Verfahren zur Reinigung von Ferrimycin Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Ver fahren zur Herstellung von reinen wasserlöslichen Salzen des Ferrimycins.
In den Schweizer Patenten Nr. 359 840 und Nr. 374 146 ist die Herstellung eines neuen wasserlös lichen Antibiotikums aus S. griseoflavus A 9578 bzw. S. galilaeus A 18 822 beschrieben. Dieses Antibiotikum wird im folgenden Ferrimycin genannt und gehört zu den Sideramycinen, einer Gattung von eisenhaltigen oder eisenbindenden Antibiotika, zu der auch die Anti biotika Grisein, Albomycin und A 1787 zu zählen sind.
Die Sideramycine zeichnen sich dadurch aus, dass ihre antibiotische Wirksamkeit durch die Ferrioxamine anta- gonisiert wird.
Ferrimycin und seine Komponenten sind rotbraune, basische Substanzen, die gut löslich sind in Säuren und stark polaren Lösungsmitteln, wie Wasser, Methanol, Dimethylformamid, Glykol, Methylcellosolve. Weiter lösen sie sich in Benzylalkohol, in Phenolen oder in Ge mischen von Phenolen mit Lipoidlösungsmitteln. Sie be stehen aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff und enthalten im weiteren Eisen oder besitzen die Fähigkeit, Eisen zu binden.
Das Ferrimycin ist ein Gemisch nahe verwandter Verbindungen, das aus zwei Hauptkomponenten, dem Ferrimycin A und dem Fer- rimycin B, besteht. Das Ferrimycin A selbst lässt sich wiederum in die zwei Komponenten Ferrimycin A 1 und Ferrimycin A 2 auftrennen. Die Eigenschaften dieser verschiedenen Komponenten werden weiter unten an gegeben.
Bisher war es nicht gelungen, Ferrimycin oder die genannten Komponenten in reiner Form darzustellen. Die besondere Schwierigkeit der Reindarstellung der Ferrimycine beruht vor allem darauf, dass sie in sehr geringer Menge neben grossen Mengen von inaktiven Nährlösungssubstanzen und Fermentationsprodukten mit sehr ähnlichen physikalisch-chemischen Eigenschaf ten im Kulturfiltrat vorliegen. Das Kulturfiltrat enthält durchschnittlich auf 1 Teil Ferrimycin 10 000 bis 15 000 Gewichtsteile inaktiver Substanzen, die ebenso wie die Ferrirnycine hydrophil :sind.
Eine Erschwerung der Anreicherung und Reindarstellung -der Ferrimycine wird auch durch ihre Instabilität in einem grossen pH- Bereich verursacht. Eine Auftrennung des Antibiotikums in die einzelnen Komponenten wird weiter dadurch er schwert,
dass diese selbst in chromatographisch günsti- gen Lösungsmitteisystemen nur einen kleinen Unter schied in den RF-Werten aufweisen.
Es wurde nun gefunden, dass man reine wasserlös liche Salze von Ferrimycin herstellen kann, wenn man rohes Ferrimycin unter Zusatz von Säure einer Gegen stromverteilung unter Verwendung von Benzylalkohol unterwirft. Das so erhältliche Produkt lässt sich durch Chromatographie weiter reinigen bzw. in die Kompo nenten A1 und A2 zerlegen.
Für die Gegenstromverteilung werden beispielsweise die folgenden Systeme verwendet: Benzylalkohol @(60 Gew.-Teile) - Methylisobutylketon (44 Gew.-Teile) - wässrige, 15prozentige Natrium chloridlösung<B>(</B>50 Gew.-Teile) - 0;01 n.-Salzsäure (50 Gew.-Teile);
Benzylalkohol (66 Gew.-Teile) - Methylisobutylketon (33 Gew.-Teile) - wässrige, 5prozentige Natriumchlorid- lösung (50 Gew.-Teile) - 0;01 n-Salzsäure (5Q Gew.- Tele).
Gut geeignet ist auch das System Benzylalkohol (200 Vol.-Teile) n-Butanol (100 Vol.-Teile) - Wasser (300 Vol.-Teile) - gesättigte, wässrige Natriumchloridiösung (60 Vol.-Teile) - 1 n Salzsäure (6 Vol.-Teile). Hierbei wird der Wirkstoff in die zwei Komponenten Ferrimyein A und Ferrimycin B aufgeteilt.
