Verfahren zur Herstellung von Polypeptidmaterial
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz, welche die Widerstandsfähigkeit gegen Infektionen steigert.
Es ist bekannt, dass gewisse Hefepräparate bei parenteraler Injektion die Widerstandsfähigkeit des menschlichen Körpers gegen Infektionen steigern, und es wurde viel Arbeit über die antikomplementäre Wirkung von Wandmaterial der Hefezellen in Verbindung mit dem Protein Properdin geleistet. Der Antikomplementärfaktor Zymosan, ein praktisch protein-und koh tenhydratfreies wasserunlösliches Wandmaterial von Hefezellen, ist der wichtigste derartige Wirkstoff. Es zeigte sich, dass dessein Schutzwirkung m erster Linie auf solche Effekte zurückzuführen ist, wie die Stimulierung der Phagocytose und die antigene Wirkung.
Das Pro dukt ist ein kompliziertes Gemisch von Lipiden, Prote- inen, PoMysacchariden usw. und übt bei Injektion eine pyrogene Wirkung aus. Infolge seiner pyrogenen und antigenen Wirkungen ist die Verwendung dieser Substanz als Arzneimittel mit bedeutenden Nachteilen verbunden.
Es konnte nun aus dem Zellenwandmaterial von Hefepilzen ein Faktor isoliert werden, welcher eine nichtspezifische Schutzwirkung gegen Infektionen aufweist und dabei nichtpyrogen, nichtantigen und wasserlöslich ist. Dieser neue Faktor kann infolgedessen in der Medizin verwendet werden, um nichtspezifische Immunität ohne unerwünschte Nebenwirkungen hervorzurufen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des praktisch nichtpyrogenen, nichtantigenen fluores zierenden Faktors, der ein Polypeptidmaterial ist, ist dadurch gekennzeichnet, dass man wasserunlösliches Zellwandmaterial von Hefezellen sauer oder alkalisch digeriert, die erhaltene wasserlösliche Fraktion vom Unlöslichen abtrennt und das Polypeptidmaterial aus der wasserlöslichen Fraktion gewinnt.
Das Verfahrensprodukt ist ein Polypeptid oder eine Mischung verschiedener Polypeptide, wobei diese Bezeichnung alle Stoffe mit einer Polypeptidstruktur um fal3t, unabhängig davon, ob weitere Gruppen, z. B.
Kohlenhydratreste, zugegen sind oder nicht.
Der aktive Faktor befindet sich in der Zellwand der Hefepilze in unlöslicher Form, und es ist zweckmä- ssig, ein Zellwandmaterial zu verwenden, das nach einer Lysis, z. B. durch Waschen mit Wasser, von Proteinen, wasserlöslichen Kohlenwasserstoffen usw. befreit wurde.
Es ist auch vorteilhaft, das Zellwandmaterial vor dem Waschen mit Wasser mit einem proteolytischen Enzym, z. B. mit Trypsin oder Papain, zu behandeln, um sonst unlösliche Proteine zu entfernen. Man kann auch vor dem Digerieren noch einen Reinigungsschritt einschalten, und zwar ein Waschen mit einem Alkohol, z. B. mit Athanol oder Methanol, vorzugsweise mit 95 Sigem wässrigem Athanol.
Ein besonders bevorzugtes Ausgangsmaterial ist Zymosan. Dieses ist ein Antikomplementärfaktor aus Hefezellwänden, der praktisch frei von wasserlöslichen Proteinen und Kohlenhydraten ist.
Zymosan wird meistens derart hergestellt, dass man Hefe, z. B. Backhefe, einer Lysiis unterwirft, z. B. mit einer siedenden wässrigen Lösung von Dinatriumphosphat, und dann die unlöslichen Zelltrümmer mit einem proteolytischen Enzym, z. B. Trypsin, meistens in Gegenwart von Toluol, inkubiert. Diese Behandlung erfolgt in der Regel bei 37 C und dauert etwa 16 Tage.
Das Material wird dann mit warmem Wasser und endlich mit 95 % igem Athanol gut ausgewaschen. Ein Herstellungsverfahren von Zymosan ist durch Pillemer et. al., J. Exp. Medicine, 103, 1956, 1, beschrieben.
Wird beim erfindungsgemässen Verfahren sauer digeriert, so verwendet man zweckmässig eine schwache Säure, z. B. eine Fettsäure, wie Essigsäure oder Propionsäure, oder noch besser ein Mono-oder Diphenol. Besonders gut hat sich die Verwendung von 90-bis 100% igem Phenol bewährt.
