CH456849A - Verfahren zur Herstellung protrahiert wirksamer Injektionspräparate - Google Patents

Verfahren zur Herstellung protrahiert wirksamer Injektionspräparate

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CH456849A
CH456849A CH1405064A CH1405064A CH456849A CH 456849 A CH456849 A CH 456849A CH 1405064 A CH1405064 A CH 1405064A CH 1405064 A CH1405064 A CH 1405064A CH 456849 A CH456849 A CH 456849A
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CH1405064A
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Roger Dr Boissonnas
Stephan Dr Guttmann
Janos Dr Pless
Wolfgang Dr Doepfner
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Sandoz Ag
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/695Corticotropin [ACTH]

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Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 Verfahren    zur      Herstellung      protrahiert   wirksamer    Injektionspräparate   Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung stabiler protrahiert wirksamer    Injek-      tionspäparate   des    Pentacosapeptids,      L-Serylr-L-tyrosyl      Lseryl   L.rnorleucyl-L-glutamyl-    Lrhistidy1hIrphenylalanyl-L-arginyl-L-trypto-      phanyl-glycyli-L   lybyl-L-prolyl-L-valyl,-glycyl-    L-lysyl=L-lysyl,

  -L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-      L-valy1LLlysyl-L-valyl-L-tyrosyl=L      prolyl-      Lvalinamid   in    Form   einer    wässrigen   Suspension eines Zinkkomplexes davon, dadurch gekennzeichnet, dass man die    wässrige   Lösung eines Salzes des    Pentacosapeptids   obiger Formel mit einem    saure   Gruppen enthaltenden    Polysaccharid   und eines    physiologisch      verträglichen,      wasserlöslichen   Zinksalzes durch Zugabe eines    Alkalimetallhydroxyds   oder eines geeigneten    Puffers   auf einen    pH-Wert   von 7,2 bis 8,5 bringt. 



  Das    Pentacosapeptid      L-Srryl      L-tyrosyl   L-seryl-Lrnorleucyl-L-glutarpylL-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tTyptophanyl-glycyl-L-lysyl-L7prolyl-L-valyl#7glycylL-lysyl-Lrlysyl4Larginyl-L-arginyl-L-prolyl-    L-valy14,lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-;prolyl-      Lvalinamid   hat    strukturelle   Ähnlichkeit    mit-der      Aminosäuresequenz   1-25 des    ACTH   und    .besitzt   auch dieselben biologischen und therapeutischen Eigenschaften wie das natürliche    ACTH      (Corticotropin).   



  Nach dem    angegebenen      Verfahren   erhält man eine äusserst stabile    Suspension,      die   nach anschliessender    Sterilisierung   direkt    injizierbar   ist.    Gegebenerffalls      kann   das    pH   der Suspension durch    -Zusatz   eines geeigneten Puffers, z. B.    eines      Phosphatpuffers,   stabilisiert werden. Durch Zusatz von =geeigneten Stoffen (z. :B. Natriumchlorid, Glucose, Glycerin) kann das    Präparat      isotonisch   gemacht werden. Auch    Substanzen,   die das    Wachstum   von    Mikroorganismen   hemmen,    wie   z.

   B.    Benzylalkohol,   Phenol,    Chlorobutanol,   können    noch      zugesetzt      .weFden.   Als saure Gruppen enthaltende    Polysaccharide   können natürliche    Polyuronsäuren   (wie z. B.    Polygalacturon-      säuren,      Polymannuronsäuren),      saure      Mucopolysaccharide   (wie z.

   B.    Heparin,      Hyaluronsäure,      Chondroitinsulfat)   ,sowie synthetische oder mikrobiologisch gewonnene saure Gruppen enthaltende    .Derivate   der    Cellulose,   der Stärke, oder anderer    Polysaccharide   (wie z.    B.      Carboxy-      methylcellulose   oder    Dextransulfat)   verwendet werden. Als physiologisch wirksame    Zinksalze   können Zinkacetat,    Zinkchlorid,      Zinknitrat   und Zinksulfat verwendet werden. Das Verhältnis zwischen    Polypeptidsalz   und Zinksalz soll vorzugsweise zwischen. 10 und 200    mMol   Zinksalz pro WO 1. E.    Peptidsalz   liegen. 



