CH422230A

CH422230A - Verfahren zur Herstellung einer Poliomyelitisvaccine

Info

Publication number: CH422230A
Application number: CH1178662A
Authority: CH
Inventors: Schaefer Werner; Restle Heinz
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1961-10-10
Filing date: 1962-10-08
Publication date: 1966-10-15
Also published as: AT247518B; SE316571B

Description

Verfahren zur Herstellung einer Poliomyelitisvaccine
Es ist ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen bekannt, bei dem Viren der Maul- und Klauenseuche, der Encephalomyelitis-Gruppe oder der Myxo-Gruppe durch Behandlung mit Hydroxylamin inaktiviert werden (DBP Nr. 1075 279).

Eine Übertragung dieses Verfahrens auf Poliomyelitisviren, die im Gegensatz zu den genannten Viren zu den Enteroviren gehören, scheiterte bisher.

Wegen der hohen Pathogenität des Poliomyelitisvirus wurden für die Impfstoffherstellung besonders strenge Bestimmungen aufgestellt. Ein aus inaktiviertem Poliomyelitisvirus hergestellter Impfstoff muss nach den staatlichen Prüfungsbestimmungen eine vollständige Abwesenheit von infektiösen Viren (Apathogenität) und einen möglichst übersichtlichen Verlauf der Inaktivierung zeigen. Letzteres ist bei dem bisher allgemein angewandten Inaktivierungsverfahren mittels Formaldehyd und Wärme nicht immer gegeben.

Bei der Gewinnung von Poliomyelitisviren zur Herstellung einer Poliomyelitisvaccine werden primäre Zellkulturen von Affennieren verwendet. Dabei werden oft als Verunreinigung Fremdviren beobachtet, die mit Simian-Viren oder Pick-up-Viren bezeichnet werden. Solange solche Fremdviren in bekannter Weise mit Formaldehyd mindestens mit der glei- chen Geschwindigkeit wie das Poliomyelitisvirus inaktiviert werden konnten, war die Herstellung der Poliomyelitisvaccine durch die Gegenwart der Fremdviren nicht beeinträchtigt. Es wurde nun aber ein Simian-Virus entdeckt, das durch Formaldehyd nicht inaktiviert wird. Es erhielt den Namen Simian Virus 40, abgekürzt SV 40, oder auch Vacuolating Virus.

Es ist bisher kein Verfahren bekannt geworden, SV 40 in Gegenwart von Poliomyelitisvirus, z. B. bei der Herstellung von Poliomyelitisimpfstoff, zu inaktivieren, ohne dass das Poliomyelitisvirus geschädigt wird.

Es ist zwar schon versucht worden, das SV 40 mit Magnesiumchlorid zu inaktivieren. Obwohl bei dieser Methode die Magnesiumchlorid enthaltende Virussuspension auf 500 erhitzt werden musste, behielt das SV 40 seine Lebensfähigkeit. Diese Methode führte somit nicht zum erwünschten Erfolg. Ausserdem wurde die Antigenität des gleichzeitig beim Erhitzen anwesenden Poliovirus geschädigt.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Vaccinen gegen Poliomyelitis gefunden, das den obigen Forderungen gerecht wird und dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Suspension von Polio myelitisviren mit oder ohne Vorkommen von SV 40 oder Vacuolating Virus, gegebenenfalls nach Konzentrierung, bei pH 4,5-7 - vorzugsweise 6,0 - und einer Temperatur von 4-40 C mit Hydroxylamin in der Konzentration von 0,01 bis 5,0 Mol/Liter, vorzugsweise 0,2 Mol/Liter, versetzt, das Hydroxylamin bis zum Freisein von infektiösen Viren auf die Virussuspension einwirken lässt und das nicht in Reaktion getretene Hydroxylamin mittels einer carbonylhaltigen Substanz, vorzugsweise Aceton, abbindet, gegebenenfalls anschliessend die dabei entstehende Oximverbindung z.

B. durch Dialyse oder bei unlöslichen Oximen durch Zentrifugation oder Filtration entfernt und schliesslich die in aktivierte Virussuspension in der üblichen Weise nach Konzentrierung und/oder nach Zugabe von Adjuvantien zur Steigerung der Antikörperbildung, vorzugsweise Aluminiumhydroxyd und/oder Aluminiumphosphat, zu Impfstoffen verarbeitet
Bei vorliegendem Verfahren wird also das Virusmaterial entweder bei neutralem pH-Wert und einer Temperatur von 30-40 oder im pH-Bereich von 4,5 bis 6,5, vorzugsweise beim pH-Wert von 6 und einer Temperatur von P400, vorzugsweise 200, inaktiviert, um auch etwa vorhandenes Fremdvirus SV 40 auszuschalten und damit zu einem Impfstoff zu gelangen, der auch die seit der Entdeckung der oben ge nannten Fremdviren verschärften staatlichen Prüfungsvorschriften erfüllt.

