Verfahren zur Herstellung von Polypeptidmaterial
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz, welche die Widerstandsfähigkeit gegen Infektionen steigert.
Es ist bekannt, dass gewisse Hefepräparate bei parenteraler Injektion die Widerstandsfähigkeit des menschlichen Körpers gegen Infektionen steigern, und es wurde viel Arbeit über die antikomplementäre Wirkung von Wandmaterial der Hefezellen in Verbindung mit dem Protein Properdin geleistet. Der Antikomplementärfaktor Zymosan, ein praktisch protein-und koh tenhydratfreies wasserunlösliches Wandmaterial von Hefezellen, ist der wichtigste derartige Wirkstoff. Es zeigte sich, dass dessein Schutzwirkung m erster Linie auf solche Effekte zurückzuführen ist, wie die Stimulierung der Phagocytose und die antigene Wirkung.
Das Pro dukt ist ein kompliziertes Gemisch von Lipiden, Prote- inen, PoMysacchariden usw. und übt bei Injektion eine pyrogene Wirkung aus. Infolge seiner pyrogenen und antigenen Wirkungen ist die Verwendung dieser Substanz als Arzneimittel mit bedeutenden Nachteilen verbunden.
Es konnte nun aus dem Zellenwandmaterial von Hefepilzen ein Faktor isoliert werden, welcher eine nichtspezifische Schutzwirkung gegen Infektionen aufweist und dabei nichtpyrogen, nichtantigen und wasserlöslich ist. Dieser neue Faktor kann infolgedessen in der Medizin verwendet werden, um nichtspezifische Immunität ohne unerwünschte Nebenwirkungen hervorzurufen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des praktisch nichtpyrogenen, nichtantigenen fluores zierenden Faktors, der ein Polypeptidmaterial ist, ist dadurch gekennzeichnet, dass man wasserunlösliches Zellwandmaterial von Hefezellen sauer oder alkalisch digeriert, die erhaltene wasserlösliche Fraktion vom Unlöslichen abtrennt und das Polypeptidmaterial aus der wasserlöslichen Fraktion gewinnt.
Das Verfahrensprodukt ist ein Polypeptid oder eine Mischung verschiedener Polypeptide, wobei diese Bezeichnung alle Stoffe mit einer Polypeptidstruktur um fal3t, unabhängig davon, ob weitere Gruppen, z. B.
Kohlenhydratreste, zugegen sind oder nicht.
Der aktive Faktor befindet sich in der Zellwand der Hefepilze in unlöslicher Form, und es ist zweckmä- ssig, ein Zellwandmaterial zu verwenden, das nach einer Lysis, z. B. durch Waschen mit Wasser, von Proteinen, wasserlöslichen Kohlenwasserstoffen usw. befreit wurde.
Es ist auch vorteilhaft, das Zellwandmaterial vor dem Waschen mit Wasser mit einem proteolytischen Enzym, z. B. mit Trypsin oder Papain, zu behandeln, um sonst unlösliche Proteine zu entfernen. Man kann auch vor dem Digerieren noch einen Reinigungsschritt einschalten, und zwar ein Waschen mit einem Alkohol, z. B. mit Athanol oder Methanol, vorzugsweise mit 95 Sigem wässrigem Athanol.
Ein besonders bevorzugtes Ausgangsmaterial ist Zymosan. Dieses ist ein Antikomplementärfaktor aus Hefezellwänden, der praktisch frei von wasserlöslichen Proteinen und Kohlenhydraten ist.
Zymosan wird meistens derart hergestellt, dass man Hefe, z. B. Backhefe, einer Lysiis unterwirft, z. B. mit einer siedenden wässrigen Lösung von Dinatriumphosphat, und dann die unlöslichen Zelltrümmer mit einem proteolytischen Enzym, z. B. Trypsin, meistens in Gegenwart von Toluol, inkubiert. Diese Behandlung erfolgt in der Regel bei 37 C und dauert etwa 16 Tage.
Das Material wird dann mit warmem Wasser und endlich mit 95 % igem Athanol gut ausgewaschen. Ein Herstellungsverfahren von Zymosan ist durch Pillemer et. al., J. Exp. Medicine, 103, 1956, 1, beschrieben.
Wird beim erfindungsgemässen Verfahren sauer digeriert, so verwendet man zweckmässig eine schwache Säure, z. B. eine Fettsäure, wie Essigsäure oder Propionsäure, oder noch besser ein Mono-oder Diphenol. Besonders gut hat sich die Verwendung von 90-bis 100% igem Phenol bewährt.