Bei der Chromatographie werden als Adsorbentien vorzugsweise stark saure Ionenaustauscherharze, wie z. B. das unter dem Markennamen Dowex 50-WX, bekannte Produkt, verwendet. Als Elutionsmittel wer den vorteilhafterweise saure Pufferlösungen von stei gender Konzentration verwendet, wie z. B. Ammonium acetatpuffer vom pH 4,6 in einer Konzentration von 0,2 bis 2,0 molar.
Zur Aufteilung in die Komponenten A1 und A2 ist die Verteilungschromatographie an Cellulose im System n-Butanol-1/2 n Essigsäure gut geeignet.
Die so erhältlichen Salze besitzen gegenüber dem loyphylisierten Kulturfiltrat eine 10-20 000fache Akti vität, während die als Ausgangsmaterial verwendeten Produkte nur eine 100-1000fache Aktivität im Vergleich zum lyophylisierten Kulturfiltrat aufweisen.
Sie zeigen ferner folgende chemische und physikalische Eigen schaften: Mikroanalyse: C: 48,65 0/0, H: 7,09 0/a, N: 12,95 %, Fe: 4,56 0/a, Cl: 6,10 %, (C)CH,:
1,99 0/0 (Roth- Kuhn), Amino-N: 2,33 0/0 (Van Slyke) Titration: pKm*cs [Helv. 37, 1872 (1954)]: 4,18;
7,88 Äquivalentgewicht: 1106 <I>Absorptionsspektrum:</I> Am" 228 mg, E i 5m 282 319 rau, E i /o 28,2 Am", 425 m,u, E i #m <B>22,6</B> Reduktionswert nach C. S. Hanes, Biochem. J. 23, 99 (1929); 1,7 ml l!100 n Natriumthiosulfat <I>Gebundenes</I> Hydroxylamin nach T. Emery und J. B.
Neilands, Nature 184, 1632 (1959): 0,83 Mol NH20H pro Atom Fe Das Infrarot-Spektrum (in Kaliumbromid) ist in Fig. 1 wiedergegeben.
Das gereinigte Ferrimycin A ist sehr gut löslich in Wasser, Methanol und Phenol-Chloroformgemischen, löslich in Dimethylformamid, Methylcellosolve, Benzyl- alkohol und Eisessig, schwer löslich in Äthanol und praktisch unlöslich in Pyridin, Propanol, Butanol und den üblichen organischen Lösungsmitteln, insbesondere Lipoidlösungsmitteln. Es ist aus wässriger Lösung mit Pikrinsäure,
Pikrolonsäure und Ammoniumreineckat fäll bar. Orangerot gefärbte, wässrige Lösungen verändern bei Zugabe von Mineralsäure ihre Farbe reversibel über weinrot nach hellgelb. Mit Natronlauge tritt ebenfalls Entfärbung ein. Neutrale Lösungen reagieren mit Kaliumferrocyanid nicht. Angesäuert Lösungen geben Färbungen oder Fällungen von Berlinerblau. Das im dreiwertigen Zustand komplex gebundene Eisen wird somit bei abnehmendem pH-Wert in Freiheit gesetzt.
Mit Eisen-(III)-chlorid entsteht eine weinrote Fär bung, mit Eisen-(III)-chlorid + Kalium-Eisen-(III)- cyanid eine Blaufärbung. Folgende Teste sind negativ: Molisch, Anthron, Folin-Ciocalteu, Sakaguchi. Die Nin- hydrinreaktion in Butanol-Pyridin wird erst nach länge rem Erhitzen schwach positiv.
Hydrolyse mit 6 n Salz säure liefert ein Gemisch von ca. 15 papierchromato- graphisch nachweisbaren, teilweise ninhydrinpositiven Substanzen. Unter diesen konnten die folgenden Ver bindungen identifiziert werden:
Bernsteinsäure, 1-Amino- 5-hydroxylamino-pentan, 8-Amino-valeriansäure, Cada- verin, Ammoniak, Prolin, eine kristalline Substanz (C,H$03N. HCl) mit Am.. 227 und 323 mt@ und Ferri- chlorid.