  Das    Pen.tacosapeptid   obiger Formel kann nach für die Synthese von    Polypeptiden      allgemein   bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die    Amino@säuren   in der in der obigen Formel festgefegten    Reihenfolge   allein    oder   nach vorheriger Bildung kleinerer    Peptid-      einheiten   miteinander verknüpft werden. Eine Synthesemöglichkeit des    synthetischen      Peptids   ist am Ende des    Beisipels   1 näher beschrieben. 



  Es ist bekannt, dass das natürliche    ACTH   sowie verschiedene seiner biologisch aktiven    Teilsequenzen   im Organismus sehr schnell    inaktiviert   werden. Es wurde daher empfohlen,    die   Wirkung von Injektionslösungen von    Corticotropin   durch Kombination mit Verbindungen gewisser    Schwermetalle   oder durch. Kombination mit hochmolekularen Stoffen zu verbessern und    insbesondere   über einen längeren Zeitraum zu erstrecken, doch war der dadurch erreichte Effekt relativ klein. 



  Das    erfindungsgemäss   verwendete    Polypeptid   ist zwar bereits    wesentlich   stabiler -als das natürliche    ACTH   oder dessen Bruchstücke, wird    -imOrganismus   .    jedoch.   noch    immer   relativ rasch abgebaut. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass das    Polypeptid   obiger Formel in Form eines Zinkkomplexes eines seiner Salze mit saure Gruppen enthaltenden    Polysacchariden   bei einem    pH   von 7,2-8,5 in Form einer    wässrigen   

 <Desc/Clms Page number 2> 

 Suspension sehr    beständig   ist.

   Diese    wässrige      Suspension      besitzt   bei    parenteraler      Applikation   am Tier und am Menschen eine    wesentlich   stärkere protrahierte    ACTH-      Wirksamkeit   als die    bereits   bisher bekannten    ACTH-      Depot   Präparate. 



  So wird durch die    erfindungsgemäss   hergestellten Präparate bei    m.   m. oder s. c. Injektion die    Sekretion   der    Corticosteroide   während    bedeutend   mehr als 24. Stunden stimuliert. Dies bedeutet    für   die Therapie einen    grossen      Vorteil,   der bisher    nicht   erreicht werden konnte. Die so erhaltene Suspension ist    sehr   hitzestabil; was bezüglich    Sterilisationsmöglichkeit      einen   bedeutenden Vorteil darstellt. 



  Die    verfahrensgemäss   hergestellten neuen Präparate können beispielsweise für die Behandlung der folgen,. den Erkrankungen    verwendet   werden: akuter und chronischer Gelenkrheumatismus,    Collitis      ulcerosa,      Nephrose,      Kollagen.osen,   wie z. B.    Lupus      erythematodes,      Sklero-      dermie   usw., allergische Erkrankungen der verschiedenen Organsysteme, wie    Asthma      bronchiale,   Ekzem,    Urticaria,      Dermatitis      exfoliativa,      anaphylaktischer   Schock usw.,    Intoxicationen   verschiedener Genese, wie z.

   B. bei    chronischem      Alkoholismus,   Tumoren, wie z. B. Leuk- ämien,    Lymphosarcomen,      Reticulosarcomen   usw., sowie zur    Verhinderung   der    Nebennierenrindenatrophie   bei der Therapie mit    Corticosteroiden,      Insuffizienzerschei-      nungen   der Hypophyse. 



     Ein.   wesentlicher Vorteil gegenüber natürlichem, aus tierischem Material extrahiertem Hormon    liegt   für die Therapie beim Menschen auch darin, dass dem neuen    Pentacosapeptid-Kompliex      antigene   Eigenschaften fehlen. Es kann somit bei den oben erwähnten    Erkrankungen,   auch dann unbedenklich verwendet werden, wenn beim Patienten im Verlauf    einer   früheren Behandlung mit natürlichem    ACTH   allergische Erscheinungen auftraten. 



  In den. für die Standardisierung    üblichen   und anerkannten    Tests   besitzt der    Pentacosapeptid-Komplex   im Vergleich    zum:   natürlichen    Corticotropin   eine sehr hohe Aktivität. 