Wird die Digestion mit Phenol durchgeführt, ist das Produkt oft in Säuren unlöslich, da es in zu hochmolekularer Form vorliegt. Werden andere Säuren zur Digestion verwendet, ist das freigelegte Polypeptid unlöslich, bis die Säure neutralisiert wird, oder bis ein weiterer Abbau zu niedermolekularen Formen stattfindet. Alkäische Digeriecstoffe umfassen verdünnte Laugen, Ammoniumhydroxyd, Alkalicarbonate usw., zweckmä13ig in 0, 05-0, 5n Konzentration.
Der wasserlösliche Wirkstoff kann. von der restli- chen wasserlöslichen Zellenwandsubstanz z. B. durch Zentrifugieren, Filtrieren abgetrennt werden und aus der Lösung kann der feste Wirkstoff z. B. durch Eindampfen, Gefriertrocknung oder Ausfällen gewonnen werden. Wurde zum Digerieren Phenol verwendet, so kann man das Produkt mit einer nichtpolaren Flüssigkeit, z. B. mit Ather oder einem Kohlenwasserstoff, zweckmässig mit Diäthyläther, ausfällen. Man gibt die phenolische Lösung zweckmässig zu einer Zwei-Phasenmischung aus Diäthyläther und Wasser, wobei sich in der wässrigen Phase ein Niederschlag bildet. Diesen kann man reinigen, indem man ihn durch Zugabe von Ammoniak in Lösung bringt, mit einem unmischbaren Lösungsmittel, z.
B. Ather, die letzten Phenolspuren extrahiert und den aktiven Faktor durch Gefriertrock- nen isoliert.
Man kann den wasserlöslichen Faktor in mancher Weise in reiner Form gewinnen. Man kann z. B. niedermolekulare Verunreinigungen durch Dialyse, Ul- trafiltration usw. entfernen oder vorzugsweise eine Lö sungderwasserlöslichenFraktion mit einem Molekularsieb behandeln. Ein besonders brauchbares, in Teilchenform vorliegendes Molekularsieb ist das unter der Bezeichnung Sephadex G50p durch A. B. Pharmacia in Uppsala in Verkehr gebrachte, mit Athylenoxyd vernetzte Dextran. Das Molekularsieb adsorbiert die niedermolekularen Beimengungen und lässt das aktive Poly peptidmaterial unadsorbiert.
Man verwendet zweckmä- ssig ein Molekularsieb, welches für Stoffe mit einem 1000, vorzugsweise 8000, übersteigenden Molekulargewicht undurchlässig ist. Man lässt dabei eine wässrige Lösung der wasserlöslichen Fraktion über eine Säule aus vernetztem Dextran laufen, welches die niedermole- kularen Verunreinigungen zurückhält, und die erste durch die Säule gelaufene Fraktion enthält den Wirkstoff in gereinigter Form. Man kann ihn durch die Säule mit einer verdünnten alkalischen Lösung wie 0, 05-0, 5 Alkali, z. B. 0, 1 n Natronlauge, waschen.
Es ist vorteilhaft, wenn man das vernetzte Dextran vor Gebrauch mit einem Alkalimetallsalz in Berührung bringt, dessen Anion man auswäscht. Die zu behandelnde Lösung enthält zweckmässigeinen Elektrolyten, am besten den gleichen, mit welchem das Dextran vorbehandelt wurde.
Das Verfahrensprodukt hat sauren Charakter und kann auf einem schwach basischen Cellulose-Ionenaus- tauscher adsorbiert werden. Beispiele solcher Austauscher werden durch Peterson & Sober, J. A. C. S., 751, 1956 beschrieben und stellen Cellulosederivate dar, die ein oder mehr Amino-, Dialkylamino-oder Dialkylaminoalkylgruppen tragen. Besonders brauchbar sind Dimethylaminoäthyl-cellulose und das Reaktionsprodukt von Epichlorhydrin, Triäthanolamin und Natriumcellulose. Nach der Adsorption wird der Austauscher von nichtadsorbiertenVerunreinigungenbefreitund der adsorbierte Stoff eluiert. Zur Elution verwendet man zweckmässig eine schwach alkalische Lösung, z.
B. eine 0, 05- bis 2, On Alkali-, Carbonat-oder Ammoniumhydroxydlösung oder eine neurale Salzlösung, z. B. die wässrige Lösung eines Alkalimetallhalogenids wie Koch- salz. Die Lösung ist mit einem Phosphatpuffer auf pH 7 gepuffert. Der Ionenaustauscher ist zweckmässig auch zwischen pH 6 und 10, vorzugsweise zwischen pH 6, 5 und 8, 5, gepuffert, und die zu behandelnde Lösung ist gleichfalls auf die gleiche Wasserstoffionenkonzentration gepuffert. Die zu behandelnde Lösung enthält zweckmässig 1-2 Gew. % an festen Stoffen gelöst.