Wird die Digestion mit Phenol durchgeführt, ist das Produkt oft in Säuren unlöslich, da es in zu hochmolekularer Form vorliegt. Werden andere Säuren zur Digestion verwendet, ist das freigelegte Polypeptid unlöslich, bis die Säure neutralisiert wird, oder bis ein weiterer Abbau zu niedermolekularen Formen stattfindet. Alkäische Digeriecstoffe umfassen verdünnte Laugen, Ammoniumhydroxyd, Alkalicarbonate usw., zweckmä13ig in 0, 05-0, 5n Konzentration.
Der wasserlösliche Wirkstoff kann. von der restli- chen wasserlöslichen Zellenwandsubstanz z. B. durch Zentrifugieren, Filtrieren abgetrennt werden und aus der Lösung kann der feste Wirkstoff z. B. durch Eindampfen, Gefriertrocknung oder Ausfällen gewonnen werden. Wurde zum Digerieren Phenol verwendet, so kann man das Produkt mit einer nichtpolaren Flüssigkeit, z. B. mit Ather oder einem Kohlenwasserstoff, zweckmässig mit Diäthyläther, ausfällen. Man gibt die phenolische Lösung zweckmässig zu einer Zwei-Phasenmischung aus Diäthyläther und Wasser, wobei sich in der wässrigen Phase ein Niederschlag bildet. Diesen kann man reinigen, indem man ihn durch Zugabe von Ammoniak in Lösung bringt, mit einem unmischbaren Lösungsmittel, z.
B. Ather, die letzten Phenolspuren extrahiert und den aktiven Faktor durch Gefriertrock- nen isoliert.
Man kann den wasserlöslichen Faktor in mancher Weise in reiner Form gewinnen. Man kann z. B. niedermolekulare Verunreinigungen durch Dialyse, Ul- trafiltration usw. entfernen oder vorzugsweise eine Lö sungderwasserlöslichenFraktion mit einem Molekularsieb behandeln. Ein besonders brauchbares, in Teilchenform vorliegendes Molekularsieb ist das unter der Bezeichnung Sephadex G50p durch A. B. Pharmacia in Uppsala in Verkehr gebrachte, mit Athylenoxyd vernetzte Dextran. Das Molekularsieb adsorbiert die niedermolekularen Beimengungen und lässt das aktive Poly peptidmaterial unadsorbiert.
Man verwendet zweckmä- ssig ein Molekularsieb, welches für Stoffe mit einem 1000, vorzugsweise 8000, übersteigenden Molekulargewicht undurchlässig ist. Man lässt dabei eine wässrige Lösung der wasserlöslichen Fraktion über eine Säule aus vernetztem Dextran laufen, welches die niedermole- kularen Verunreinigungen zurückhält, und die erste durch die Säule gelaufene Fraktion enthält den Wirkstoff in gereinigter Form. Man kann ihn durch die Säule mit einer verdünnten alkalischen Lösung wie 0, 05-0, 5 Alkali, z. B. 0, 1 n Natronlauge, waschen.
Es ist vorteilhaft, wenn man das vernetzte Dextran vor Gebrauch mit einem Alkalimetallsalz in Berührung bringt, dessen Anion man auswäscht. Die zu behandelnde Lösung enthält zweckmässigeinen Elektrolyten, am besten den gleichen, mit welchem das Dextran vorbehandelt wurde.
Das Verfahrensprodukt hat sauren Charakter und kann auf einem schwach basischen Cellulose-Ionenaus- tauscher adsorbiert werden. Beispiele solcher Austauscher werden durch Peterson & Sober, J. A. C. S., 751, 1956 beschrieben und stellen Cellulosederivate dar, die ein oder mehr Amino-, Dialkylamino-oder Dialkylaminoalkylgruppen tragen. Besonders brauchbar sind Dimethylaminoäthyl-cellulose und das Reaktionsprodukt von Epichlorhydrin, Triäthanolamin und Natriumcellulose. Nach der Adsorption wird der Austauscher von nichtadsorbiertenVerunreinigungenbefreitund der adsorbierte Stoff eluiert. Zur Elution verwendet man zweckmässig eine schwach alkalische Lösung, z.