  In den    nachfolgenden      Beispielen   sind die Temperaturen in Celsiusgraden gemacht. 



  Es wurden folgende Abkürzungen verwendet:    CBO-   =    Carbobenzoxy-      Tri-   =    Trityl-   =    Triphenylmethyl      (For)   =    Formyl   (auf der    a-Aminogruppe      deis      Lysins)   (Tos) =    Tosyl   =    p-Toluolsulfonyl   (auf der    Guanidogruppe   des    Arginins)      OCP   =    2,4,

  5-Trichlorphenoxy      -OTB   =    tert.-Butyloxy      -OMe   =    Methoxy      -OEt   =    Äthoxy   Arg- =    -L-arginyl-      -Glu   =    -glycyl-      His-   =    -L-histidyl-      -Lys-   = L    lysyl      Nle-   =    -Lnorleucyl-      Phe-   =    Irphenylalanyl-      -Pro-   =    -Lprolyl-      -Ser-   =    -L-seryl'-      -Try-   =    L-tryptophanyl      Tyr-   =    -Ltyrosyl-      Val-   = -L-valyl- 

  
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 Beispiel 1 Man löst 6 g des Salzes des Pentakosapeptids L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl L-norleucyl-L glutamylL-histidyl4-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptQ phanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valylglycylL-lysyl'-Lrlysyll-L-arginyl-L-arginyl LprolylLvaly1LLllysyl-L-valyl L-tyrosyl-LprolylL-valinamid mit    Carboxymethylcellulose   (33    USP      E/mg)   und 12.,6 g    Zinkchlorid      in:   700    cm3   Wasser und    tropft   die so erhaltene Lösung    in   eine andere Lösung von 4,6g Natriumchlorid und 18 g    Benzylalkohol   in 1000    cm3   Wasser,    während   man das    pH   des    Gemisches   durch Zugabe    von:

        1n      Natriumhydroxyd   während der ganzen Operation bei 8,0    aufhält.   Man rührt noch während 10 Minuten die    erhaltene   Suspension, gibt 3,9g    NaH2P04H20   zu,    stellt   das    pH   auf 7,8    ein,   und füllt zu 200-0    cm3      mit   Wasser auf.

   Man erhält    somit   eine Suspension, deren Eigenschaft, en durch    Sterilisation   auf 120     nicht   ver- ändert werden und die folgende Zusammensetzung pro ml besitzt:    Pentakosapeptid   100    USP   E    Carboxymethylcellulose   2,3 mg    Zn++   3 mg    Benzylalkohol   9 mg    NaC1   8,5 mg    P04---   1,4 mg Das    Salz   des    Pentacosapeptids   mit    Carboxymethyl-      cellulose   kann wie folgt hergestellt werden:

   a)    LGlutamyl-L      histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-      L-tryptophanyl-glycyl-E      N-formyl-L-lysyl      L-prolyl-Lvalyl-glycyl-E-N-formyl-Llysyl-      E   N-farmy14Llysyl@L-arginyl-Larginyl-    L-prol'yl-L-valyl-,--N-formyl-Llysyl-L-valyl-      Ltyrosyl-LproiylrL      valinamid      (H-Glu-HisrPhe-      Arg-Try-Gly-(For   )Lys-Pro-ValGly-(For)Lys-    (For)Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(For)Lys-Val-Tyr-      Pro-Val-NH2).   Man löst 57g    H-(Tos)Arg-Try-Gly-(For)Lys-Pro-      OTB   und 42 g    CBO-Phe-OCP   in 100    cm3      Dimethyl-      formamid,

     lässt 16 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, gibt 2000    cm3      Essigester   zu, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und    Natriumcarbonatlölsung,      trocknet   über    Natriumsulfat,   dampft ab und wäscht den Rückstand    mit   Äther. Nach Trocknen im Hochvakuum erhält man 85g    CB,O-Phe-(Tos)Arg-Try-Gly-(For)Lys-      Pro-OTB.      Smp.   180  (mit    Zers.).      [a]D   = -32  in    Dimethylformamid.   