Das gereinigte Ferrimycin A lässt sich chromato- graphisch weiter in die Komponenten A1 und A2 zer legen. Als Adsorbens wird vorzugsweise Cellulose be nützt, als Fliessmittel schwach angesäuertes n-Butanol.
Die Komponenten A1 und A2 sind folgendermassen charakterisiert: A1 (Dihydrochlorid) : Die Elementaranalyse (nach Trocknen während 72 Std. bei 20 /104 mm über P205 liefert: C = 47,63 %; H = 6,72 %; Fe (color.) _ 4,88 %;
Titration in 80 % Methylcellosolve; Äquiva- lentgewicht: 1078; pK = 7,87. Das Ultraviolett-Spek- trum zeigt Maxima bei 229 m,u (E "!I1= 336), 319 mu (E i /m = 37) und 425 m,u <B>(EI</B> = 27,6).
Das Infrarot-Spektrum (in Kaliumbromid) ist in Fig. 2 wiedergegeben.
A2 (Dihydrochlorid) : Die Elementaranalyse (nach Trocknen wie oben) ergibt: C = 48,77 %; H = 6,65 %; Fe (color.) = 4,82 %;
Titration in 80 % Methylcello- solve; Äquivalentgewicht: 984.; pK = 7,73. Das Ultra violett-Spektrum zeigt Maxima bei <I>227</I> my (E i lm = 332), 319 mg (E i = 37) und 425 m,y <B>(EI</B> "io = 25).
lem Das Infrarot-Spektrum (in Kaliumbromid) ist in Fig. 3 wiedergegeben.
In Fig. 5 sind die Ultraviolett-Spektren (in Wasser: c = 5 x 10-3) des gereinigten Ferrimycins A (Kurve 1, Extinktion E = A) und der Komponenten A2 (Kurve 2, E = A - 0,1) und A1 (Kurve 3, E = A - 0,2) wieder gegeben.
Auf papierchromatographischem Wege lassen sich die Ferrimycine eindeutig von Griesein [F. A. Kuehl, M. N. Bishop, L. Chaiet und K. Folkers, Am. Soc. 73, <B>1770</B> (1951)], Albomycin [G. F. Gause, Brit. Med. J. 1955, 1177] und A 1787 [H. Thrum, Naturwiss. 44, 561 (1957)] unterscheiden.
Im System n-Butanol-Eis- essibWasser 4:1:5 (vgl. Fig. 4) befinden sich diese Antibiotika nach zehnstündiger Laufzeit noch nahezu am Startpunkt. Der Nachweis erfolgt bioautographisch mit Staphylococcus aureus.
Das gereinigte Ferrimycin A reagiert mit 8-Oxy- chinolin in Methanollösung unter Ausscheidung eines schwarz gefärbten kristallinen Niederschlages von Oxy- chinolin-Eisen. Aus der Lösung lässt sich das eisen freie Ferrimycin A als gelblich gefärbtes Pulver iso lieren. Es besitzt 1/3 der in vitro Aktivität des Aus gangsmaterials und zeigt, abgesehen vom Fehlen der Eisen-Bande bei 425RTI ID="0002.0231" WI="6" HE="4" LX="1528" LY="1794"> my, das gleiche Absorptions spektrum wie Ferrimycin A.
Bei Zugabe von Eisen- (III)-chlorid wird die spezifische in vitro Aktivität ver doppelt und die rote Farbe und die Eisenabsorption bei 425 mcj zurückerhalten.
In der folgenden Tabelle sind die in vitro Aktivi täten der gereinigten Ferrimycin-Präparate zusammen gestellt. Aufgeführt sind die in mm gemessenen Hemm zonendurchmesser, die im Agrarplattentest mit Papier rondellen von 6 mm Durchmesser bei Imprägnierung mit 0,1%igen Lösungen erhalten wurden.
EMI0002.0247
Stamm <SEP> Ferrymi- <SEP> Ferrymi- <SEP> Ferrymi cin <SEP> A <SEP> ein <SEP> A <SEP> 1 <SEP> ein <SEP> A <SEP> 2
<tb> Staph. <SEP> aur. <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 26,5
<tb> Strepto. <SEP> faec. <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 9,5
<tb> Esch.