Eine andere brauchbare Reindarstellungsmethode besteht darin, dass man das aktive Polypeptidmaterial auf einem Stoff adsorbieren lässt, welcher hochmolekulare Stoff selektiv adsorbiert, z. B. auf einem komplexen Silikat, wie Asbest, Bentonit, Montmorillonit oder Celit. Nach der Adsorption werden die Verunreinigungen ausgewaschen und der adsorbierte Stoff eluiert.
Asbest ist ein besonders wirksames Adsorptionsmittel und adsorbiert den Wirkstoff aus schwach saurer oder neutraler Lösung, zwischen pH 4 und 7, vorzugsweise 5-6. Zur Elution kann man basische Flüssigkeiten verwenden, z. B. verdünnte Laugen, Ammoniak oder Carbonate oder Phenole. Der Eluant kann auch eine Lösung mit hohem Elektrolytgehalt sein, z. B. eine wässrige Kochsalzlösung.
Man kann der wässrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion ein Proteinfällungsmittel zusetzen und mit diesem das Reaktionsprodukt fällen. Als Proteinfällungs- mittel kommen in Frage Ammoniumsalze, z. B. Chlorid oder Sulfat oder Phosphorwolframsäure. Man kann diese Mittel in fester Form oder in Lösung zusetzen.
Das durch das Proteinfällungsmittel ausgefällte Polypeptidmaterial kann man z. B. abfiltrieren, zentrifugie- ren oder in einer besonderen organischen Phase aufnehmen lassen. Diese kann eine mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit sein, oder zweckmässiger eine polare Flüssigkeit, die im allgemeinen wasserlöslich ist, aber neben der wässrigen Lösung des Proteinfällungsmittels eine besondere Phase bildet. Solche polaren Flüssigkei- ten lösen das Polypeptidmaterial besser als die nichtpolaren.
Bei einer Ausführungsart gibt man das Proteinfällungsmittel zu einer wässrigen Lösung, welche die wasserlösliche Fraktion und eine wasserlösliche Flüssigkeit gelöst enthält. Es bilden n sich zwei Phasen, von denen man die organische Phase abtrennt und aus ihr das Reinprodulçt gewinub.
Die Acidität der wässrigen Lösung beeinflusst im allgemeinen die Trennung, und man muss die Menge des Fällungsmittels dem pH der Lösung anpassen. Die optimale Fällungsmittelkonzentration hängt auch von der wasserlöslichen organischen Flüssigkeit, z. B. Atha- nol oder Aceton, ab.
Wird Ammoniumsulfat verwendet, ist die optimale Salzkonzentration im allgemeinen 25-60 % der Sättigung und man arbeitet zweckmässig bei pH 5 bis 8. Bei Verwendung einer wasserlöslichen organischen Flüs- sigkeit, z. B. Athanol, liegt deren Menge zweckmässig zwischen 30 und 60% der wässrigen Phase, und die Menge des Ammoniumsulfates und der organischen Flüssigkeit werden derart aufeinander abgestimmt, dass sich zwei Phasen bilden. So kann z. B. die Konzentration an Ammoniumsulfat 25 Gew. % betragen, wenn man eine 46 % ige Athanolkonzentration verwendet.
Man setzt möglichst so wenig organische Flüssigkeit zu, dass das Volumen der organischen Phase klein wird und daher das Polypeptidmaterial in hoher Kon zentration enthält. Ber Verwendung von Athanol scheiden sich geringere Mengen von Verunreinigungen aus, die vor Zugabe des anorganischen Salzes entfernt werden m ssen.
Die Zugabe des Proteinfällungsmittels erfolgt zweck- mässig bei Zimmertemperatur, und die oben angegebe- nen Konzentrationen gelten nicht immer für höhere Temperaturen. Da aber das Polypeptidmaterial bis etwa 90 C beständig ist, kann es auch bei erhöhter Temperatur ohne Desaktivierung gefällt werden.
