CH436328A

CH436328A - Verfahren zur Herstellung von Arginin enthaltenden Peptiden

Info

Publication number: CH436328A
Application number: CH1077563A
Authority: CH
Inventors: Stephan Dr Guttmann; Janos Dr Pless; Roger Dr Boissonnas
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1963-08-30
Filing date: 1963-08-30
Publication date: 1967-05-31

Description


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 Verfahren zur Herstellung von Arginin enthaltenden Peptiden Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Arginin enthaltenden Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, dass man die Guanidinogruppe des Arginins während der zur Herstellung der    Peptid-      kette   notwendigen Reaktionsstufen durch einen    2-Carb-      oxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl-Rest   schützt. 



  Die basische Aminosäure Arginin bildet einen Bestandteil verschiedener in der Natur vorkommender, biologisch aktiver Polypeptide. Bei der Synthese von Polypeptiden, die Arginin enthalten - seien dies nun natürliche oder künstlich hergestellte - muss die    Guani-      dinogruppe   des Arginins geschützt werden, da sonst unerwünschte Nebenreaktionen eintreten können. Als Schutzgruppe für die Guanidinogruppe wurden bisher die Nitrogruppe, die p-Toluolsulfonyl- und die    Carbo-      benzoxygruppe   verwendet. Diesen drei Gruppen haften aber verschiedene Nachteile an: Die Nitrogruppe ist nur durch katalytische Hydrierung abspaltbar. Wenn nun die a-Aminogruppe des Arginins durch einen hydrogenolytisch abspaltbaren Rest, z.

   B. die Carbobenzoxygruppe, und die    Guani-      dinogruppe   des Arginins durch eine Nitrogruppe geschützt ist, werden bei der Hydrierung beide Gruppen gleichzeitig abgespalten. Es ist daher in diesem Fall nicht möglich, eine geschützte a-Aminogruppe durch katalytische Hydrierung in Freiheit zu setzen, da dadurch auch die Nitrogruppe abgespalten würde. Aus demselben Grund ist es auch nicht möglich, die    Carbo-      benzoxygruppe   sowohl zum Schutz der    Guanidino-      gruppe   als auch zum Schutz der a-Aminogruppe zu verwenden, da auch in diesem Fall R eine selektive Abspaltung der Carbobenzoxygruppe von der a-Aminogruppe nicht möglich ist. 



  Die p-Toluolsulfonylgruppe hingegen kann nur durch    Behandlung   mit    Natrium   in    flüssigem   Ammoniak abgespalten werden. Diese Methode kann jedoch z.B. bei Polypeptiden, die Methionin enthalten, nicht verwendet werden und führt auch bei anderen Polypepti- den zu unerwünschten Spaltungen in der Peptidkette, wodurch die Ausbeute am gewünschten Endprodukt stark herabgesetzt wird. 



  Es    wurde   nun gefunden, dass man zum Schutz der Guanidinogruppe beim Aufbau von Polypeptiden    vor-      tedhafterweise   den    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetra-      chlorbenzoyl-Rest   verwenden kann, der sich durch milde saure Hydrolyse leicht abspalten lässt. 



  Die Einführung von    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-      tetrachlorbenzoyl-Resten   kann durch entsprechend reaktionsfähige Derivate der    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-      tetrachlorbenzoesäure   erfolgen, beispielsweise durch den p-Nitrophenylester oder den 2,4,5-Trichlorphenylester    des   genannten    Säure.   



  Eine vorzugsweise Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass man Arginin oder ein Polypeptid, das als letztes Glied der Kette Arginin enthält und dessen a-Aminogruppe durch eine beliebige Schutzgruppe    geschützt   ist, zum Schutz der Guanidinogruppe mit    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoesäure-      2,4,5-triclorphenylester   oder    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbdnzoesäure-      p-nitrophenylester   in einem organischen Lösungsmittel umsetzt. 



  Die erfindungsgemäss eingeführte Schutzgruppe ist auch stabil gegenüber der Behandlung des so geschützten Peptids mit wasserfreier Trifluoresigsäure und/oder mit wasserfreien Lösungen organischer oder anorganischer Säuren in organischen Lösungsmitteln, Reagenzien, die für die Spaltung der die Aminogruppe schützenden Carbo-tert.-butyloxygruppe bzw. der die    Carb-      oxy-Igruppe   schützenden    tert.-Butylestergruppe      verwen-      det   werden.