Bei dem Verfahren gemäss der Erfindung kann die Einwirkungszeit des Hydroxylamins bis zum völligen Verlust der Infektiosität der Polioviren ermittelt werden. Es ist eine Eigenart der erfindungsgemässen Hydroxylamininaktivierung von Polioviren, dass sich der Inaktivierungsverlauf in einer Zeitfunktion geradlinig darstellen lässt, so dass eine Extrapolation auf den Nullwert der infektiösen Keime möglich ist. Bei der Inaktivierung mittels Formaldehyd ist das nicht möglich. Die Zeitfunktion der Inaktivierung ist dort keine Gerade.

Besondere Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens bestehen ausserdem darin, dass die Inaktivierung innerhalb von Stunden vor sich geht und die immunogene Wirksamkeit durch dieses Verfahren nicht beeinträchtigt wird. Vergleichsweise beträgt die Zeit bei der Inaktivierung mittels Formaldehyd unter den allgemein üblichen Bedingungen 9-12 Tage, wobei noch Verluste an antigener Wirksamkeit durch Formaldehyd in Kauf genommen werden.

Es ist zweckmässig, zur Unterbrechung des Inaktivierungsvorganges das Ein bis Zehnfache der auf Hydroxylamin berechneten stöchiometrischen Menge einer Carbonylverbindung, insbesondere Aceton, zuzufügen.

Das bei der Umsetzung von Hydroxylamin mit der carbonylhaltigen Substanz entstehende Oxim kann durch Dialyse entfernt werden. Werden Carbonylgruppen enthaltende Substanzen verwendet, deren Oxime in Wasser unlöslich sind, z. B. Camphen oder Steroidketone, so können sie durch Zentrifugation oder Filtration aus der Reaktionslösung entfernt werden.

Die auf diese Weise gewonnene Virussuspension kann gegebenenfalls konzentriert und zur Steigerung der Antikörperbildung mit Adjuvantien, vorzugsr weise Aluminiumhydroxyd und/oder Aluminiumphosphat, versetzt werden. Es ist auch möglich, die Ausgangsvirussuspension vor der Inaktivierung z. B. durch Ultrafiltration oder durch Chromatographie an eine Calciumphosphatsäule zu konzentrieren und das erhaltene Konzentrat, das nach Beispiel 3 1/100 des Ausgangsvolumens aufweist, erfindungsgemäss mit Hydroxylamin zu inaktivieren. Die inaktivierte, konzentrierte Virus suspension kann wieder anschliessend verdünnt werden.

Dieses Vorgehen führt zu einer wesentlichen Arbeits-, Material-und Raumeinsparung, da sämtliche Arbeitsvorgänge mit den durch den Konzentrierungsfaktor gegebenen kleineren Virusvolumina ausgeführt werden können. Ausserdem wird dadurch eine zusätzliche Verdünnung des nicht umgesetzten Hydroxylamins und seines Reaktionsproduktes mit der zugesetzten Carbonylverbindung erreicht und schliesslich besteht die Möglichkeit, die antigene Wirksamkeit der so hergestellten Polioimpfstoffe auf einen bestimmten Wert einzustellen und eine Produktion von Impfstoffen gleichbleibender antigener Wirksamkeit zu gewährleisten.

Beispiel I a) 450 ml einer in bekannter Weise hergestellten Suspension des Poliomyelitisvirus Typ I/Mahoney mit einer Infektiosität von 107f0ID50/ml werden bei 200 C mit 50 ml einer 2m neutralen Hydroxylaminlösung versetzt und mit ihr gründlich gemischt. Alle drei Stunden werden Proben von 5 ml aus dem Gemisch entnommen und mit 0,15 ml Aceton versetzt. Von diesen Proben wird in der Gewebekultur die Infektiosität bestimmt. Die erhaltenen Daten werden in einem Koordinatennetz gegen die Zeit eingetragen.

Die so erhaltenen Messpunkte liegen auf einer geraden Linie. Durch Verlängerung der Geraden lässt sich der Zeitpunkt vorausberechnen, in dem die Virussuspension definitionsgemäss nach den staatlichen Prüfungsvorschriften frei von infizierenden Viren ist. Die Berechnung ergibt, dass dies nach 50stündiger Hydroxylamineinwirkung der Fall ist. b) 4500 ml des gleichen Ausgangsmaterials werden bei 200 C mit 500 ml einer 2molaren neutralen Hydroxylaminlösung und nach 50 Stunden mit 150 ml Aceton versetzt und anschliessend mit 388 ml einer 1 % igen Al(OH)3-Suspension vermischt. Dadurch werden 5538 ml einer Poliovaccine Typ I/ Mahoney erhalten.

