dem organische Nährstoffe enthalten und die beide mit Gärungs nebenprodukten verseucht sind. Angesichts dieses Standes der Technik war man bestrebt, andere Iso- lierungsmethoden (z. B.

Extraktion) zu erforschen und nach Mitteln für die Durchführung der Um wandlung zu suchen, bei denen sowohl von Mycelium als auch von Bier freie Enzyme zur Anwendung ge langen konnten. Bezüglich der zuletzt genannten wurde von keinem befriedigenden Enzymextrakt be richtet, mit welchem eine adäquate Umwandlung er zielt wird, und als Folge davon wird in der Technik entweder ein vollständiges, ausgegorenes Medium verwendet, das sowohl Mycelium als auch Bier ent hält oder welches entweder das Mycelium allein oder das Bier allein verwendet, welches durch Filtration des- gegorenen Mediums erhalten wurde.

Während unserer Untersuchung bezüglich der Umwandlung von Fetten, z. B. Milchfett, zu äusserst würzigen Kompositionen mit Pilzen des Penicillin- Typs, z. B.

P. roqueforbi, wurde bemerkt, dass die Gärungsperiode bei Verwendung eines pflanzlichen Inoculums (Schimmelpilzzellen in Mycelium-Form mit einem nahrhaften Wachstumsmedium) relativ kurz war (etwa zwei Tage) verglichen mit einer Gärungszeit von etwa 4 Tagen, wenn Schimmelpilz- conidia oder -conidio Sporen verwendet wurden. Weiterhin wurde bemerkt, dass die Gärungszeit bei Verwendung 7 Tage alter Sporen,

die vegetatives Inoculum oder die Sporen allein enthielten, länger war als die Zeit, die z. B. mit 2 Tage altem, im we sentlichen von Sporen freiem, vegetativem Inoculum erzielt wurde. Dies schien die Annahme zu bestäti- gen, dass die Sporen für sich - verglichen mit den metabolisch sehr aktiven, starken und jungen Myce- liumzellen - ziemlich inaktiv, relativ träge und er schöpft sind. Diese bei zahlreichen Untersuchungen unterstellte Arbeitshypothese erwies sich insofern als unrichtig, als das Fett in der Milch fettspaltenden Enzymen, z.

B. Lipase, ausgesetzt war, während die Sporen für sich in unerwarteter Weise imstande waren, die entstandenen freien Fettsäuren in ein paar Stunden in Ketone umzuwandeln. Bei dieser Reaktion führen die Sporen am C-Atom 2 die -CD-Gruppe ein und decarboxylieren die Fettsäure. Dies kann etwa wie folgt dargestellt werden:
EMI0002.0033

Sporen
<tb> R-CH2-CH2-CH2COOH
<tb> RCH2--CO-CH3; hierin ist R eine Alkylgruppe mit z.

B. 1-18 oder mehr C-Atomen. Ist R Butyl (C4H3), so kann man den Reaktionsverlauf wie folgt darstellen:
EMI0002.0041

Sporen
<tb> CHiCH2CH2CH2CHL,CH2CH2-COOH <SEP> D <SEP> -CH3-(CH2)4-CO-CH3 <SEP> (Amylmethylketon) Diese Entdeckung des Verhaltens der Sporen gegenüber Fettsäuren führte zu der weiteren Ent deckung, dass vom vergärten Medium freie Sporen (frei von Mycelium und Bier) als solche dazu ver wendet werden können, chemische Verbindungen auf verschiedene Weise umzuwandeln.

Die erfindungsgemäss zur Verwendung gelangen den Sporen können leicht aus vegetativen Zellen (Mycelium) erhalten werden, die man in einer sub- mersen Kultur unter Belüftung während 4-6 Tagen wachsen liess, und zwar in einem Kornmaische-Lak- tose-Medium oder einem anderen Nährmedium, in welchem assimilierbarer Kohlenstoff und Stickstoff enthalten ist.

Die aus den alten vegetativen Zellen hergestellten Sporen werden in der Weise geerntet, dass man sie durch Käserinde lässt, um den grössten Teil des Myceliums möglichst weitgehend zu ent fernen, wonach das restliche Mycelium durch Filtra tion durch Glaswolle entfernt wird. Die im Filtrat befindlichen Sporen werden durch Zentrifugieren ge wonnen und werden dann zwecks Entfernung zu rückgehaltenen Nährstoffs mit Wasser gewaschen.