   Bei    Anwendung   der    erfindungsgemässen   neuen    Schutzgruppe   ist    daher   die    Verlängerung   eines    Argfnin   enthaltenden    Polypeptids      sowohl   an der    Amino-      als   auch an der    Carboxylgruppe      möglich.   

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 Ein nach dem erfindungsgemässen Verfahren geschütztes Arginin bzw. Arginin enthaltendes Polypeptid kann für alle bekannten und bewährten Methoden zur Synthese höherer Peptide verwendet werden, z. B. die Azidmethode, die Carbodiimidmethode, die gemischte Anhydridmethode sowie die Methode mit aktivierten Estern, wie z.

   B. die Nitrophenylestermethode, da die    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl-      gruppe      durch   diese Verfahren nicht in    Mitleidenschaft   gezogen wird. 



  Die    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl-      Gruppe   selbst kann durch Behandlung mit wässrigen oder wasserhaltigen Lösungen von organischen oder anorganischen Säuren    abgespalten   werden, wobei die    Pep-      tidbindungen   in keiner Weise angegriffen werden. Als besonders vorteilhaft hat sich die Abspaltung der Schutzgruppe durch kurzes Erwärmen mit einer Mischung von Eisessig und Wasser erwiesen. 



  Die als Ausgangsmaterial verwendeten    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoe-      säure-p-nitrophenylester   und    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoe-      säure-2,4,5-trichlorphenylester   werden wie folgt hergestellt: 2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoesäure Man rührt 286 g    3,4,5,6-Tetrachlor-phthalsäure-      anhydrid   mit 1000 cm3 siedendem Isopropanol. Nach 3 Stunden erhält man eine klare Lösung. Das Reaktionsgemisch wird in 4000 cm3 Wasser gegossen, worauf Kristallisation erfolgt. Man filtriert ab und kristallisiert noch aus heissem Benzol um. Man erhält 330 g    2-Carb-      oxyisopropyl-3,4,5,6   tetrachlorbenzoesäure. Smp. 142 . 



  2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6    tetrachlorbenzoesäure-      p-nitrophenylester   [TIP-ONP] Man löst 330 g 2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetra chlorbenzoesäure und 166 g p-Nitrophenol in 2000 cm3 Essigester und versetzt bei -10  mit 242g    Dicyclo-      hexylcarbodiimid.   Man schüttelfit bei 20  während 3 Stunden und filtriert vom Harnstoff ab. Nach Waschen mit wässrigem Natriumcarbonat und verdünnter Phosphorsäure dampft man ein. Man kristallisiert aus    Ätha-      nol   um und erhält 381 g    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-      tetrachlorbenzoesäure-p-nitrophenylester.   Smp. 98 . 



     2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoesäure-      2,4,5-trichlorphenylester   [TIP-OCP] Man löst 330 g    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetra-      chlorbenzoesäure   und 236 g 2,4,5-Trichlorphenol in 2000 cm3 Essigester und versetzt bei -10  mit 242 g Dicyclohexylcarbodiimid. Man schüttelt bei 20  während 3 Stunden und filtriert vom Harnstoff ab. Man dampft ein und kristallisiert aus Dimethylformamid. Man erhält 410 g    2-Carboxy-isopropyl-3,4,5,6-tetra-      chlorbenzoesäure-2,4,5-trichlorphenylester.   Smp.149 . 



  Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben: Abkürzungen TIP- = 2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlor-    benzoyl-      ONP-   =    p-Nitrophenoxy-      OCP-   =    2,4,5-Trichlorphenoxy-      -OTB-   =    -tert.-Butyloxy-      -Arg-   =    -L-arginyl-      -Pro-   =    -L-prdlyl-      -Lys-   =    -L-lysyl-      For   = Formyl Beispiel 1    Na-Carbobenzoxy-N(guanido)-(2-carboxyisopropyl-      3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl)-L-arginin   [CBO-(TIP)

  Arg-OH] Man löst 192 g getrocknetes    Na-Carbobenzoxy-L-      arginin   und 350 g    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoesäure-      p-nitrophenylester   (oder 395 g    2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorben-      zoesäure-2,4,5-trichlorphenylester)   in 600 cm3    Dime-      thylformamid   und versetzt mit 135 ml Triäthylamin. Nach zwei Tagen bei 20  (resp. 50 ) wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester gelöst. Main schüttelt während 5 Std. mit verdünnter, wässriger Phosphorsäure. Das ausgefallene Produkt wird    ab-      fiftriert   und mit Äthyläther gewaschen.