Das erfindungsgemäss erhältliche neue Polypeptidmaterial löst sich in Wasser und verdünnten Alkalien mit gelbgrüner Fluoreszenz. Es ist von saurer Natur und schützt gegen Infektionen, ohne praktisch pyrogen oder antigen zu sein. Es enthält eine verhältnismässig geringe Anzahl von Aminosäuren, und zwar Glutamin- säure, Asparaginsäure, Arganin, Lysin, Histidin, Glycin, Serin, Prolin, Alanin, Valin, Tyrosin, Thereonin, Phenylalanin, Leucin und iso-Leucin. Methionin und Cystein sind nicht vorhanden. Das Produkt gibt eine positive Biuret-Reaktion in einer Trockengewichtsbasis von 80-90% im Vergleich zu Albumin. Es enthält 12% Stickstoff und etwa 2 % Hexose, bestimmt mit Anthron.
Es färbt an mit Amidoschwarz. Die Papierelektro phoresemitVemnalpufferbet pH 8, 7 zeigt, dass es eine negative Ladung hat. Es ist bis etwa 100 C hitzebeständig. Im Gegensatz zu ähnlichen Stoffen, die aus Leber oder Blut gewonnen werden können, scheidet sich das durch phenolische Extraktion aus Zymosan gewonnene Produkt in saurer Lösung aus. Es wird demgemäss auch durch Sulfosalicylsäure gefällt. Das durch phenolische Extraktion aus Penicillin-Mycelium gewonnene Produkt ist hingegen in wässrigen Säuren löslich und wird auch von Sulfosalicylsäure nicht gefällt. Das gesamte Material wird aber, wie oben gesagt, von Phosphorwolframsäure oder einer halbgesättigten Ammoniumsulfatlösung gefällt.
Die biologischen Eigenschaften des neuen Polypeptidmaterials erhellen aus folgenden Versuchen : Hemmen der Kernteilung (Mitose) :
Das Material verhindert die Mitose von Hela-Zellen, die in Puckschem Medium einer Konzentration von 0, 75 mg/ml gezüchtet werden. 0, 33 mg/ml erzeugen eine Hemmung von 50 %. Schutz gegen Vaccinia Virus. a) Hühnerembryo
Verwendete Menge je Hühnerembryo 3, 3 mg lebend tot Reaktion auf die
Chlorion-allatois-Membrane
70 50 108
70 ¯berlebende aus 120
Kontrollversuch lebend tot
26 82 260 26 Überlebende aus 108 b) Kaninchenhaut in die Kaninchenhaut injizierte Menge
22 mg ***
40 mg **
66 mg **
200 mg
Kontrolle ****
Schutz von Mäusen gegen Infektion durch E. coli
Bakterielle Infektion: 1,25 X 108 Organismen pro Maus.
Vor der Infektion wurden 0,2 mg Polypeptidmaterial intraperitonal injiziert. tjberlebende/Gesamtzahl
Mäuse
Injektion 24 Stunden vor der Infektion 6/18
Injektion 6 Stunden vor der Infektion 5/18
Kontrolle 0/18
Toxizität
Vier Kaninchen erhielten intravenös je 10 mg Material injiziert. Es zeigten sich keine Vergiftungssymptome.
Wie schon gesagt, ist das Produkt praktisch nicht pyrogen und zeigt praktisch keine antigene Wirkung.
Injiziert erzeugt es Immunität gegen Vaccina Virus, E. coli und eine grosse Anzahl von anderen Bakterien und Viren und erzeugt eine Widerstandsfähigkeit gegen den Schnupfenvirus, wenn man es direkt auf die Nasenschleimhaut sprüht.
Das Produkt kann in üblicher Weise mit einem oder mehreren pharmaceutischen Excipienten in verschiedene Verwendungsformen gebracht werden. Diese können in Form von Einheitsdosierungen vorliegen, die etwa 5 bis 20 mg Polypeptidmaterial enthalten.
Das Mittel kann z. B. parenteral oder oral verabfolgt werden, zu welch letzterem Zweck man vorzugsweise Tabletten verwendet. Bei einer bevorzugten Zubereitungsart wird eine Lösung des Produkts gefriergetrocknet, in sterilem, pyrogenfreiem Wasser gelöst und mittels Durchleitung durch Glasfritte sterilisiert.
Der Wirkstoff kann auch in Präparate für topische Verwendung eingearbeitet werden, z. B. in eine wässrige Lösung für Einsprühen in die Nase, zweckmässig ein Konservierungsmittel, wie Athanol oder Methyloder Athyl-p-oxybenzoat enthaltend. Die Sprühlösung kann 0, 01 bis 10 Gew. %, vorzugsweise 0, 05 bis 0, 5%, Wirkstoff enthalten.