Sie können trocken aufbewahrt oder auch in Was ser wieder suspendiert und bei 4 C aufbewahrt wer den. Man kann die Suspension so standardisieren, dass sie z. B. 1 Billion Sporen/ml enthält. Man kann die Sporen auch auf einer Oberflächenkultur wach sen lassen, z. B. auf Agar, und, nachdem man die Sporen abgeschabt und in Wasser suspendiert hat, sie z. B. durch Filtrieren, Zentrifugieren praktisch rein erhalten.

Oberflächenkulturen sollten dann ver wendet werden, wo der Organismus sporuliert oder wo er dies gut in submersen Kulturen tut. Die Fungusspezies Murcorales, z. B. Rhizopus nigricans, sporulieren in submersen Kulturen nicht, weswegen sie auf Oberflächenkulturen gezüchtet werden soll ten.

Das jeweils geeignetste Verfahren für die Spo- renproduktion kann durch einen Vorversuch leicht ermittelt werden.

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel I Ein Glukose-Neopepton-Medium (Sabourauds- Medium), welches mit 2 % Agar verfestigt worden war,

wurde zunächst mit Aspergillus Ochraceos nach den üblichen Methoden inoculiert und bei etwa 30 5 Tage lang bebrütet. Die während dieser Zeit pro duzierten Sporen wurden von der Oberfläche des resultierenden pflanzlichen Myceliumwuchses mit destilliertem Wasser weggewaschen.

Die sich er gebende wässrige Suspension, die mit etwas. Mycelium angesteckt wurde sowie mit einem Nährmedium, wurde durch Glaswolle filtriert, um das Mycelium zusammen mit unlöslichem Nährstoff zu entfernen, sodann, noch zentrifugiert, um die Sporen zu gewin nen.

Die löslichen Nährstoffe im Medium, die von den Sporen zurückgehalten wurden, wurden zunächst durch Suspendieren der Sporen in destilliertem Was ser entfernt, worauf durch Zentrifugieren die Sporen gewonnen werden. Das Waschen (Suspendieren der Sporen in Wasser und Zentrifugieren) kann ge- wünschtenfalls wiederholt werden, damit man sicher ist, dass die Sporen im wesentlichen frei sind von an steckendem Nährstoff und von Mycelium.

Die so erhaltenen Sporen wurden in destilliertem Wasser suspendiert, welches mit einem 1 % igen Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von 6,5-7 ge bracht wurde, worauf man eine Suspension erhielt, die etwa 1-10 Billionen Sporen pro ml enthielt.

Zu etwa 20 mal dieser Suspension, die sich in einem 125-mI-Erlenmeyerkolben befand, wurde dann 1 mg Progesteron gegeben, welches in 1 ml Propylen- glykol aufgelöst war. Da das Glykol mit dem Wasser mischbar war, das Progesteron aber im Wasser un- löslich ist, so wird das Progesteron unlöslich und fällt in Form einer feinen Suspension an, wenn man das Ganze zu einer gepufferten wässrigen Suspen sion gibt.

Die resultierende Sporen-Progesteron- Suspension wurde sodann durch Schütteln auf einem Drehschüttler belüftet, und zwar bei einer Umdre hungszahl von etwa150 Umdrehungen pro Minute um einen 6,35-mm-Radiuls und während eines ZeitL raumes von etwa 12 Stunden bei 25 .

Am Ende dieses Zeitraumes wurde die Suspen sion, in der sich die Sporen und das Steroid befand, mit Chloroform extrahiert, wonach das Extrakt zwecks Entfernung des unlöslichen Materials und der wässrigen Phase aus dem Chloroform zentrifu giert wurde. Die so erhaltene sporenfreie klare Extraktlösung enthält das gewünschte 11 a-Hydroxy- progesteron, wonach das Steroid leicht durch Ab saugen des Chloroforms bei vermindertem Druck gewonnen werden kann.

Die Prüfung des Produktes durch Vergleich mit einer bekannten echten Probe des lla-Hydroxyprogesterons ergab, dass praktisch 100% des Progesterons in das gewünschte l la-Hy- droxyderivat umgewandelt worden war.