B. eine 0, 05- bis 2, On Alkali-, Carbonat-oder Ammoniumhydroxydlösung oder eine neurale Salzlösung, z. B. die wässrige Lösung eines Alkalimetallhalogenids wie Koch- salz. Die Lösung ist mit einem Phosphatpuffer auf pH 7 gepuffert. Der Ionenaustauscher ist zweckmässig auch zwischen pH 6 und 10, vorzugsweise zwischen pH 6, 5 und 8, 5, gepuffert, und die zu behandelnde Lösung ist gleichfalls auf die gleiche Wasserstoffionenkonzentration gepuffert. Die zu behandelnde Lösung enthält zweckmässig 1-2 Gew. % an festen Stoffen gelöst.
Eine andere brauchbare Reindarstellungsmethode besteht darin, dass man das aktive Polypeptidmaterial auf einem Stoff adsorbieren lässt, welcher hochmolekulare Stoff selektiv adsorbiert, z. B. auf einem komplexen Silikat, wie Asbest, Bentonit, Montmorillonit oder Celit. Nach der Adsorption werden die Verunreinigungen ausgewaschen und der adsorbierte Stoff eluiert.
Asbest ist ein besonders wirksames Adsorptionsmittel und adsorbiert den Wirkstoff aus schwach saurer oder neutraler Lösung, zwischen pH 4 und 7, vorzugsweise 5-6. Zur Elution kann man basische Flüssigkeiten verwenden, z. B. verdünnte Laugen, Ammoniak oder Carbonate oder Phenole. Der Eluant kann auch eine Lösung mit hohem Elektrolytgehalt sein, z. B. eine wässrige Kochsalzlösung.
Man kann der wässrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion ein Proteinfällungsmittel zusetzen und mit diesem das Reaktionsprodukt fällen. Als Proteinfällungs- mittel kommen in Frage Ammoniumsalze, z. B. Chlorid oder Sulfat oder Phosphorwolframsäure. Man kann diese Mittel in fester Form oder in Lösung zusetzen.
Das durch das Proteinfällungsmittel ausgefällte Polypeptidmaterial kann man z. B. abfiltrieren, zentrifugie- ren oder in einer besonderen organischen Phase aufnehmen lassen. Diese kann eine mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit sein, oder zweckmässiger eine polare Flüssigkeit, die im allgemeinen wasserlöslich ist, aber neben der wässrigen Lösung des Proteinfällungsmittels eine besondere Phase bildet. Solche polaren Flüssigkei- ten lösen das Polypeptidmaterial besser als die nichtpolaren.
Bei einer Ausführungsart gibt man das Proteinfällungsmittel zu einer wässrigen Lösung, welche die wasserlösliche Fraktion und eine wasserlösliche Flüssigkeit gelöst enthält. Es bilden n sich zwei Phasen, von denen man die organische Phase abtrennt und aus ihr das Reinprodulçt gewinub.
Die Acidität der wässrigen Lösung beeinflusst im allgemeinen die Trennung, und man muss die Menge des Fällungsmittels dem pH der Lösung anpassen. Die optimale Fällungsmittelkonzentration hängt auch von der wasserlöslichen organischen Flüssigkeit, z. B. Atha- nol oder Aceton, ab.
Wird Ammoniumsulfat verwendet, ist die optimale Salzkonzentration im allgemeinen 25-60 % der Sättigung und man arbeitet zweckmässig bei pH 5 bis 8. Bei Verwendung einer wasserlöslichen organischen Flüs- sigkeit, z. B. Athanol, liegt deren Menge zweckmässig zwischen 30 und 60% der wässrigen Phase, und die Menge des Ammoniumsulfates und der organischen Flüssigkeit werden derart aufeinander abgestimmt, dass sich zwei Phasen bilden. So kann z. B. die Konzentration an Ammoniumsulfat 25 Gew. % betragen, wenn man eine 46 % ige Athanolkonzentration verwendet.
Man setzt möglichst so wenig organische Flüssigkeit zu, dass das Volumen der organischen Phase klein wird und daher das Polypeptidmaterial in hoher Kon zentration enthält. Ber Verwendung von Athanol scheiden sich geringere Mengen von Verunreinigungen aus, die vor Zugabe des anorganischen Salzes entfernt werden m ssen.