Beispiel 1 a) 0, 2 g Zymosan (L. Light & Co. Ltd., England ; Fleischmann-Typ A, aus frischer Hefe) werden zu 25 ml 90 % igem Phenol zugesetzt und 2 Tage bei 37 C gehalten. Ungelöstes Material wird durch Zentrifugieren entfernt und der Rückstand mit 5ml 90 %igem Phenol gewaschen. Der Phenolextrakt wird zu 150 ml Ather und 150 ml Wasser zugefügt und in einem Trenntrichter geschüttelt. Die wässrige Schicht enthält einen Niederschlag. Man setzt 2n NH3 zu der wässrigen Schicht hinzu und bringt den grössten Teil des ungelösten Materials in Lösung. Zwecks Entfernung von Phenolspuren wird die Lösung mit Ather extrahiert und gefriergetrocknet.
Man erhält so 17 mg eines weissen Feststoffes. b) Der gemäss a) erhaltene Feststoff zeigt bei Inji- zierung in vier Kaninchen in einer Dosis. von 0, 1 mg/ Kaninchen den folgenden maximalen Temperaturan- stieg : 0, 7, 0, 6, 0, 9, 0, 3 C, woraus ersichtlich ist, dass die Substanz eine vernachlässigbare Pyrogenität aufweist.
Der gemäss a) erhaltene Feststoff erzeugt keine antigene Reaktion, wie man durch den Hauttost feststellen kann, wenn er Menschen in einer Dosis von 0, 1 mg verabreicht wird. c) Schutz gegen E. coli-Infektion in der Maus.
Der gemäss a) erhaltene Feststoff erzeugt einen Schutz, der durch die folgenden Zahlen gezeigt wird :
Bakterielle Infektionsdosis : 1, 25 X 108 Organismen pro Maus. 0, 016 mg des in die Maus intraperitonal injizierten Feststoffes. Einer Gruppe von sechs Mäu- sen wurde der Feststoff drei Stunden vor der bakteriel- len Infektion verabreicht und einer anderen Gruppe 6 Stunden vor der Infektion, wobei sechs infiziecte Mäuse als Vergleich dienten. tJberlebende/tote Mäuse
Vergleich 1/6
3 Stunden vor der Infektion 5/6
6 Stunden vor der Infektion 3/6 d) Schutz gegen Vaccinia-Virus.
Der gemäss a) erhaltene Wirkstoff schützt Huhner- embryos gegen Vaccinia-Virus.
Verd nnung Erhaltene Phenolfraktion
Vergleich
Vaccinia aus Zymosan 104 einige separate zahlreiche Kolonien
Kolonien 10 tote und
10 lebende und 2 lebende
2 tote Tiere
Beispiel 2 Digerierung von Zymosan mit NaOH.
1 g Zymosan wird bei Zimmertemperatur mit 100 ml 0, ln NaOH 24 Stunden ger hrt. Die überstew hende Flüssigkeit neutralisiert man mit 3n HC1 auf pH 7, 5, konzentriert im Vakuum auf 20 ml und filtriert. Die Lösung gibt man auf eine Sephadex -Säule (2, 8 cm Durchmesser, 32, 5 cm Höhe, mit 0, 3 % Tricresol enthaltendem Wasser ins Gleichgewicht gebracht) und wäscht die Säule mit 0, 3 % Tricresol enthaltendem Wasser. Fraktionen von 5, 8 ml werden gesammelt.
Die ersten 13 Fraktionen werden gesammelt, im Vakuum konzentriert, der pH-Wert mit 0, 1n NaOH auf 7, 5 eingestellt, die Lösung filtriert und gefriergetrocknet. Das farblose Material wiegt 55 mg. In Lösung im Ultraviolettlicht entwickelt es eine gelbgrüne Fluoreszenz.
Process for making polypeptide material
The invention relates to a method for producing a substance which increases the resistance to infections.
It is known that certain yeast preparations, when injected parenterally, increase the human body's resistance to infection, and much work has been done on the anticomplementary effects of yeast cell wall material in connection with the protein properdin. The anti-complementary factor zymosan, a water-insoluble wall material of yeast cells that is practically free of protein and carbon hydrates, is the most important active ingredient of this type. It was found that its protective effect is primarily due to effects such as the stimulation of phagocytosis and the antigenic effect.
The product is a complicated mixture of lipids, proteins, polysaccharides etc. and has a pyrogenic effect when injected. As a result of its pyrogenic and antigenic effects, the use of this substance as a pharmaceutical is associated with significant disadvantages.
It has now been possible to isolate a factor from the cell wall material of yeast which has a non-specific protective effect against infections and is non-pyrogenic, non-antigenic and water-soluble. This new factor can therefore be used in medicine to induce non-specific immunity without undesirable side effects.