  Das oben    erhaltene   Produkt wird in 1600    cm3   Methanol aufgelöst und    in   Anwesenheit eines    Palla-      diumkatalysators   bei Normaldruck bis zur vollständigen    Abspaltung   der    CBO-Gruppe   hydriert. Nach Filtrieren wird die Lösung eingeengt und das Produkt mit    Äther      ausgefällt.   Nach    Trocknen   im Hochvakuum bei 60  erhält man 57g    H-Phe-(Tos)Arg-Try-Gly-(For)Lys-      Pro-OTB.   [a] D = -48  in    Dimethylformamid.   



  Man löst 54g    H      Phe-(Tos)Arg-Try-Gly-(For)Lys-      Pro-OTB   und 20 g    CBO-His-N3   in einem Gemisch von 60    cm3   Essigester und 60    cm3      Dimethylformamid   und lässt 48 Stunden bei 0  stehen. Man dampft ab, behandelt den Rückstand mit 500    cm3   Essigester, filtriert und    trocknet   das, feste Produkt im Hochvakuum. Man erhält 74g    CBO-His-Phe-(Tos)Arg   Try-Gly-(For)- 

 <Desc/Clms Page number 3> 

    Lys-Pro-OTB.      Smp.   160-180 . [a]21 = -41  in    Di-      methylformamid.   



  Das    erhaltene   Produkt wird in 740    cm3      Trifluor-      essigsäure   aufgelöst und 1 Stunde bei 20  aufbewahrt. Man dampft    ein   und wäscht den Rückstand mit Äther, löst es in einem Gemisch von    Dioxan/Wasser      (4.:   1) und    filtriert   es auf einer Kolonne eines basischen Ionen    austauschers,   um die letzten Spuren von    Trifluoressig-      säure   zu    entfernen.   Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft. Man    erhält   62 g    CBO      His-Phe-(Tos)Arg-Try-      Gly      (For)Lys-Pro-OH.   



     Das;   erhaltene Produkt wird in 1500    cm3      Methanol   aufgelöst und in Anwesenheit eines    Palladiumkatalysa-      tors   bei    Normaldruck   bis zur    vollständigen   Abspaltung der    CBO-Gruppe      hydriert.   Man filtriert, wäscht den Katalysator mit 100    cm-3      Dimethylformamid,   engt die    vereinigten      Filtrate   ein und fällt das    Heptapeptid   mit Äther.

   Nach Trocknen erhält man 40 g    H-His-Phe-      (Tos)Arg-Try-Gly      (For)Lys-Pra-OH.      Smp.      22.0225 .   [a] D = -34  in    Dimethylformamid.   



  Man löst das erhaltene Produkt in 300    cm3      Di-      methylformamid,   gibt 28,5g    CBO-Glu(OTB)-OCP   zu lässt 3 Tage bei 20  stehen,    engt   ein und gibt 1000    ein-      Äther      zu.   Nach Filtrieren    wird   der Niederschlag    mit   Essigester    gewaschen,   in    einem      Gemisch   von    Dioxan/   Wasser (4: 1) gelöst, durch eine saure    Ionenaustauscher-      säule   filtriert und    eingedampft.   Man löst den Rückstand in wenig    Dimethylformamid   und fällt mit    Fsssig-      ester   ab.

   Nach Filtrieren und Trocknen im Hochvakuum erhält man 39 g    CBO-Glu(OTB)-His-Phe-      (Tos)Arg-Try-Gly-{For)LysrPro-OH.      Smp.   175-180 .    [a121   = -31  in    Dimethylformamid.   



  Man löst das erhaltene Produkt in 60    cm3      Pyridin,   versetzt mit 30 g    Tri(2,4,5-Trichlorphenyl)phosphit.   Dies wird wie folgt hergestellt: Man suspendiert 88g    Natrium-2,4,5-trichlorphenolat   in 500    cm3   Benzol und gibt 12    cm3      Phosphortrichlorid   bei 0  zu. Nach 3 Stunden bei 80     wird      Natriumchlorid      abfiltriert   und die Lösung eingedampft. Nach dem    Um-      kristallisieren   aus Essigester erhält man 52 g    Tri-      (2,4,5-Trichlorphenyl)phosphit   vom    Smp.   122 .

