CH456039A - Verfahren zur Herstellung protrahiert wirksamer Injektionspräparate - Google Patents

Description

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 Verfahren zur Herstellung protrahiert wirksamer Injektionspräparate Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung stabiler, protrahiert wirksamer Injektionspräparate des Tetracosapeptids L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucylL-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanylL-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysylL-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-    L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-      L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin   in Form einer wässrigen Suspension eines Zinkkomplexes davon, dadurch gekennzeichnet,

   dass man die wässrige Lösung eines Salzes des Tetracosapeptids obiger Formel mit einem saure Gruppen enthaltenden Polysaccharid und eines physiologisch    verträglichen   wasserlöslichen Zinksalzes durch Zugabe eines Alkalimetallhydroxyds oder eines geeigneten Puffers auf einen pH-Wert von 7,2 bis 8,5 bringt. 



  Das Tetracosapeptid L-Seryl-L-tyrosyl-L-seiryl-L-norleucylL-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanylL-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysylL-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-    L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-      L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin   hat strukturelle Ähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz 1 bis 24 des ACTH und besitzt auch dieselben biologischen und therapeutischen Eigenschaften wie das natürliche ACTH (Corticotropin). 



  Nach dem    angegebenen      Verfahren   erhält man eine äusserst stabile Suspension, die nach anschliessender Sterilisierung direkt injizierbar ist. Gegebenenfalls kann das pH der Suspension durch Zusatz eines geeigneten Puffers, z. B. eines Phosphatpuffers, stabilisiert werden. Durch Zusatz von geeigneten Stoffen (z. B. Natriumchlorid, Glucose, Glycerin) kann das Präparat isotonisch gemacht werden. Auch Substanzen, die das Wachstum von Mikroorganismen hemmen, wie z. B. Benzylalkohol, Phenol, Chlorobutanol, können noch zugesetzt werden. Als saure Gruppen enthaltende Poly- saccharide können natürliche Polyuronsäunen (wie z. B. Polygalacturonsäuren, Polymannuronsäuren), saure Mucopolysaccharide (wie z. B.

   Heparin, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat) sowie synthetische oder mikrobiologisch gewonnene saure Gruppen enthaltende Derivate der Cellulose, der Stärke oder anderer Polysaccharide (wie z. B. Carboxymethylcellulose oder Dextransulfat) verwendet werden. Als physiologisch wirksame Zinksalze können Zinkacetat, Zinkchlorid, Zinknitrat und Zinksulfat verwendet werden. Das Verhältnis zwischen Polypeptidsalz und Zinksalz soll vorzugsweise zwischen 10 und 200 mMol Zinksalz pro 100 I. E. Peptidsalz liegen. 



  Das Tetracosapeptid obiger Formel kann nach für die Synthese von Polypeptiden allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der in der obigen Formel    festgelegten   Reihenfolge allein oder nach vorheriger Bildung kleinerer    Peptid-      einheiten   miteinander verknüpft werden. Eine    Synthese-      möglichkeit   des    synthetischen      Peptids   ist am Ende dies Beispiels 1 näher    beschrieben.   



  Es ist bekannt, dass das    natürliche      ACTH   sowie    verschiedene   seiner biologisch aktiven    Teilsequenzen   im Organismus sehr schnell    inaktiviert      werden.   Es    wurde   daher empfohlen, die Wirkung von Injektionslösungen von    Corticobropin   durch Kombination mit Verbindungen gewisser    Schwermetalle   oder durch Kombination mit hochmolekularen    Stoffen   zu verbessern und insbesondere über einen längeren Zeitraum zu erstrecken, doch war der dadurch erreichte Effekt relativ klein. 



  Das    erfindungsgemäss   verwendete    Polypeptid   ist zwar bereits    wesentlich   stabiler als das natürliche    ACTH   oder    dessen   Bruchstücke, wird im    Organismus      jedoch      noch   immer relativ rasch abgebaut. Es wurde nun überraschenderweise gefunden,    d:ass   das    Polypeptid   obiger Formel in    Form   eines Zinkkomplexes eines seiner Salze mit saure Gruppen    enthaltenden      Polysacchariden   bei    einem      pH   von 7,2 bis 8,5 in Form einer    wässrigen   

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 Suspension sehr beständig ist.

   Diese wässrige Suspension besitzt bei parenteraler Applikation am Tier und am Menschen eine wesentlich stärkere protrahierte ACTH-Wirksamkeit als die bereits bisher bekannten ACTH-Depot-Präparate. 