<SEP> coli <SEP> 10,5 <SEP> 10,5 <SEP> 11
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 13,5 <SEP> 14 <SEP> 14
<tb> Klebs. <SEP> typ. <SEP> A <SEP> 23* <SEP> 22,5* <SEP> 22,5*
<tb> Past. <SEP> pestis <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> Bac. <SEP> megatherium <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 20
<tb> Ustilago <SEP> sphaerogena <SEP> 28 <SEP> - <SEP> Ustilago <SEP> scabiosae <SEP> 24 <SEP> - <SEP> *Verschleierte <SEP> Hemmzonen Die Plattentest-Hemmzonendurchmesser hochgerei nigter Präparate waren über einen grossen Verdünnungs bereich linear abhängig vom Logarithmus der Anti- biotikumkonzentration. Ueber die an infizierten Mäusen erhaltenen in vivo Aktivitäten einiger
Ferrimycin-Präparate gibt die fol gende Tabelle eine Uebersicht:
EMI0003.0008
Präparat <SEP> Organismus <SEP> Dosis <SEP> pro <SEP> kg <SEP> Maus <SEP> % <SEP> Ueber s. <SEP> c. <SEP> = <SEP> subkutan <SEP> lebende
<tb> p. <SEP> o. <SEP> = <SEP> per <SEP> os
<tb> Angereichertes <SEP> Staph. <SEP> aur. <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 50
<tb> Ausgangsmaterial <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 3,3 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 75-83
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 0,1 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 67
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 0,01 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 0
<tb> <B>5X330</B> <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 75
<tb> <B><I>5x100</I></B> <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 50
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 33 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o.
<SEP> 100
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 85
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 3,3 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 25
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 0
<tb> Strept. <SEP> haem. <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 50
<tb> 5 <SEP> X <SEP> 3,3 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 87
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 0,1 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 54
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 0,01 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 0
<tb> <B>5X330</B> <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 100
<tb> <B><I>5x100</I></B> <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 33 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 75
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 67-75
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 3,3 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 75
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o.
<SEP> 17-27
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 0,1 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 0
<tb> Pneurnococ. <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 50
<tb> Typ. <SEP> III <SEP> 5 <SEP> X <SEP> 3,3 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> X <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 75-83
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 0,1 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 75
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 33 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 67-100
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 3,3 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 50
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 0,1 <SEP> mg <SEP> p. <SEP> o. <SEP> 0
<tb> Ferrimycin <SEP> A <SEP> Staph. <SEP> aur. <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 0,1 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> e. <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 0,05 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 80
<tb> Ferrimycin <SEP> A1 <SEP> Staph.
<SEP> aur. <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 0,06 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 80
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 0,03 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 80
<tb> Ferrimycin <SEP> A2 <SEP> Staph. <SEP> aur. <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 0,06 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> x <SEP> 0,03 <SEP> mg <SEP> s. <SEP> c. <SEP> 60 Die als Ausgangsmaterial benützten Ferrimycin- Präparate werden aus Kulturfiltraten, welche das Anti biotikum enthalten, durch die üblichen Aufarbeitungs- und Anreicherungsmethoden erhalten. So kann man beispielsweise, wie in den Patentschriften Nr. 359 840 und Nr. 374 146 beschrieben, das rohe Antibiotikum aus dem Kulturfiltrat durch Adsorption, z.
B. an Aktiv kohle oder an einem Ionenaustauscherharz, oder durch Fällung mittels einer organischen Säure, wie z. B. Pikrin- säure, abtrennen. Eine Anreicherung des Antibiotikums lässt sich beispielsweise durch Extraktion einer wässrigen Lösung mit einer Mischung von Chloroform oder an deren Lipoidlösungsmitteln mit Phenol oder auch durch Chromatographie oder Gegenstromverteilung erzielen.
Kulturfiltrate, welche die Ferrimycine enthalten, werden beispielsweise erhalten, wenn man den Stamm Streptomyces griseoflavus A 9578 (vgl. Pat. Nr. 359 840) oder den Stamm Streptomyces galileus n. sp. A 18 822 (vgl- Pat. Nr. 374 146) in üblicher Weise in einer Nähr lösung züchtet.