The inventive method for producing the practically non-pyrogenic, non-antigenic fluorescent factor, which is a polypeptide material, is characterized in that water-insoluble cell wall material of yeast cells is digested under acidic or alkaline conditions, the water-soluble fraction obtained is separated from the insoluble and the polypeptide material is obtained from the water-soluble fraction.
The product of the process is a polypeptide or a mixture of different polypeptides, this designation covering all substances with a polypeptide structure, regardless of whether other groups, e.g. B.
Carbohydrate residues, are present or not.
The active factor is in insoluble form in the cell wall of the yeast, and it is expedient to use a cell wall material which, after lysis, e.g. B. by washing with water, was freed from proteins, water-soluble hydrocarbons, etc.
It is also advantageous to coat the cell wall material with a proteolytic enzyme, e.g. B. with trypsin or papain to treat to remove otherwise insoluble proteins. You can also switch on a cleaning step before digestion, namely a washing with an alcohol, z. B. with ethanol or methanol, preferably with 95% aqueous ethanol.
A particularly preferred starting material is zymosan. This is an anti-complementary factor from yeast cell walls that is practically free of water-soluble proteins and carbohydrates.
Zymosan is usually made in such a way that yeast, e.g. B. baker's yeast, subject to a Lysiis, e.g. B. with a boiling aqueous solution of disodium phosphate, and then the insoluble cell debris with a proteolytic enzyme, e.g. B. trypsin, usually in the presence of toluene, incubated. This treatment is usually done at 37 C and lasts about 16 days.
The material is then thoroughly washed out with warm water and finally with 95% ethanol. A manufacturing method of zymosan is by Pillemer et. al., J. Exp. Medicine, 103, 1956, 1.
If the process according to the invention is acidic digested, it is expedient to use a weak acid, e.g. B. a fatty acid such as acetic acid or propionic acid, or even better a mono- or diphenol. The use of 90 to 100% phenol has proven particularly effective.
If the digestion is carried out with phenol, the product is often insoluble in acids because it is in a form that is too high in molecular weight. When other acids are used for digestion, the exposed polypeptide will be insoluble until the acid is neutralized or until further degradation to low molecular weight forms occurs. Alkaline chemicals include dilute lyes, ammonium hydroxide, alkali carbonates, etc., expediently in 0.05-0.5n concentration.
The water-soluble active ingredient can. of the remaining water-soluble cell wall substance z. B. be separated by centrifugation, filtration and from the solution, the solid active ingredient z. B. obtained by evaporation, freeze drying or precipitation. If phenol was used for digestion, the product can be mixed with a non-polar liquid, e.g. B. with ether or a hydrocarbon, conveniently with diethyl ether, precipitate. The phenolic solution is expediently added to a two-phase mixture of diethyl ether and water, a precipitate forming in the aqueous phase. This can be cleaned by bringing it into solution by adding ammonia, with an immiscible solvent, e.g.
B. ether, the last traces of phenol extracted and the active factor isolated by freeze-drying.
There are many ways in which the water-soluble factor can be obtained in pure form. You can z. B. remove low molecular weight impurities by dialysis, ultrafiltration, etc. or, preferably, treat a solution of the water-soluble fraction with a molecular sieve. A particularly useful molecular sieve in particulate form is dextran crosslinked with ethylene oxide and marketed by A. B. Pharmacia in Uppsala under the name Sephadex G50p. The molecular sieve adsorbs the low molecular weight impurities and leaves the active polypeptide material unadsorbed.
A molecular sieve is expediently used which is impermeable to substances with a molecular weight exceeding 1000, preferably 8000. An aqueous solution of the water-soluble fraction is allowed to run over a column of crosslinked dextran, which retains the low molecular weight impurities, and the first fraction that has passed through the column contains the active ingredient in purified form. You can pass it through the column with a dilute alkaline solution such as 0.05-0.5 alkali, e.g. B. 0.1 N sodium hydroxide solution, wash.
It is advantageous if the crosslinked dextran is brought into contact with an alkali metal salt, the anion of which is washed out, before use. The solution to be treated conveniently contains an electrolyte, preferably the same with which the dextran was pretreated.
The process product has an acidic character and can be adsorbed on a weakly basic cellulose ion exchanger. Examples of such exchangers are described by Peterson & Sober, J.A.C.S., 751, 1956 and represent cellulose derivatives which carry one or more amino, dialkylamino or dialkylaminoalkyl groups. Dimethylaminoethyl cellulose and the reaction product of epichlorohydrin, triethanolamine and sodium cellulose are particularly useful. After the adsorption, the exchanger is freed from unadsorbed impurities and the adsorbed substance is eluted. A weakly alkaline solution, e.g.