  So wird durch die    erfindungsgemäss   hergestellten Präparate bei i. m. oder s. c. Injektion die Sekretion der Corticosteroide während bedeutend mehr als 24 Stunden stimuliert. Dies bedeutet für die Therapie einen grossen Vorteil, der bisher nicht erreicht werden konnte. Die so erhaltene Suspension ist sehr hitzestabil, was bezüglich Sterilisationsmöglichkeit einen bedeubenden    Vor-      teil   darstellt. 



  Die    verfahrensgemäss      hergestellten   neuen    Präparate   können beispielsweise für die Behandlung der folgenden Erkrankungen verwendet werden: Akuter und chronischer Gelenkrheumatismus, Colitis ulcerosa, Nephrose, Kollagenosen, wie z. B. Lupus erythematodes, Sklerodermie usw., allergische Erkrankungen der verschiedenen Organsysteme, wie Asthma bronchiale, Ekzem, Urticaria, Dermatiis exfolativa, anaphylaktischer Schock usw., Intoxicationen verschiedener Genese, wie z. B. bei chronischem Alkoholismus, Tumoren, wie z. B. Leukämien, Lymphosarcomen, Reticulosarcomen usw., sowie zur Verhinderung der Nebennierenrindenatrophie bei der Therapie mit    Cortico-      steroiden,   Insuffizienzerscheinungen der Hypophyse. 



  Ein wesentlicher Vorteil gegenüber natürlichem, aus tierischem Material extrahiertem Hormon liegt für die Therapie beim    Menschen   auch darin, dass dem neuen Tetracosapeptidkomplex antigene Eigenschaften fehlen. Es kann somit bei den oben erwähnen Erkrankungen auch dann unbedenklich    verwendet      werden,      wenn   beim    Patienten   im Verlauf einer    früheren   Behandlung mit natürlichem ACTH allergische Erscheinungen auftraten. 



  In den für die Standardisierung üblichen und anerkannten Tests besitzt der Tetracosapeptidkomplex im Vergleich zum natürlichen Corticotropin eine sehr hohe Aktivität. 



  Es werden folgende Abkürzungen verwendet: 
 EMI2.15 
 CBO Carbohenzoxy Tri Trityl = Triphenylmethyl (For) Formyl (auf der E-Aninogruppe des Lysins) (Tos) Tosyl = p-Toluolsulfonyl (auf der Guanidogruppe des Arginins) OCP 2,4,5-Trichlorphenoxy OTB Lrt. Butyloxy Arg L-arginy 1 Glu L-glutamyl Gly glycyl His L-histidyl Lys L-lysyl NIe L-norleucyl Phe L-phenylalanyl Pro L-prolyl Ser L-seryl Try L-tryptophanyl Tyr L-tyrosyl Val L-valyl Leu Lleucyl Ala L-alanyl Beispiel 1 Man löst 6 g des Salzes des Tetracosapeptids L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-    L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-      L-arginyl-L-tryptophanyl   glycyl-L-lysyl-    L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-      L-arginyl-L-arginyl-L   prolyl-L-valylL-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin mit Carboxymethylcellulose (33 USP E/mg) und 12,

  6 g Zinkchlorid in 700 cm3 Wasser und tropft die so erhaltene Lösung in eine andere Lösung von 4,6 g Natriumchlorid und 18 g Benzylalkohol in 1000 cm3 Wasser, während man das pH des Gemisches durch Zugabe von @n Natriumhydroxyd während der ganzen Operation bei 8,0 aufhält. Man rührt noch während 10 Minuten die erhaltene Suspension, gibt 3,9g NaH2PO4H2O zu, stehlt das pH auf 7,8 ein und füllt zu 2000 cm3 mit Wasser auf.

   Man erhält somit eine Suspension, deren Eigenschaft durch Sterilsation auf 120  nicht verändert werden und die folgende Zusammensetzung pro ml besitzt: 
 EMI2.20 
 
<tb> Tetracosapeptid <SEP> 100 <SEP> USP <SEP> E
<tb> Carboxymethylcelllulose <SEP> 2,3 <SEP> mg
<tb> Zn++ <SEP> 3 <SEP> mg
<tb> Benzylalkohol <SEP> 9 <SEP> mg
<tb> NaCl <SEP> 8,5 <SEP> mg
<tb> PO4--- <SEP> 1,4 <SEP> mg 
 Das Sälz des Tetracosapeptids mit Carboxymethy    l-      cellulose   kann wie folgt hergestellt werden: a) H-Val-Gly-(For)Lys-(for)Lys-Arg-Arg-Pro-OH Man löst 12 g    CBO-Val-Gly-(For)Lys-(For)Lys-      (Tos)Arg-(Tos)Arg-Pro-OH   in 5 Liter getrocknetem, flüssigem Ammoniak und gibt unter kräftigem Rühren Natriumstücke bis zur beständigen, tiefblauen Färbung zu.