Dies zeigt, dass die 12stündige Umwandlungsperiode passend war und ist ein Indiz, dass möglicherweise noch kürzere Zeiten verwendet werden konnten, um die Einführung der Hydroxygruppe in das Progesteron mit Sporen von A. ochraceus in einem von Myce- lium und Nährstoff freien Medium zu vervollstän digen. In. der Praxis kann das Verhältnis Zeit-Kon- zentration der Sporen den gewünschten Verhältnissen angepasst werden.

Beispiel 11 Man arbeitet wie in Beispiel I und verwendet Sporen, die man aus einer 10-14 Tage Kultur von Septomyxa affinis und Reichsteins Verbindung S in einem Phosphatpuffer bei pH 7 erhalten hat. Nach 24 Stunden wurde das resultierende ö-1-Produkt (Verbindung S mit einer 1-2 Doppelbindung) in der in Beispiel I beschriebenen Weise isoliert.

In diesem Beispiel untergeht dais Steroidmolekül eine Dehydrie- rung und es entsteht im Molekül eine Doppelbin dung. Diesbezüglich besteht ein Unterschied zum Beispiel I, gemäss welchem Sauerstoff in das Mole kül eingeführt worden war.

Die folgenden Beispiele beziehen sich auf die Umwandlung von Fettsäuren in Ketone, wobei im übrigen die oben erwähnten Arbeitsweisen angewen det wurden. Beispiel 111 Zu einer 1 % igen wässrigen Mischung von Octan- säure, die mit einem Phosphatpuffer auf einen pH- Wert von 6,5 gebracht wurde, gab man Conidia- oder Conidio-Sporen des P.

Roqueforti, welches im wesentlichen von pflanzlichem Inokulum und Nähr stoffen frei war. Darin befanden sich etwa 100 Mil lionen Sporen/3 ml der wässrigen Octansäure- mischung. Die Mischung wird dann unter Belüften bei 25 etwa 2 Stunden lang gerührt. Das entstehende Methyl-Amylketon kann auf an sich bekannte Weise, z. B. durch Destillation, isoliert werden.

Beispiel IV Es wird wie in Beispiel III gearbeitet, man be nützt aber Hexansäure, Nonansäure und Decan- säure für die Herstellung des Methylpropylketons;

man erhält auch Methyl , Hexylketon und. Methyl- Heptylketon. Wählt man die geeignete Fettsäure aus, die wenigstens 4 Kohlenstoffatome besitzt, so können auf ähnliche Weise andere Ketone hergestellt werden, und zwar unter Verwendung von Sporen, die, wie bereits beschrieben, keine pflanzlichen Inokula oder Nährstoffe enthalten.

Um durch die Sporen eine möglichst rasche Um- setzung zu gewährleisten, soll die Ausgangsverbin dung in feiner Verteilung vorliegen. Dies kann leicht dadurch bewerkstelligt werden, dass man das Steroid beispielsweise in einem inerten, mit Wasser misch baren organischen Lösungsmittel auflöst. Man ver wendet hierzu niedere Alkohole (Methanol, Äthanol usw.), mit Wasser mischbare Glykole, Aceton oder ähnliche und gibt dann die organische Lösung zu der wässrigen Suspension der Sporen.

Wenn man dies tut, so fällt das Steroid aus der Lösung in feiner Suspension aus. Auch die Isolierung des umgewan delten Steroids in hoher Ausbeute durch Gebrauch organischer Lösungsmittel, in denen das Steroid lös= lich ist, kann leicht vollzogen werden, und zwar dank der Abwesenheit vegetativen Wuchses (Mycelium) und des Biers mit den zurückbleibenden Nährstoffen und dank der Abwesenheit komplexer Nebenpro dukte, die sich während der Gärung bilden.

Es ist hierbei von ausserordentlicher Wichtigkeit, dass die Sporen nach ihrem Gebrauch wiedergewonnen und wieder verwendet werden können. Für diesen Zweck wird das Steroid in der Reaktionsmischung mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. Propylenglykol, aufgelöst, wonach die resultierende Mischung zwecks. Gewinnung der Sporen durch Lö- sungsmittelextraktion des sporenfreien Mediums und zwecks Isolierung des Steroides zentrifugiert wird.