B. a 0.05 to 2, On alkali, carbonate or ammonium hydroxide solution or a neural salt solution, e.g. B. the aqueous solution of an alkali metal halide such as common salt. The solution is buffered to pH 7 with a phosphate buffer. The ion exchanger is expediently also buffered between pH 6 and 10, preferably between pH 6.5 and 8.5, and the solution to be treated is also buffered to the same hydrogen ion concentration. The solution to be treated expediently contains 1-2% by weight dissolved solids.
Another useful purification method is to allow the active polypeptide material to be adsorbed onto a substance which selectively adsorbs high molecular weight substance, e.g. B. on a complex silicate such as asbestos, bentonite, montmorillonite or celite. After adsorption, the impurities are washed out and the adsorbed substance is eluted.
Asbestos is a particularly effective adsorbent and adsorbs the active ingredient from weakly acidic or neutral solution, between pH 4 and 7, preferably 5-6. Basic liquids can be used for elution, e.g. B. dilute alkalis, ammonia or carbonates or phenols. The eluant can also be a solution with a high electrolyte content, e.g. B. an aqueous saline solution.
A protein precipitating agent can be added to the aqueous solution of the water-soluble fraction and the reaction product can be precipitated with this. Suitable protein precipitants are ammonium salts, e.g. B. chloride or sulfate or phosphotungstic acid. You can add these agents in solid form or in solution.
The polypeptide material precipitated by the protein precipitating agent can be e.g. B. filter off, centrifuge or absorb in a special organic phase. This can be a water-immiscible liquid, or more expediently a polar liquid which is generally water-soluble, but forms a special phase in addition to the aqueous solution of the protein precipitating agent. Such polar liquids dissolve the polypeptide material better than the non-polar liquids.
In one embodiment, the protein precipitating agent is added to an aqueous solution containing the water-soluble fraction and a water-soluble liquid in dissolved form. Two phases are formed from which the organic phase is separated off and the pure product is obtained from it.
The acidity of the aqueous solution generally affects the separation, and the amount of precipitant must be adapted to the pH of the solution. The optimal concentration of precipitant also depends on the water-soluble organic liquid, e.g. B. ethanol or acetone, from.
If ammonium sulfate is used, the optimal salt concentration is generally 25-60% of saturation and it is advisable to work at pH 5 to 8. When using a water-soluble organic liquid, e.g. B. ethanol, the amount of which is advantageously between 30 and 60% of the aqueous phase, and the amount of ammonium sulfate and the organic liquid are matched to one another in such a way that two phases are formed. So z. B. the concentration of ammonium sulfate 25 wt.% If a 46% ethanol concentration is used.
As little organic liquid as possible is added that the volume of the organic phase becomes small and therefore contains the polypeptide material in a high concentration. When using ethanol, smaller amounts of impurities are deposited, which must be removed before the inorganic salt is added.
The protein precipitating agent is expediently added at room temperature, and the concentrations given above do not always apply to higher temperatures. However, since the polypeptide material is stable up to about 90 C, it can be precipitated without deactivation even at elevated temperatures.
The novel polypeptide material obtainable according to the invention dissolves in water and dilute alkalis with yellow-green fluorescence. It is acidic in nature and protects against infection without being practically pyrogenic or antigenic. It contains a relatively small number of amino acids, namely glutamic acid, aspartic acid, arganine, lysine, histidine, glycine, serine, proline, alanine, valine, tyrosine, thereonine, phenylalanine, leucine and iso-leucine. Methionine and cysteine are absent. The product gives a positive biuret response on a dry weight basis of 80-90% compared to albumin. It contains 12% nitrogen and about 2% hexose, determined with anthrone.
It stains with amido black. The paper electrophoresis withVemnalbufferbet pH 8, 7 shows that it has a negative charge. It is heat-resistant up to about 100 C. In contrast to similar substances that can be obtained from liver or blood, the product obtained from zymosan by phenolic extraction is precipitated in acidic solution. It is accordingly also precipitated by sulfosalicylic acid. The product obtained by phenolic extraction from penicillin mycelium, on the other hand, is soluble in aqueous acids and is not precipitated by sulfosalicylic acid either. However, as stated above, the entire material is precipitated from phosphotungstic acid or a semi-saturated ammonium sulfate solution.