   Man versetzt mit 2 g Ammoniumchlorid, dampft den Ammoniak ab, trocknet den Rückstand im Hochvakuum und löst in 250 em3 0,2n Essigsäure. Man entfernt die anorganischen Salze nach Dixon (Biochem. Biophys. Acta, 34, 251 [1959]), dampft die salzfreie Lösung ab, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Äthyläther aus. Man erhält    H-Val-Gly-(For)Lys-(For)Lys-Arg-Arg-      Pro-OH   ³ Acetat. [a] D = -49  in @n Essigsäure. 



  b) H    Glu(OTB)-His-Phe-Arg-Try-Gly-      (For)Lys-Pro-OH   Man löst 10 g    CBO-His-Phe-(Tos)Arg-Try-Gly-      (For)Lys-Pro-OH   in 5 Liter trockenem, flüssigem Ammoniak, gibt Natriumstücke bis zur beständigen blauen Färbung zu. Man versetzt mit Ammoniumchlorid, dampft die Lösung ab, döst den Rückstand in 0,2n Essigsäure, entfernt die anorganischen Salze nach Dixon (Biochem. Biophys. Acta, 34, 251 [1959]), dampft die salzfreie Lösung ab, löst den Rückstand in Methanol und fällt mit Äthyläther aus. Man erhält    H-His-Phe-Arg-      Try-Gly-(For)Lys-Pro-OH   ³ Monoacetat.

   (Smp. l80  [a]D = -25  in In Essigsäure) die man mit 4 g    CBO-      Glu(OTB)-OCP   in 50    cm3      Dimethylformamid   auflöst.    Man      lässt   zwei Tage bei Zimmertemperatur stehen, versetzt mit    Äthyläther,      filtriert   und erhält 7,1 g    CBO-      Glu(OTB)-His-Phe-Arg-Try-Gly-(For)-Lys-Pro-OH,   die man in 200    cm3      Dimethylformamid      auflöst   und hydriert in    Anwesenheit   eines    Palladiumkatalysators.   Nach Filtration und    Waschen;

        mit      Äbhyläther      erhält   man 

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 H-Glu(OTB)-His-Phe-Arg    Try-Gly-(For)Lys,Pro-OH-      Acetat.   (Smp. 190     [a]##   = -19' in l n Essigsäure). 



  c) Tri-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu(OTB)-His-Phe-Arg-Try-    Gly-(For)Lys-Pro-Val-Gly-(For)Lys-(For)Lys-      Arg-Arg-Pro-OH   Man löst 6 g    H-Glu(OTB)-His-Phe-Arg-Try-Gly-      (For)Lys   - Pro -OH Acetat und 6 g Tri - Ser - Try - Ser    -      Nie-N3   in 50 cm3 Dimethylformamid, lässt während 16 Stunden stehen, dampft ab und kristallisiert den Rückstand aus heissem Methanol. Man erhält 5,1g Tri-Ser-    Tyr-Nle-Glu(OTB)-His-Phe-Arg-Try-Gly-(For)Lys-Pro-      OH   Äcetat (Smp. 220 . [a] D = -23  in    Dimethyl-      formamid),   das man in 50 cm3 Dimethylformamid löst und mit 1 g Trimethylessigsäure versetzt.

   Man verdampft im Hochvakuum auf die Hälfte des Volumens ein, kühlt auf -5 , versetzt mit 0,36 g Trimethylacetylchlörid und 0,3 g Triäthylamin. Nach 10 Minuten versetzt man mit einer Lösung von 2,8g    H-Val-Gly-(For)Lys-(For)Lys-      Arg-Arg-Pro-OH   ³ Acetat und 0,3 cm3 Triäthylamin in 200 cm3 Dimethylformamid. Man lässt während 4 Stunden stehen und fällt seit Aceton aus. Man erhält    Tri-Ser-      Tyr-Ser-Nle-Glu(OTB)      HiM-Phe-Arg-Try-Gly-(For)Lys-      Pro-Val-Gly-(For)Lys-(For)Lys-Arg-Arg-Pro-OH   ³    Tri-      methylacetat,   das man durch Filtration durch eine Kieselgelsäure in 50% wässrigem Methanol reinigen kann. 



  d) Tri-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu(OTB)-His-Phe-Arg-    Try-Gly-(For)Lys-Pro-Val-Gly-(For)Lys-      (For)Lys-Arg-Arg-Pro-OH   Man löst 4 g    Tri-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu(OTB)-His-      Phe   -Arg - Try - Gly - (For)Lys -Pro-Val-    Gly-(For)Lys-      (For)Lys-Arg-Arg-Pro-OH   in 40 cm3    Dimethylform-      amid,   gibt 40 cm3 Pyridin und 0,6g Toluolsulfonsäure zu, verdampft im Hochvakuum auf die    Hälfte   des Volumens, kühlt auf -5 ,    versetzt   mit einer Lösung von 4 Äquivalenten H-Val-(For)Lys-Val-Tyr-Pro-OTB und 1 g Dicyclohexylcarbodiimid. 