Die gewonnenen Sporen, die man zweckmässig mit Was ser wäscht, können dann wiederum verwendet wer den, wenn sie in einem Medium gehalten werden, in welchem es an einem oder mehreren Nährstoffen fehlt, wodurch die Sporen vom Keimen abgehalten werden. Dieser Prozess, bei welchem ausschliesslich Sporen verwendet werden, und die Entdeckung, dass sie wiederum verwendet werden können, bedeutet eine ganz erhebliche Verbesserung bisher bekannter Gärungsverfahren.

Das Verfahren kann unter Verwendung reinen Sauerstoffs und von Luft durchgeführt werden, wobei die Umwandlung der Steroide gleich gut vor sich geht. Die Belüftung kann auch durch Rühren mit sauerstoffhaltigen Gasen unter Druck ausgeführt wer den. Eine kleine Menge KCN (0,65 Mol) oder CO können dem Sporenmedium während der Umwand lung ebenso zugegeben werden wie Glucose (z. B.

0,5 no. Im allgemeinen wird die Ausbeute durch Zugabe kleiner Mengen oxydierbarer Materialien, wie Glukose, Essigsäure, Milchsäure und ähnlicher, er höht:

Diese Abänderungen können die Geschwindig- keit ebenso wie die Vollständigkeit der Umwandlung der Steroide im günstigen Sinne unterstützen; wenn man jedoch Glukose oder ähnliches benützt, ist es wichtig, das Medium von Stickstoff frei zu halten, damit man die Keimtätigkeit verhindert.

Auf ähnliche Weise wie oben können von Myce- lium und Nährmedium freie Sporen von verschie denen Organismen erhalten und für die mikro- biologische Herstellung chemischer Verbindungen verwendet werden.

Zum Beispiel kann man damit verschiedene Gruppen und Doppelbindungen in die verschiedensten Steroide und deren Zwischenprodukte einführen. Anstatt die Organismen, die in dem noch folgenden Schrifttum erwähnt wurden und welche danach dazu verwendet werden, eine Gruppe oder Doppelbindung auf dem Gärungswege in das.

Steroid- molekül einzuführen, und zwar in einem vegetativen Inokulum, das in einem wässrigen Nährmedium ent halten ist, kann man auch die Sporen für sich aus demselben Organismus dazu verwenden, dieselbe Gruppe oder Doppelbindung in dasselbe Steroidmole kül einzuführen.

Die folgenden Modifikationen von Steroiden seien nachstehend angeführt: 1. Reduktion des Progesterons zum d4-Pregnen- 20ss - o1 - 3 - an mit Stroeptomyces, lavendulae (Fried, J. et a1., J. Am. Chem. Soc. 75: 5764 [1953]).

2. Dehydrierung sekundärer Alkohole.

a) d5-Androsten-3ss,17ss-diol zum Testosteron mit Proactinomyces erjthropolis. Turfitt G. E., Biochem. D. 40: 79 [1946] ).

b) Östradiol zu östron mit Sireptomyces albus.. (Welsch, M et a1., Compt. rend. Soc. Biol. 142: 1074 [1948]).

3. Hydroxylierung in 1-Stellung. d4-Androsten- 3,17-dion zu d4-Androsten-la-ol-3,17-dion mit Peni- cillium sp., (Dodson, R. M. et a1., J. Am. Chem. Soc. 79: 3921 [1957]).

4. Hydroxylierung in 2-Stellung. d4-Pregnen- 17a,21-diol-3,20-dion zum d4-Pregnen-2ss,17a,21- triol-3,20-dion mit Streptomyces sp. (Herzog, H. L. et a1., Journal Am. Chem. Soc. 79: 3922 [1957]).

5. Hydroxylierung in. 6-Stellung. Progesteron zum d4-Pregnen-6ss-ol-3,20-dion mit Streptomyces aureo- faciens [Fried, J. et a1. Recent Progr. Hormone Res. 11: 157 (1955); siehe auch Dulanaz, E.

L. et a1., Mycologia 47: 464 (1955); Fried, J. et a1. Journ. Am. Chem. Soc. 74: 3962 (1952); Meister P. D. et a1., Journ. Am. Chem. Soc. 75: 416 (1953); Eppstein, S.

H. et a1. Journ. Am. Chem. Soe. 75: 408 (1953)] einschliesslich der Mikroorganismen Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger und Ricopus arrhizus.