Die Zugabe des Proteinfällungsmittels erfolgt zweck- mässig bei Zimmertemperatur, und die oben angegebe- nen Konzentrationen gelten nicht immer für höhere Temperaturen. Da aber das Polypeptidmaterial bis etwa 90 C beständig ist, kann es auch bei erhöhter Temperatur ohne Desaktivierung gefällt werden.
Das erfindungsgemäss erhältliche neue Polypeptidmaterial löst sich in Wasser und verdünnten Alkalien mit gelbgrüner Fluoreszenz. Es ist von saurer Natur und schützt gegen Infektionen, ohne praktisch pyrogen oder antigen zu sein. Es enthält eine verhältnismässig geringe Anzahl von Aminosäuren, und zwar Glutamin- säure, Asparaginsäure, Arganin, Lysin, Histidin, Glycin, Serin, Prolin, Alanin, Valin, Tyrosin, Thereonin, Phenylalanin, Leucin und iso-Leucin. Methionin und Cystein sind nicht vorhanden. Das Produkt gibt eine positive Biuret-Reaktion in einer Trockengewichtsbasis von 80-90% im Vergleich zu Albumin. Es enthält 12% Stickstoff und etwa 2 % Hexose, bestimmt mit Anthron.
Es färbt an mit Amidoschwarz. Die Papierelektro phoresemitVemnalpufferbet pH 8, 7 zeigt, dass es eine negative Ladung hat. Es ist bis etwa 100 C hitzebeständig. Im Gegensatz zu ähnlichen Stoffen, die aus Leber oder Blut gewonnen werden können, scheidet sich das durch phenolische Extraktion aus Zymosan gewonnene Produkt in saurer Lösung aus. Es wird demgemäss auch durch Sulfosalicylsäure gefällt. Das durch phenolische Extraktion aus Penicillin-Mycelium gewonnene Produkt ist hingegen in wässrigen Säuren löslich und wird auch von Sulfosalicylsäure nicht gefällt. Das gesamte Material wird aber, wie oben gesagt, von Phosphorwolframsäure oder einer halbgesättigten Ammoniumsulfatlösung gefällt.
Die biologischen Eigenschaften des neuen Polypeptidmaterials erhellen aus folgenden Versuchen : Hemmen der Kernteilung (Mitose) :
Das Material verhindert die Mitose von Hela-Zellen, die in Puckschem Medium einer Konzentration von 0, 75 mg/ml gezüchtet werden. 0, 33 mg/ml erzeugen eine Hemmung von 50 %. Schutz gegen Vaccinia Virus. a) Hühnerembryo
Verwendete Menge je Hühnerembryo 3, 3 mg lebend tot Reaktion auf die
Chlorion-allatois-Membrane
70 50 108
70 ¯berlebende aus 120
Kontrollversuch lebend tot
26 82 260 26 Überlebende aus 108 b) Kaninchenhaut in die Kaninchenhaut injizierte Menge
22 mg ***
40 mg **
66 mg **
200 mg
Kontrolle ****
Schutz von Mäusen gegen Infektion durch E. coli
Bakterielle Infektion: 1,25 X 108 Organismen pro Maus.
Vor der Infektion wurden 0,2 mg Polypeptidmaterial intraperitonal injiziert. tjberlebende/Gesamtzahl
Mäuse
Injektion 24 Stunden vor der Infektion 6/18
Injektion 6 Stunden vor der Infektion 5/18
Kontrolle 0/18
Toxizität
Vier Kaninchen erhielten intravenös je 10 mg Material injiziert. Es zeigten sich keine Vergiftungssymptome.
Wie schon gesagt, ist das Produkt praktisch nicht pyrogen und zeigt praktisch keine antigene Wirkung.
Injiziert erzeugt es Immunität gegen Vaccina Virus, E. coli und eine grosse Anzahl von anderen Bakterien und Viren und erzeugt eine Widerstandsfähigkeit gegen den Schnupfenvirus, wenn man es direkt auf die Nasenschleimhaut sprüht.
Das Produkt kann in üblicher Weise mit einem oder mehreren pharmaceutischen Excipienten in verschiedene Verwendungsformen gebracht werden. Diese können in Form von Einheitsdosierungen vorliegen, die etwa 5 bis 20 mg Polypeptidmaterial enthalten.
Das Mittel kann z. B. parenteral oder oral verabfolgt werden, zu welch letzterem Zweck man vorzugsweise Tabletten verwendet. Bei einer bevorzugten Zubereitungsart wird eine Lösung des Produkts gefriergetrocknet, in sterilem, pyrogenfreiem Wasser gelöst und mittels Durchleitung durch Glasfritte sterilisiert.