Eine vorteilhafte Verfahrensweise der Aufarbeitung des Kulturfiltrates besteht darin, dass man das Anti biotikum bei pH 4 aus Kulturfiltraten im Säulenverfah ren an IRC-50 adsorbiert, nach Waschen mit Wasser und Methanol durch Methanol-1 n Salzsäure (8:2) eluiert und aus den auf pH 4 gestellten Eluaten, nach Abtreiben des Methanols im Vakuum, vermittels Phenol-Chloro- form (1:1) unter Abtrennung aller mineralischen Be standteile extrahiert.
Aus den mit Celite geklärten Phenolextrakten lässt es sich durch Zugabe von Lipoid- lösungsmitieln auf Trägerstoffe, wie Hyflo , Super cel oder Cellulosepulver, ausfällen und mittels Meth anol eluieren. Man kann die Ferrimycine aber auch direkt aus den von Methanol befreiten Eluaten durch Zugabe von wässrigem Phenol auf Hyflo ausfällen und durch Waschen von organischen und anorganischen Begleitstoffen befreien.
Aus dem Hyflo lassen sich die Ferrimycine mittels Methanol wieder eluieren. Aus den Methanolkonzentraten erhält man das Antibiotikum beim schonenden Eindampfen in Form eines braun schwarzen Pulvers.
Dieses Präparat oder direkt das auf Trägerstoffe niedergeschlagene Material wird in fein pulverisierter Form in konzentrierten Phenol-Chloroform-Gemischen gelöst und nach Zusatz von Filterhilfsmitteln unter star kem Rühren langsam mit Chloroform versetzt, bis ein Phenol-Chloroform-Verhältnis von 1 g : 11 m1 erreicht wird.
Aus dem resultierenden Gemenge lässt sich das Antibiotikum, nach Abtrennung eines inaktiven Nie derschlages, in 1/10 n Salzsäure aufnehmen, aus dieser in angereicherter Form mit Phenol-Chloroform (1:1) zurückextrahieren und schliesslich aus dem Phenol auszug durch Zugabe von Chloroform-Petrolätherge- mischen wiederum auf Cellulose oder Filterhilfsmittel ausfällen. Die Fällungen werden mit Methanol eluiert und das Eluat schonend eingedampft.
Die erhaltenen Präparate dienen als Ausgangsmaterial für die eingangs beschriebenen Anreicherungs- und Auftrennungsver- fahren.
Im nachfolgenden Beispiel sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
<I>Beispiel</I> 6 g eines Ferrimycinpräparates, das bezogen auf das loyphilisierte Kulturfiltrat eine ca. 1000fache antibio tische Aktivität besitzt und sowohl Ferrimycin A als auch Ferrimycin B enthält, wird über 115 Stufen nach Craig gegenstromverteilt. Die Apparatur besteht aus 120 Einheiten.
Sie wird pro Einheit beschickt mit 100 cm' oberer und 100 cm3 unterer Phase eines bei 190 äquilibrierten Gemisches von Benzylalkohol (200 Volumteile), n-Butanol (100 Volumteile), 1 n Salzsäure (6 Volumteile), Wasser (300 Volumteile) und bei 19 gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung (60 Volum- teile). Die ersten 2 Einheiten enthalten lediglich Lö sungsmittel.
In den folgenden 3 Einheiten werden je 2 g Substanz eingetragen und hierauf 115mal bei 19 verteilt. Die Zahl der Schüttelbewegungen pro Verteilung beträgt 30, die Zeitdauer der Ruhepausen 15 Min.
Nach beendigter Verteilung werden die erhaltenen 118 Fraktionen bei -10 aufgehoben. Aus jeder dritten Fraktion entnimmt man zum Zwecke der Testierung 10 cm3 oberer und 10 cm3 unterer Phase und schüttelt diese mit 50 cm3 Petroläther. Die abgetrennte wässrige Phase (10 cm3), die nun das gesamte hydrophile Mate rial enthält, wird durch kurzes Evakuieren von noch anhaftenden organischen Lösungsmitteln befreit.
Die so gewonnenen Testlösungen dienen einerseits zur kolo- rimetrischen Auswertung (Extinktion bei 425 mA in 1 cm Kuvetten. Vergleiche Fig. 6, Kurve 1) und für die Ninhydrinfarbreaktion. Für die Ausführung der letzteren werden 0,5 m3 Testlösung und 0,5 m3 Ninhydrinreagens, zubereitet nach Vorschrift von S .Moore und W. H.