The biological properties of the new polypeptide material can be seen from the following experiments: Inhibiting nuclear division (mitosis):
The material prevents the mitosis of Hela cells that are grown in Puck's medium at a concentration of 0.75 mg / ml. 0.33 mg / ml produces a 50% inhibition. Protection against vaccinia virus. a) Chicken Embryo
Amount used per chicken embryo 3.3 mg live dead response to the
Chlorion allatois membrane
70 50 108
70 survivors from 120
Control attempt dead alive
26 82 260 26 survivors from 108 b) Rabbit skin Amount injected into rabbit skin
22 mg ***
40 mg **
66 mg **
200 mg
Control ****
Protection of mice against infection by E. coli
Bacterial infection: 1.25 X 108 organisms per mouse.
Before infection, 0.2 mg of polypeptide material was injected intraperitoneally. survivors / total number
Mice
Injection 24 hours before infection 6/18
Injection 6 hours before infection 5/18
Control 0/18
toxicity
Four rabbits were injected intravenously with 10 mg of material each. There were no symptoms of intoxication.
As already said, the product is practically non-pyrogenic and shows practically no antigenic effects.
Injected it creates immunity to vaccina virus, E. coli and a large number of other bacteria and viruses, and creates resistance to the rhinitis virus when sprayed directly on the nasal mucosa.
The product can be put into various forms of use in the usual way with one or more pharmaceutical excipients. These can be in unit dosage form containing about 5 to 20 mg of polypeptide material.
The agent can e.g. B. administered parenterally or orally, for which latter purpose tablets are preferably used. In a preferred type of preparation, a solution of the product is freeze-dried, dissolved in sterile, pyrogen-free water and sterilized by passing it through a glass frit.
The active ingredient can also be incorporated into preparations for topical use, e.g. B. in an aqueous solution for spraying into the nose, expediently containing a preservative such as ethanol or methyl or ethyl p-oxybenzoate. The spray solution can contain 0.01 to 10% by weight, preferably 0.05 to 0.5%, of active ingredient.
Example 1 a) 0.2 g of zymosan (L. Light & Co. Ltd., England; Fleischmann type A, from fresh yeast) are added to 25 ml of 90% phenol and kept at 37 ° C. for 2 days. Undissolved material is removed by centrifugation and the residue is washed with 5 ml of 90% strength phenol. The phenol extract is added to 150 ml of ether and 150 ml of water and shaken in a separatory funnel. The aqueous layer contains a precipitate. Add 2N NH3 to the aqueous layer and bring most of the undissolved material into solution. To remove traces of phenol, the solution is extracted with ether and freeze-dried.
17 mg of a white solid are obtained in this way. b) The solid obtained according to a) shows when injected into four rabbits in one dose. of 0.1 mg / rabbit the following maximum temperature rise: 0, 7, 0, 6, 0, 9, 0, 3 C, from which it can be seen that the substance has negligible pyrogenicity.
The solid obtained according to a) does not produce an antigenic reaction, as can be seen from the skin smell when it is administered to humans in a dose of 0.1 mg. c) Protection against E. coli infection in the mouse.
The solid obtained according to a) produces a protection which is shown by the following numbers:
Bacterial infection dose: 1.25 X 108 organisms per mouse. 0.016 mg of the solid injected intraperitoneally into the mouse. The solid was administered to a group of six mice three hours before the bacterial infection and to another group 6 hours before the infection, with six infected mice being used as a comparison. Surviving / dead mice
Comparison 1/6
3 hours before infection 5/6
6 hours before infection 3/6 d) Protection against vaccinia virus.
The active ingredient obtained according to a) protects chicken embryos against vaccinia virus.
Dilution Phenolic fraction obtained
comparison
Zymosan 104 vaccinia several separate numerous colonies
Colonies 10 dead and
10 living and 2 living
2 dead animals
Example 2 Digestion of Zymosan with NaOH.
1 g of zymosan is stirred at room temperature with 100 ml of 0.1N NaOH for 24 hours. The supernatant liquid is neutralized with 3N HCl to pH 7.5, concentrated in vacuo to 20 ml and filtered. The solution is placed on a Sephadex® column (2.8 cm diameter, 32.5 cm high, equilibrated with water containing 0.3% tricresol) and the column is washed with water containing 0.3% tricresol. Fractions of 5.8 ml are collected.
The first 13 fractions are collected, concentrated in vacuo, the pH is adjusted to 7.5 with 0.1N NaOH, the solution is filtered and freeze-dried. The colorless material weighs 55 mg. In solution in ultraviolet light, it develops a yellow-green fluorescence.