6. Hydroxylierung in 7-Stellung. Progesteron zum d4-Pregnen-7a-ol-3,20-dion mit Phigomyces blakes- leanus. Fried et a1., US-Pat. Nr. 2 753 290; siehe auch Meystre, C. et a1., Helv. Chem. Act. 38:

381 (1955) unter Verwendung einer Peziza-Spezies für die Durchführung ähnlicher Reaktionen mit dem Desoxy- corticosteron.

7. Hydroxylierung der 10-, 11- oder 12-Stel- lungen.

a) 19-nor-Progesteron zum l0E-Hydroxyl-19-nor- Progesteron mit Rhizopus nigricans. Pederson, R. L. et a1., Journ. Am. Chem. 78: 1512 (1956).

b) Progesteron zum d4-Pregnen-lla-ol-3,20-dion mit Reizopus arrhizus. Peterson, D.H. et a1., Journ. Am. Chem. Soc. 74: 1871 (1952) und Journ. Am. Chem. Soe. 75: 412 (1953).

c) Reichsteins-Verbindung S (d4-Pregnen-17a,21- diol 3,20-dion) zu Hydrokortison mit Cunninghamela blakesleeana. Hanson, F. L. et a1., Journ. Am. Chem. Soc. 75: 5369 (1953) siehe auch Schull G.

M. et al., Journ. Am. Chem. Soc. 77: 763 (1955) sowie Thoma et a1., US-Patent Nr. 2 793 162, in welchem auch ähnliche Reaktionen mit Curvularia lunata, Tricho- tecium roseum und Coniothyrium helleborine be schrieben sind.

d) Progesteron zum d4-Pregnen-12ss-ol-3,20- dion und dem analogen 12ss,15ss-diol mit Calnectria decora. Schubert, A. et a1., Ber. 90: 2576 (1957).

B. Hydroxylierung in anderen Stellungen be schreibt Meister, P. D. et a1., Absts. 123 rd Meeting Am. Chem. Soc. (1953); Fried et al., US-Patent Nr. 2 753 290; Kamerino, B. et a1., Gaz. Chem. Ital. 86: 1226 (1956); Meystre, C. et a1., Helv. Chim. Acta.38: 38 (1955);

Perlinan D. et a1., J. Am. Chem. Soc. 74: 2126 (1952); Thoma R. W. et a1., Journ. Am. Chem. Soc. 79: 4818 (1957); Dulaney E. L. et a1., Appl. Microbiol. 3: 372 (1955); Meystre C. et a1., Helv. Chim. Acta37: 1548 (1954); McAleer W.

J. et a1., Arch. RTI ID="0004.0238"WI="6" HE="4" LX="1422" LY="1606"> Bio. Chem. Biopys. 62: 109 (1956).

9. Dehydrierung. Hydrocortison zum d4-Pregna- dien-11ss,17a-21-triol-3,20-dion mit Streptomyces lavendulae. Fried, et al., US-Patent Nr. 2 793 164;

siehe auch Mobile, A. et a1., Journ. Am. Chem. Soc. 77: 4184 (1955); Vischer E. et a1., Helv. Chim Acta 38: 835 und38: 1502 (1955) unter Verwendung von Alternaria sp. und Didymella lycoperizi. Vgl. auch Sper et a1., Journ. Am. Chem. Soc. 78:

6213 (1956) unter Verwendung von Septomyxa affinis, wie dies in Beispiel II für die Einführung der 1-2-Doppel- bindung beschrieben wurde.

10. Seitenkettenabbau. Progesteron zum d4- Androstadien-3,20-dion mit Streptomyces lavendulae. Peterson G.

E. et a1., J. Bact. 74: 684 (1957) ver gleiche auch Vischer, E. et a1., Bericht über Fusarium solani und F. Caucasicum in Experientia 9: 371 (1953), wo eine S-2-Doppelbindung mit Seitenketten abspaltung beschrieben wird. Vergleiche auch Turfit, G. E. Biochem. Journ. 42: 376 (1948).

Vergleiche auch die USA-Patente Nrn. 2 602 669, 2649400, 2649401,2695260, 2735800, 2753290, 2762747, 2768928, 2789940, 2802775, 2809919, 2812285, 2830937, in denen auch Mikroorganismen bildende Sporen beschrieben sind, die gleichfalls in von pflanzlichen Wuchs- und Nährstoffen freien Medien verwendet werden können.