Stein, J. Biol. Chem. 211, 907 (1954), gemischt, 15 Mi nuten auf 100 erhitzt, mit 5 cm' Alkoholwasser (1:1) verdünnt und hierauf im Spektrophotometer bei 570 m,u gemessen (Kurve 2). Für die biologische Testierung werden die Testlösungen 1:50 verdünnt.
In Kurve 3 sind die im Plattendiffusionstest in bezug auf einen will- kürlichen Standard erhaltenen in vitro Aktivitäten gegen Staphylococcus aureus aufgeführt. Die aktiven Frak tionen 40-70 enthalten, wie sich papierchromatogra- phisch zeigen lässt, Ferrimycin A,
während sich das Ferrimycin B in den Fraktionen 75-100 befindet. Es kann eine wesentliche Anreicherung erreicht werden. Die antibiotisch aktiven Fraktionen 25-39, 40-48, 49-55, 56-70 und 71-95 werden vereinigt und mit dem gleichen Volumen Petroläther geschüttelt. Die rot ge- färbten Inhaltsstoffe werden dabei in die wässrigen Phasen getrieben.
Aus diesen werden sie in der bereits geschilderten Weise mit Phenol-Chloroform isoliert. Die dabei erhaltenen Mengen sowie die in bezug auf das Ausgangsmaterial erzielten Anreicherungen und Aus beuten an antibiotischer Aktivität sind nachfolgend tabellarisch zusammengefasst.
EMI0004.0117
Menge <SEP> Anreiche- <SEP> Aktivitäts- <SEP> Ferrimy Fr<U>ak</U>t<U>ion <SEP> in <SEP> m</U>g <SEP> run<U>gsfaktor <SEP> ausbeute <SEP> ein</U>
<tb> 25-39 <SEP> 492 <SEP> 0,55 <SEP> 4,6%
<tb> 40-4.8 <SEP> . <SEP> 254 <SEP> 4,77 <SEP> 20,40/0 <SEP> A
<tb> 49-.55 <SEP> 211 <SEP> 9,22 <SEP> <B>32,811/0</B>
<tb> 56-70 <SEP> 257 <SEP> 3,49 <SEP> 15,10/0
<tb> 71-95 <SEP> 938 <SEP> <B>1</B>,72 <SEP> 27,21/o <SEP> B Das Ausgangsmaterial wird wie folgt erhalten:
30 Liter eines wässrigen Eluatkonzentrates, das ge- mäss Beispiel 7 von Patent Nr. 374 146 durch Elution des Ferrimycins aus Amberlite IRC 50 und an- schliessende Entfernung des Methanols im Vakuum ge wonnen wird, versetzt man unter Rühren mit 1 kg Hyflo und innerhalb 2 Stunden mit 1,8 Liter einer Mischung von 11 Teilen Phenol und 1 Teil Wasser.
Anschliessend lässt man noch 1/2 Stunde rühren, worauf abgenutscht wird. Das Filtrat enthält ca. 2-5 % der Aktivität und wird verworfen. Der gut ausgepresste Fil terkuchen wird zweimal mit je 4 Liter Äther und ein mal mit einer Mischung von 8 Liter Aceton und 2 Liter Aktivität und wird verworfen.
Der gut ausgepresste Filter kuchen wird zweimal mit je 4 Liter Äther und einmal mit einer Mischung von ± Liter Aceton und 2 Liter Äther ver rührt und jeweils abgenutscht, worauf der Rückstand dann nacheinander auf der Nutsche mit je 5 Liter Aceton und 4 Liter Chloroform gewaschen wird. Alle Wasch lösungen sind praktisch inaktiv. Der chloroformfeuchte Filterkuchen wird hierauf unter Rühren in 3 Liter einer Mischung Phenol-Chloroform 1:1 (Gew.-Vol.) einge- getragen und 1 Stunde gerührt.
Dann werden innerhalb 1 Stunde 15 Liter Chloroform in gleichmässigem Strom zugegeben. Das Hyflo wird abgenutscht und zweimal mit 2 Liter Phenol-Chloroform 1:11 (Gew.-Vol.) und einmal mit 2 Liter Chloroform ausgewaschen. Der Rückstand enthält noch 5-10 % der Aktivität.