Prüfung auf Apathogenität:
Die Abwesenheit von infizierenden Viren wird in der wie oben vorbehandelten Virussuspension durch den in den staatlichen Prüfungsvorschriften geforderten Unschädlichkeitstest bestätigt.

Prüfung auf Antigenität:
Die antigene Wirksamkeit wird mit Hühnchen und Meerschweinchen, wie bei den Poliomyelitisvirus üblich, bestimmt. Dazu werden zwei Impfstoffe, vom gleichen Infektiositätstiter ausgehend, durch Inaktivierung mit Formaldehyd bzw. Hydroxylamin hergestellt. Hierauf wird in den Versuchstieren auf bekannte Weise der spezifische Antikörpertiter wie folgt festgestellt:
Antikörpertiter im Serum Inaktivierungs- beim beim mittel Hühnchen- Meerschweinchen- versuch versuch Formaldehyd 1 : 40 1 : 128 Hydroxylamin 1 : 64 1 :

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Beispiel 2
Je 4500 ml der Poliovirussuspensionen der drei Typen
I/Mahoney mit einer Infektiosität von 107, II/MEF 1 mit einer Infektiosität von 107d3
III/Saukett mit einer Infektiosität von 107. werden gesondert wie im Beispiel 1 behandelt, nach der Inaktivierung und Abbindung des nicht umgesetzten Hydroxylamins zu gleichen Teilen gemischt und mit 1150 ml einer 1 % igen Al(OH)1-Suspension versetzt. Es werden insgesamt 16 600 ml Poliovaccine erhalten.

Die auf diese Weise hergestellte Poliovaccine wird für alle drei Typen auf Apathogenität nach den staatlichen Prüfungsvorschriften geprüft. Die Vaccine erwies sich als frei von infektiösen Polioviren und war gemäss den staatlichen Prüfungsvorschriften antigen wirksam.

Folgende Daten zeigen den Vergleich mit einer durch Inaktivierung mit Formaldehyd hergestellten Poliovaccine, bei der das gleiche Ausgangsmaterial verwendet wurde:
Antikörpertiter im Serum beim
Inaktivierungs- Meerschweinchentest mittel Typ 1 Typ II Typ III
Formaldehyd 1:128 1:112 1 : 64
Hydroxylamin 1 : 256 1 : 512 1:161
Beispiel 3
450 1 des gleichen wie in Beispiel 1 verwendeten Ausgangsmaterials werden ohne Infektiositätsverlust auf 4,5 1 durch Ultrafiltration konzentriert und wie im Beispiel 1 behandelt. Nach der Zugabe von Aceton wird die inaktivierte Virussuspension wieder auf 450 1 mit einer Hanks-TCM-Lösung (75 : 25) verdünnt und mit A1(OH)3 zu einer Vaccine verarbeitet.

Beispiel 4
In einem entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 ausgeführten Ansatz mit 45 ml Poliosuspension wird das bei der Reaktion nicht umgesetzte Hydroxylamin durch Zugabe von 2,05 ml Acetylaceton unwirksam gemacht. Die Aufarbeitung zu einer Vaccine erfolgt nach Beispielen 1-3.

Beispiel 5
90 ml einer poliomyelitisvirushaltigen Suspension vom Typ II/MEF 1 mit dem Infektiositätstiter von 107X ID50/ml werden bei 200 C mit 10 ml einer 2m Hydroxylaminlösung inaktiviert. Das nicht umgesetzte Hydroxylamin wird durch Zugabe von 4,70 ml Acetonylaceton unwirksam gemacht. Die Aufarbeitung zu einer Vaccine erfolgt nach Beispielen 1-3.

Beispiel 6
90 ml einer poliomyelitisvirushaltigen Suspension vom Typ I/Mahoney mit dem Titer 1 07'0ID50/mi werden, wie in Beispiel 5 angegeben, inaktiviert und danach das nicht umgesetzte Hydroxylamin durch die Zugabe von 5,10 ml Acetessigsäureäthylester unwirksam gemacht. Die Aufarbeitung zu einer Vaccine erfolgt nach Beispielen 1-3.

Beispiel 7
45 ml einer in bekannter Weise hergestellten Suspension des Poliomyelitisvirus Typ III/Saukett mit einer Infektiosität von 107'0ID50/ml werden bei 200 C mit 5 ml einer 2m neutralen Hydroxylaminlösung versetzt, gut durchgemischt und 50 Stunden sich selbst überlassen. Nach dieser Zeit sind alle Poliomyelitisviren inaktiviert. Das nicht umgesetzte Hydroxylamin wird durch Zugabe von 2,17 ml Acetessigsäuremethylester unwirksam gemacht. Die Aufarbeitung zu einer Vaccine erfolgt nach Beispielen 1-3.