Der Wirkstoff kann auch in Präparate für topische Verwendung eingearbeitet werden, z. B. in eine wässrige Lösung für Einsprühen in die Nase, zweckmässig ein Konservierungsmittel, wie Athanol oder Methyloder Athyl-p-oxybenzoat enthaltend. Die Sprühlösung kann 0, 01 bis 10 Gew. %, vorzugsweise 0, 05 bis 0, 5%, Wirkstoff enthalten.
Beispiel 1 a) 0, 2 g Zymosan (L. Light & Co. Ltd., England ; Fleischmann-Typ A, aus frischer Hefe) werden zu 25 ml 90 % igem Phenol zugesetzt und 2 Tage bei 37 C gehalten. Ungelöstes Material wird durch Zentrifugieren entfernt und der Rückstand mit 5ml 90 %igem Phenol gewaschen. Der Phenolextrakt wird zu 150 ml Ather und 150 ml Wasser zugefügt und in einem Trenntrichter geschüttelt. Die wässrige Schicht enthält einen Niederschlag. Man setzt 2n NH3 zu der wässrigen Schicht hinzu und bringt den grössten Teil des ungelösten Materials in Lösung. Zwecks Entfernung von Phenolspuren wird die Lösung mit Ather extrahiert und gefriergetrocknet.
Man erhält so 17 mg eines weissen Feststoffes. b) Der gemäss a) erhaltene Feststoff zeigt bei Inji- zierung in vier Kaninchen in einer Dosis. von 0, 1 mg/ Kaninchen den folgenden maximalen Temperaturan- stieg : 0, 7, 0, 6, 0, 9, 0, 3 C, woraus ersichtlich ist, dass die Substanz eine vernachlässigbare Pyrogenität aufweist.
Der gemäss a) erhaltene Feststoff erzeugt keine antigene Reaktion, wie man durch den Hauttost feststellen kann, wenn er Menschen in einer Dosis von 0, 1 mg verabreicht wird. c) Schutz gegen E. coli-Infektion in der Maus.
Der gemäss a) erhaltene Feststoff erzeugt einen Schutz, der durch die folgenden Zahlen gezeigt wird :
Bakterielle Infektionsdosis : 1, 25 X 108 Organismen pro Maus. 0, 016 mg des in die Maus intraperitonal injizierten Feststoffes. Einer Gruppe von sechs Mäu- sen wurde der Feststoff drei Stunden vor der bakteriel- len Infektion verabreicht und einer anderen Gruppe 6 Stunden vor der Infektion, wobei sechs infiziecte Mäuse als Vergleich dienten. tJberlebende/tote Mäuse
Vergleich 1/6
3 Stunden vor der Infektion 5/6
6 Stunden vor der Infektion 3/6 d) Schutz gegen Vaccinia-Virus.
Der gemäss a) erhaltene Wirkstoff schützt Huhner- embryos gegen Vaccinia-Virus.
Verd nnung Erhaltene Phenolfraktion
Vergleich
Vaccinia aus Zymosan 104 einige separate zahlreiche Kolonien
Kolonien 10 tote und
10 lebende und 2 lebende
2 tote Tiere
Beispiel 2 Digerierung von Zymosan mit NaOH.
1 g Zymosan wird bei Zimmertemperatur mit 100 ml 0, ln NaOH 24 Stunden ger hrt. Die überstew hende Flüssigkeit neutralisiert man mit 3n HC1 auf pH 7, 5, konzentriert im Vakuum auf 20 ml und filtriert. Die Lösung gibt man auf eine Sephadex -Säule (2, 8 cm Durchmesser, 32, 5 cm Höhe, mit 0, 3 % Tricresol enthaltendem Wasser ins Gleichgewicht gebracht) und wäscht die Säule mit 0, 3 % Tricresol enthaltendem Wasser. Fraktionen von 5, 8 ml werden gesammelt.
Die ersten 13 Fraktionen werden gesammelt, im Vakuum konzentriert, der pH-Wert mit 0, 1n NaOH auf 7, 5 eingestellt, die Lösung filtriert und gefriergetrocknet. Das farblose Material wiegt 55 mg. In Lösung im Ultraviolettlicht entwickelt es eine gelbgrüne Fluoreszenz.