Die vereinigten aktiven Filtrate (22 Liter) werden bis<B>25'</B> auf 4 Liter konzentriert und das Konzentrat innerhalb 30 Minuten in eine Mischung von 4 Liter Äther, 8 Liter Petroläther und 400 g Hyflo einge tropft. Nach weiteren 30 Minuten wird abgenutscht. Der Filterkuchen wird mit 2 Liter Äther und zweimal mit 1 Liter Aceton ausgewaschen. Alle Filtrate enthal ten nur Spuren an Aktivität.
Der Filterkuchen wird dreimal während 10 Minuten mit je 1,5 Liter Methanol verrührt, abgenutscht und zum Schluss noch mit 0,5 Liter Methanol auf der Nutsche nachgewaschen. Das ausgewaschene Hyflo enthält keine Aktivität mehr.
Die dunkelbraunen Filtrate (4-4,5 Liter) werden bei 20-30 am Wasserstrahlvakuum schonend zur Trockne eingedampft. Man trocknet den noch klebrigen Rückstand im Hochvakuum während 20 Stunden. Es resultieren 75-88 g eines rotbraunen, stark aktiven Ferrimycin-Präparates. Die Aktivitätsausbeute, bezogen auf das Ausgangsmaterial, beträgt 90 0/0.
Die erhaltenen Ferrimycinsalze können wie folgt weiter gereinigt werden: a) 2 g des erhaltenen Ferrimycin A-Präparates (Fraktionen 49-55), das, bezogen auf das lyophilisierte Kulturfiltrat, eine ca.
9000fache antibiotische Wirksam keit besitzt, werden an einer 70 cm x 7,14 cm2-Säule eines stark sauren Ionenaustauschers Dowex 50 WX2 (100/200 mesh) chromatographiert. Der Ionenaustau- scher wird vorgängig nach Vorschrift von Hirs et a1, J.
Biol. Chem. 219, 623 (1956) gereinigt und nach Überführung in die Ammonium-Form während 3 Tagen mit 0,2 m Ammoniumacetatpuffer von pH 4,50 bei 17 bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 100 cm3/h äquilibriert. Hierauf wird die Substanz in 20 cm3 Puffer lösung gelöst,
vorsichtig auf die Säule aufgetragen und anschliessend mit derselben Pufferlösung und Durch laufgeschwindigkeit eluiert. Nach einer Elutionsdauer von 20 Stunden wird auf Gradientelution umgestellt. Da bei wird der in die Säule eintretende 0,2 m Ammonium acetatpuffer in einer 1 Liter Mischkammer durch einen gleich grossen Zufluss von 2 m Ammoniumacetatpuffer von pH 4,50 kontinuierlich aufkonzentriert und damit in seiner Elutionswirkung kontinuierlich verstärkt.
Das Eluat wird in Fraktionen zu 40 cm3 auf einem auto matischen Fraktionensarnmler aufgefangen. Die Aus wertung des Chromatogrammes erfolgt durch Extink- tionsmessung bei 425 mu, Papierchromatographie und biologische Testierung. Die gemäss dieser Auswertung zusammengefassten Fraktionen werden in der geschil derten Weise mit Phenol-Chloroform aufgearbeitet.
Aus den Fraktionen 195-216 erhält man 440 mg Ferrimy- cin A, das in bezug auf das lyophilisierte Kulturfiltrat eine ca. 16 000fache antibiotische Aktivität aufweist, als braunrotes Pulver.
Mikroanalyse: C: 48,65 %, H: 7,09 0/a, N: 12,95 0/a, Fe: 4,56 %, Cl: 6,10 0/0, (C)CH": 1,99 0/0 (Roth- Kuhn), Amino-N:
2,33 0/0 (Van Slyke) Titration: pKMcs [Helv. 37, 1872 (1954)]: 4,18; 7,88 Äquivalentgewicht: 1106 <I>Absorptionsspektrum:</I> Amax 228 mg, E<B>I%</B> @ 282 Am." 319 mg, Ei-1 m 28,2 Am". 425 mg, E',',/m- 22,6 <I> Reduktionswert </I> nach C.