Beispiel 8
450 ml einer in bekannter Weise hergestellten Suspension des Poliomyelitisvirus Typ I/Mahoney mit einer Infektiosität von 1070ID50/ml, die nach Titration auf Gewebekultur von African green monkey, Cercopithecus aethiops, eine zusätzliche Infektiosität an SV 40 zeigte, werden bei 200 C mit 50 ml einer 2m Hydroxylaminlösung versetzt, mit ihr gründlich gemischt und auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt.

Nach 50stündiger Hydroxylamineinwirkung bei 200 wird das bei der Reaktion nicht verbrauchte Hydroxylamin mit 15 ml Aceton unwirksam gemacht.

Danach war diese Virussuspension definitionsgemäss nach den staatlichen Prüfungsvorschriften frei von infizierenden Viren. Die Antigenität des Poliovirus wird durch dieses Inaktivierungsverfahren nicht beeinflusst. Die Aufarbeitung zu einer Vaccine erfolgt nach Beispielen 1-3.

Beispiel 9
Ein gemäss Beispiel 8 hergestellter Ansatz wird nach 25stündiger Hydroxylamineinwirkung bei 370 C durch Zugabe von 15 ml Aceton abgebrochen. Auch dieser Ansatz war nach der Hydroxylaminbehandlung frei von aktivem SV 40 und aktivem Poliovirus. Die antigene Wirksamkeit des Poliovirus war nicht beeinträchtigt. Die Aufarbeitung zu einer Vaccine erfolgt nach Beispielen 1-3.

Beispiel 10
450 ml der in Beispielen 8 und 9 verwendeten Poliovirussuspension werden mit 50 ml einer 2m neutralen Hydroxylaminlösung versetzt, mit ihr gründlich gemischt und bei 370 C aufgestellt. Nach 25 Stunden waren die SV 40 und Polioviren inaktiv.

Die Aufarbeitung zu einer Vaccine erfolgt nach Beispielen 1-3.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Vaccinen gegen Poliomyelitis, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Suspension von Poliomyelitisviren bei 4-400 C und dem pH-Wert von etwa 4,5-7 mit Hydroxylamin in der Konzentration von 0,01 bis 5,0 Mol/Liter versetzt, das Hydroxylamin bis zum Freisein von infektiösen Viren auf die Virussuspension einwirken lässt und das nicht in Reaktion getretene Hydroxylamin mittels einer carbonylhaltigen Substanz abbindet und schliesslich die inaktivierte Virussuspension zu Impfstoffen verarbeitet.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das virushaltige Ausgangsmaterial neben Poliomyelitisviren noch Simian-Virus 40 enthält.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das virushaltige Ausgangsmaterial nach Konzentrierung der Einwirkung von Hydroxylamin unterworfen wird.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension von Poliomyelitisviren bei 370 C und einem pH-Wert von 7 mit Hydroxylamin versetzt und dadurch in aktiviert wird.

4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension von Poliomyelitisviren bei 200 C und einem pH-Wert von 4,5-6,5 mit Hydroxylamin versetzt und dadurch inaktiviert wird.

5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Menge des zur Inaktivierung der Poliomyelitisviren verwendeten Hydroxylamins 0,2 Mol/Liter beträgt.

6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als carbonylhaltige Substanz zur Abbindung von überschüssigem Hydroxylamin Aceton verwendet wird.

7. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass jegliche bei der Umsetzung von carbonylhaltiger Verbindung und überschüssigem Hydroxylamin entstehende Oximverbindung entfernt wird.

8. Verfahren nach Unteranspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass jegliche bei der Umsetzung von carbonylhaltiger Verbindung und überschüssigem Hydroxylamin entstandene lösliche Oximverbindung durch Dialyse entfernt wird.

9. Verfahren nach Unteranspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass jegliche bei der Umsetzung von carbonylhaltiger Verbindung und überschüssigem Hydroxylamin entstandene unlösliche Oximverbindung durch Zentrifugation oder Filtration entfernt wird.

10. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die inaktivierte Virussuspension nach Zugabe von Adjuvantien zur Steigerung der Antikörperbildung zu Impfstoffen verarbeitet wird.

11. Verfahren nach Unteranspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Aluminlumhydroxyd und/oder Aluminiumphosphat als Adjuvantien zur Steigerung der Antikörperbildung verwendet werden.

12. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Unterbrechung des Inaktivierungsvorganges in der Virussuspension das 1bis 10fach der auf Hydroxylamin berechneten stöchiometrischen Menge einer Carbonylverbindung verwendet.

13. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Abbindung von überschüssigem Hydroxylamin Acetylaceton, Acetonylaceton, Acetessigsäureäthylester oder Acetessigsäuremethylester verwendet.