Wie bereits bemerkt, werden die Verfahren so ausgeführt, wie sie in den oben zitierten Literatur stellen (1) beschrieben wurden, allerdings mit der Ausnahme, dass das dort mitverwendete vegetative Wuchsmaterial durch Sporen ersetzt wird, und zwar durch Sporen, die im wesentlichen von vegetativem Wuchsmaterial frei sind, und (2) wobei auch das wässrige Nährmedium oder Bier, welches gemäss der obigen Literaturstelle verwendet wird, durch ein wässriges Medium ersetzt wird, welches im wesent lichen frei ist von einem Nährstoff.

Die für die voll ständige Umwandlung erforderliche Zeit bei Ver wendung von Sporen (wobei diese Zeit zuvor durch einen Blindversuch festgestellt werden kann) kann im Vergleich zu bekannten Verfahren gewöhnlich wesentlich verkürzt und die Ausbeute stark erhöht werden.

Neben dem Zeitfaktor jedoch ist auch die Isolierung der chemisch umgewandelten Verbindun gen in guter Ausbeute viel günstiger (sie kann gleichfalls nach den Methoden der obigen Literatur stellen durchgeführt werden), weil die Reaktions mischung relativ reine Reaktionsprodukte enthält, wohingegen bekannte Gärungsmischungen vegetative Wuchsstoffe, organische Nährmittel sowie Gärungs nebenprodukte enthalten. Die Reinigung der erhal tenen Verbindung nach ihrer Isolierung ist gleich falls viel leichter als bei bekannten Verfahren.

Es ist offensichtlich, dass das Verfahren der vor liegenden Erfindung unter Verwendung von Sporen überall dort verwendet werden kann, wo man Myce- lium und Bier, das während der Gärung entsteht, benützt. Die Verwendung eines Steroids mit einer 11-Methylengruppe und von mit Aspergillus erhal tenen Sporen (US-Patent Nr. 2 649 402) [und von Penicillium (US-Patent Nr. 2 649 402)] und von Organismen, wie Septomyxa affinis, welche eine 1-2- Doppelbindung einführen, werden bevorzugt.

Zwei Zwischenumwandlungen können durch Ver wendung von Sporen verschiedener Fungi gleichzeitig ermöglicht werden; der Unterschied kann so gering sein wie der Unterschied der Beanspruchung dessel ben Fungus oder so gross wie der Unterschied in der Klasse. Daräberhinaus kann dieser Unterschied durch Mutation eines besonderen Organismus induziert wer den.

Zusätzlich können ausser Steroiden und verwand ten Zwischenprodukten sowie von Fettsäuren auch noch andere chemische Verbindungen im Kern und in der Seitenkette mit den Sporen auf die obige Weise modifiziert werden. Beispielsweise seien ange führt in der Natur vorkommende Alkaloide, wie z. B. Rauwolfia Alkaloide usw. ebenso wie synthetische Stoffe, wie z. B. Levallorphan (l. Lorphan) und ähnliche. Vergleiche hierzu Pan. S. C. et a1., J. A. C. S. Seite 4749 r. (Sept. 5, 1958); Godtfresen et a1., Exp. 14: 88 (1958).

In allen Fällen werden die Verbindungen durch die Sporen in einem Medium verändert, welches praktisch frei von ansteckenden Stoffen, wie vegetativem Wuchsmaterial (Mycelium), Nährstoffen, insbesondere Gärungsnährstoffen, ist, in denen die Sporen keimen können und die auch frei von Nebenprodukten der Gärung sind. Dies ist erfor derlich, damit man in den Genuss des Vorteils einer einfachen und erleichterten Isolierung und Reinigung kommt.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Durchführung mikrobiologischer Synthesen vermittels Sporen, welche mit vegetativem Wuchsmaterial während der Gärung in einem Nähr medium entstehen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Sporen von dem vegetativen Wuchsmaterial und von dem Nährstoff, der in dem Gärungsmedium ent halten ist, abtrennt, und dass die mikrobiologischen Synthesen mit den Sporen in einem wässrigen Me dium durchgeführt wird, welches im wesentlichen von vegetativen Wuchsstoffen und Nährstoffen frei ist. UNTERANSPRÜCHE 1.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man ein Steroid der Einwirkung von Sporen unterwirft. 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man eine Fettsäure der Einwirkung von Sporen unterwirft. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Einwirkung von Sporen auf ein Steroid oder eine Fettsäure unter Belüftung durchgeführt wird.