  Man lässt über Nacht stehen und versetzt mit Aceton. Man filtriert, trocknet im Hochvakuum und erhält 4 g    Tri#Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu(OTB)-His-Phe-Arg      Try-Gly-      (For)Lys-Pro-Val-Gly      (For)Lys-(For)Lys-Arg-Arg-Pro-      V   al-(For)Lys-V al-Tyr-Pro-OTB, die in 3 Liter 0,1 n Salzsäure während 3 Stunden bei 100  in der Abwesenheit von Sauerstoff erwärmt werden. Man dampft im Vakuum ab, wäscht den Rückstand mit Aceton und Athyläther und trocknet im Vakuum.

   Nach einer Gegenstromverteilung sm System Trifluoressigsäure/sek.    But-      anol/Wasser   (1 :120:160) erhält man 2,5 bis 3,0 g einer Hauptfraktion, die die Wirksamkeit des    Cortico-      tropins   aufweist, und die sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese homogen verhält. Migration bei der Papierelektrophorese bei pH 5,8 und 40 V/cm: 60 mm (das als Referenz gebrauchte Histidin wandert 70 mm). Migration bei Papierelektrophoresebei pH 1,9 und 40 V/cm: 93 mm (die als Referenz gebrauchte Glutaminsäure wandert 81 mm unter denselben Umständen). Man erhält ein Polypeptid der Formell    H-Ser-Tyr-Ser-Nle-      Glu   - His - Phe - Arg -    Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-      Arg-Arg   Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH.

   Dieses gibt nach saurer Hydrolyse bei 110  während 16 Stunden die folgende Aminosäurezusammensetzung Ser2sTyr2,oNle1,1Gluo,9His1,1Phe1,oArg3,1Gly1,9cys3,9Proe,s Val3,1 ³ (Try wird durch saureTotalhydrolyse bekanntlich zersetzt). Zu einerLösungvon 8,5 gdieses Produkts in 6000 cm3 Wasser gibt man eine Lösung von 23 g (kleinere oder grössere Mengen können auch gebraucht werden)    Carboxymethyl-      cellulose   in 6000 cm3 Wasser zu, lässt während 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehen und lyophilisiert. Man erhält 31 g eines sauren Salzes der    Carboxymethyl-      cellulose   mit dem Tetracosapeptid, das stabil ist und das selbst eine längere Wirkungsdauer als das oben beschriebene Acetat aufweist. 



  Beispiel 2 Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber 18 g Polygalakturonsäure anstatt der Carboxymethylcellulose. Beispiel 3 Man verfährt wie in Beispiel 1, gibt aber keinen Phosphatpuffer zu. 



  Beispiel 4 Man verfährt wie in Beispiel 1 oder 3, ersetzt aber die 4,6 g Natriumchlorid durch 28 g Glucose. 



     Beispiel   5 Man verfährt wie in den Beispielen 1 bis 4, ersetzt aber das Zinkchlorid durch die entsprechende Menge von Zinkacetat.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung stabiler, protrahiert wirk- semer Injektionspräparate des Tetracosapeptids L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucylL-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanylL-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl- L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-Llysyl- L-arginyl-L-arginyl L-prolyl-l-valyl- L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin in Form einer wässrigen Suspension eines Zinkkomplexes davon, dadurch gekennzeichnet,

   dass man die wässrige Lösung eines Salzes des Tetracosapeptids obiger Formel mit einem saure Gruppen enthaltenden Polysaccharid und eines physiologisch verträglichen wasserlöslichen Zinksalzes durch Zugabe eines Alkalimetallhydroxyds oder eines geeigneten Puffers auf einen pH-Wert von 7,2 bis 8,5 bringt. UNTERANSPRüCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn- zeichnet, d'ass man 1-25 mg Zink pro 100 IE anwendet. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man Carboxymethylcellulose als Poly- saccharsd anwendet. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man Polygalacturansaure als Polysaccharid anwendet. 4.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn- zeichnet, dass man Dextransulfat als Polysaccharid anwendet. 5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn- zeichnet, dass man Zinkchlorid als wasserlösliches Zinksalz anwendet.