   Man erhält 280 g    N&alpha;-Carbobenzoxy-N(guanido)-(2-carboxy-      isopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl)-L-arginin.   Smp. 180 . [a] D = - 45   in Dimethylformamid. Beispiel 2    N&alpha;-Carbdbenzoxy-N(guanido)-(2-carboxyisopropyl-      3,4,5,6      tetrachlorbenzoyl)-L-arginyl-L-prolin-      tert.-butylester   [CBO-(TIP)Arg-Pro-OTB] Man löst 49 g    N&alpha;

  -Carbobenzoxy-N(guanido)-(2-carboxy-      isopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl)-L-arginin   und 9,3g L-Prolin-tert.-butylester in einem Gemisch von 50 cm3 Dimethylformamid und 150 cm3    Aceto-      nitril   und versetzt bei -10  mit 14,5g    Dicyclohexyl-      carbodiimid.   Man schüttelt zwei Tage bei 0  und filtriert. Man verdampft das    Filtrat   und löst den Rückstand in Essigester auf. Nach Waschen mit verdünnter Phosphorsäure und wässrigem Natriumcarbonat wird das Lösungsmittel verdampft. Man erhält 28 g N&alpha;-Carbobenzoxy-N(guanido)-(2-carboxy-    isopropyl-3,4,5,6-tdtrachlorbenzoyl)-L-arginyl-      L-prolyl-tert.-butylester.   



  Smp. 120  (Zers.). [a] D = - 41   in Dimethylformamid. Beispiel 3    N(Guanido)-(2-carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlor-      benzoyl)-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester   [H-(TIP)Arg-Pro-OTB] Man löst 19 g N&alpha;-Carbobenzoxy-N(guanido)-(2-carboxy-    isopropyl-3,4,5,6-tetrach!l:orbenzoyl)-L-arginyl-      L-pro@in-tert.-butyles'ter   in 600    cm3   Methanol    und      spaltet   die    Carbobenzoxy-      gruppe   durch    Hydrierung   bei Normaldruck    ih   An- 

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 wesenheit eines Palladiumkatalysators ab.

   Man filtriert den Katalysator ab und verdampft das    Methanol.   Nach Trocknen im Hochvakuum erhält man 14 g N(Guanido)-(2-carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl)-L-arginyl-L-prolintert.-butylester als zähflüssiges Öl. [&alpha;] @ =-33  in Dimethylformamid. Beispiel 4 N&alpha;-Carbobenzoxy-N(guanido)-(2-carboxyisopropyl-    3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl)-L-arginyl-N(guanido)-      (2-carboxyisopropyl-3,4,5,      6-tetrachlorbenzoyl)-      L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester   [CBO-(TIP)Arg-(TIP)Arg-Pro-OTB] Man löst 24 g CBO-(TIP)Arg-OH und 19g    H-(TIP)-      Arg-OTB   in einem Gemisch von 50 ml    Dimethylform-      amid   und 300 cm3 Acetonitril und versetzt bei -10  mit 8 g Dicyclohexylcarbodiimid.

   Man schüttelt zwei Tage bei 0  und filtriert. Man verdampft das Filtrat und löst den Rückstand in Essigester auf. Nach Waschen mit verdünnter Phosphorsäure und wässrigem Natriumbicatbonat wird der Essigester verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man    erhält   30 g CBO-(TIP)Arg-(TIP)Arg-Pro-OTB. Smp. 100  (Zers.). [&alpha;] @ = -12  in Dimethylformamid. Beispiel 5 N&alpha;-Carbobenzoxy-N(guanido)-(2-carboxyisopropyl- 3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl)-L-arginyl-N(guanido)-    2-carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl)-      L-arginyl-L-prolin   [CBO-(TIP)Arg-(TIP)Arg-Pro-OH] Man löst 12 g CBO-(TIP)Arg-(TIP)Arg-Pro-OTB in 25 cm-3 Trifluoressigsäure und lässt 2 Std. bei 20  stehen.

   Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in verdünnter Ammoniaklösung aufgenommen und wiederholt mit Äther gewaschen. Anschlie- ssend säuert man die wässrige Phase mit verdünnter Schwefelsäure an und extrahiert mit Essigester. Nach    Verdampfen   des    Lösungsmittels   und    Trocknen   des Rückstands erhält man 9 g    CBO-(TIP)Arg-(TIP)Arg-      Pro-OH.   Smp. l30  (Zers.). [&alpha;] @ -10  in    Dimethyl-      formamid.   



  Beispiel 6 N(Guanido)-(2-carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl)-L-arginyl-N(guanido)-(2-carboxy-    isopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl)-L-arginyl-      L-prolin-Hydrobromid   [H-(TIP)Arg-(TIP)Arg-Pro-OH ³ HBr] Man löst 21 g CBO-(TIP)Arg-(TIP)Arg-Pro-OH in 200 cm3 einer 4n Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig und lässt eine Stunde bei 20  stehen. Nach Zugabe von Äthyläther werden 16g H-(TIP)Arg-(TIP)Arg    Pro-      OH   ³ HBr isoliert.

   Beispiel 7 N&alpha;-Carbobenzoxy-N@-formyd-L-lysyl-N(guanidlo)- (2-carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl)-    L-arginyl-N(guanido)-(2-carboxyisopropyl-      3,4,5,6-tetrachlorbenzoyl)-L-arginyl-L-prolin   [CBO-(For)Lys-(TIP)Arg-(TIP)Arg-Pro-OH] a) Man löst 41 g    H-(TIP)Arg-(TIP)Arg-Pro-      OH   ³ HBr und 20 g    N&alpha;-Carbobenzoxy-N@-formyl-L-      lysin   - p - nitrophenylester [CBO - (For) Lys - ONP] in 250 cm3 Dimethylformamid und versetzt mit 30 cm3 Triäthylamin. Man lässt zwei Tage bei 20  stehen und gibt 2000 cm3 verdünnte Essigsäure zu. Das ausgefallene Reaktionsprodukt wird in verdünnter Ammoniaklösung gelöst und mit Äther gewaschen. Nach Ansäuern mit verdünnter Schwefelsäurelösung extrahiert man mit einer Mischung Essigester/n.Butanol 1 : 1.

   Man, trocknet über Natriumsulfat und fällt mit Äther aus. Man erhält nach Filtrieren und Trocknen 48 g    CBO-(For)Lys-(TIP)-      Arg-(TIP)Arg-Pro-OH.   Smp. 120  (Zeus.). [&alpha;]D=-3,1  in Dimethylformamid. 



  b) Man löst 31g    N&alpha;-Carbobenzoxy-N@-formyl-L-      lysin   [CBO-(Far)Lys-OH] und 14 cm3 Triäthylamin in 150 cm3 Chloroform, kühlt auf -10 , versetzt mit 9,5 cm3 Chlorameisensäureäthylester und, nach 10 Min., mit einer Lösung von 87 g    H-(TIP)Arg-(TIP)Arg-Pro-      OH   ³ HBr und 30 cm3 Triäthylamin in 150 ml    Dime-      thylformamid.   Man verfährt wie unter a weiter und erhält 95g CBO-(For)Lys-(TIP)Ärg-(TIP)Arg-Pro-OH von    gleichen      Eigenschaften   wie unter a.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Arginin enthaltenden Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, dass man die Guanidinogruppe des Arginins während der zur Herstellung der Peptidkette notwendigen Reaktionsstufen durch einen 2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorben- zoyl-Rest schützt. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man den 2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6- tetrachlorbenzoyl-Rest durch Behandlung von Argnin bzw. eines Arginin enthaltenden Peptids, dessen α- Aminogruppe geschützt ist, mit 2-Carboxyisopropyl- 3,4,5,6 - tetrachlorbenzoesäure - p-nitrophenylester, einführt. 2.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man den 2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6- tetrachlorbenzoyl-Rest durch Behandlung von Arginin bzw. eines Arginin enthaltenden Peptids, dessen a- Aminogruppe geschützt ist, mit 2-Carboxyisopropyl-3,4,5,6-tetrachlorbenzoe- säure-2,4,5 trichlorphenyllester, einführt.