S. Hanes, Biochem. J. 23, 99 (1929); 1,7 m11/100 n Natriumthiosulfat/mg <I>Gebundenes</I> Hydroxylamin nach T. Emery und J. B.
Neilands, Nature 184, 1632 (1959): 0,83 Mol NI-120H pro Atom Fe <I>Hydrolyse</I> mit 6 n HCl 14 Std. bei 110 : nachgewiesene, bzw. isolierte Produkte:
NH3, Cadaverin, 1-Amino-5-hydroxyl-aminopen- tan, a-Aminovaleriansäure, Prolin, Bernstein säure, krist. Substanz (C@H80gN. HCl) mit dm"" 227 und 323 mg, sowie Spuren von weiteren nin- hydrinpositiven Substanzen und FeCl,
Aus den Fraktionen 115-145 des Chromatogramms können noch 135 mg eines Gemisches von violettrot gefärbten Stoffen, die Vitamin-B"-Wirksamkeit aufwei sen, isoliert werden. Der Rest des eingesetzten Materials befindet sich als braungefärbte Bande an der Auftrag stelle des Chromatogramms und wird unter den ange gebenen Bedingungen nicht eluiert.
b) 800 mg des erhaltenen Ferrimycin-A-Präparates werden an einer Cellulosesäule von 3 x 65 cm (198 g) bei 12 chromatographiert. Als Fliessmittel dient die organische Phase eines äquilibrierten Gemisches von 0,5 m Essigsäure-n-Butanol (1:
1) nach Zusatz von 5 Vol.-% n-Butanol. Die im automatischen Fraktionen- sammler aufgefangenen Fraktionen zu 30-40 ml wer den biologisch, spektroskopisch und papierchromato- graphisch untersucht.
Die Fraktionen 60-104 enthalten 191 mg Ferrimycin Al, die Fraktionen 105-200 92 mg Ferrimycin A2. Die entsprechend vereinigten Fraktionen werden mit dem gleichen Volumen Petroläther und mit ca. 10 Vol.-% Wasser geschüttelt, wobei die antibioti- schen Stoffe in die wässrigen Phasen getrieben werden.
Aus diesen werden sie nach der im Beispiel beschriebe nen Methode mit Phenol-Chloroform aufgearbeitet und in Form orangegefärbter Pulver erhalten. Die bei 20 /0,001 nun während 3 Tagen getrockneten Präparate ergeben folgende Daten:
Ferrimycin A1: Analyse: C = 47,63 %; H = 6,72 %; Fe = 4,88 %; Titration in 80 % Methylcellosolve; Äquivalentgewicht: 1078;
pK: 7,87. Ultraviolett-Spek- trum:
EMI0005.0183
Infrarot-Spektrum in Kaliumbromid: vgl. Fig. 2.
Ferrimycin A2: Analyse: C = 48,77 %; H = 6,65 %; Fe = 4,82 %; Titration in 80 % Methylcellosolve; Äquivalentgewicht: 984;
pK: 7,73. Ultraviolett-Spek- trum:
EMI0005.0211
Infrarot-Spektrum (in Kaliumbromid): vgl. Fig. 3. Die Papierchromatographie von verschiedenen angereicher ten und gereinigten Ferrimycin-Präparaten auf What- man Nr. 1-Papier ist in Fig. 4 dargestellt.
Der Nach weis erfolgt bioautographisch mit Staphylococcus aureus. Es bedeuten: I: System Butanol-Eisessig-Wasser 4:1:5: 10 Stunden. II: System Butanol-Butylacetat-Eisessig-Wasser 100:30:13:143: 24 Stunden.
III: System Butanol-Butylacetat-Eisessig-Wasser 100:30:13:143: 60 Stunden.
1: Antibiotikum Ferrimycin, Base A+B, nach Schweiz. Patent Nr. 374 146 (Beispiel 7) (1 gg).
2: Antibiotikum Ferrimycin B, nach obgenanntem Patent (Beispiel 10) (5 icg).
3:. Antibiotikum Ferrimycin A, nach vorliegendem Bei spiel (0,1gg).
4: Antibiotikum Ferrimycin A,, nach vorliegendem Beispiel sub a) (0,05,ug).
5: Antibiotikum Ferrimycin A2, nach vorliegendem Beispiel sub a) (0,05 ssg).