   Man lässt 16 Stunden bei 20  stehen, gibt Äther zu, filtriert, wäscht mit heissem Essigester und trocknet. Man erhält 42 g    CBO-Glu(OTB)-His-Phe      (Tos)Arg-Try      Gly-(For)-      Lys-Pro-OCP.      [a.111   = -28,1  in    Dimethylformamid.   Man löst 19 g    CBO-Glu(OTB)-His-Phe-(Tos)Arg-Try-      Gly-(For)LyS      Pro-0CP   und 20 g    H-Val      Gly-(For)Lys-      (For)Lys-(Tos)Arg      (Tas)Arg-Pro-Val(For)Lys-Val-Tyr-      PIo-Väl-NH2   in 40    cm3      Dimethylformamid   und 2    cm3      Triäthylamin,

     und erwärmt die erhaltene Lösung 18 Stunden auf 50 . Man gibt 1000    cms   siedendes Aceton. zu und wäscht das gefällte Produkt noch sorgfältig    mit      Aceton   und    trocknet   es im Vakuum. Man löst es in einem    Gemisch   von    Dioxan/Wasser   (4:1), filtriert durch einen sauren    Ionenaustauscher   und dampft zur Trockene ein. Man wäscht den Rückstand mit Essigester und    trocknet   im    Vakuum.   



  Man erhält 27 g    CBO-Glu(OTB)-His-Phe-(Tos)Arg.1      Try-Gly-(For)Lys-Pro-Val      Gly      (For)Lys-(For)Lys-(Tos)-      Arg-(Tos)Arg-Pro-Val-(For)Lys-Val      Tyr-Pro-Val-NH2.      Smp.   210-220 . [a121 = -38  in    Dimethylformamid.   Man löst 5 g von dem    erhaltenen   geschützten    Hene-      kosapeptid   in 7,5 1 getrocknetem Ammoniak und gibt unter kräftigem    Rühren   Natrium-Stücke, bis zur beständigen,    tiefblauen   Färbung bei. 



  Man versetzt dann mit 2 g    Ammoniumchlorid,   dampft den Ammoniak ab, trocknet den Rückstand im 
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 Hochvakuum und löst ihn in 250 cm3 0,2n Essigsäure. Nach Entsalzung dampft man die Lösung zur Trockene, wäscht den Rückstand mit Methanol und trocknet im Vakuum. Man erhält 4,4 g H-Glu-His-PheArg-Try G1y-(For)Lys-Pro-Val-Gly-(For)Lys,(For )LysArg-Arg-Pro-Val-(For)Lys-Val-Tyr-Pr(>-Val=NHz. 



  b) N-Trityl-L-Geryl L@tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl@ L-glutamyl L-histidyl-L-phenyl'alanyl-L-arginylL-tryptophanyl glycyl-E-N-formyl-lysyl-L-prolylL-valyl-glycyl-E-N-formyl-Irlysyl-e-N formylL-lysyl! L-arginylL-arginyl-L-prolyl-L-valylE-N-formyl-L-lysyli-Lrvalyl-L-tyrosyl-L-prolylL-valinamid. [Tri-Ser-Tyr-Ser-Nl#>Glu-His-PheArg-Try-Gly-(For)Lys-Pro-Val-Gly-(For)Lys- (For)Lys-Arg-Arg-Pro-Va1-(For)Lys-Val-TyrPro-Val-NH2.] Man löst 174 g    Tri-Ser-OH   und 117g    H-Tyr-OMe   in einem    Gemisch   von 2 1    Acetonitril,   1 1 Chloroform und 50    cm3      Dimethylformamid,   kühlt auf -10 , versetzt mit 124 g    Dicyclohexylcarbodiimid   und rührt 5 Stunden bei 20 .

   Man filtriert, wäscht    mit   1,5 1    Pyridin,   dampft die vereinigten    Filtrate   zur Trockene und    kri-      stallisiert   den Rückstand aus heissem Essigester. Man erhält 221g    Tri-Ser-Tyr-OMe.      Smp.   232 .    [a]21   = -34  in    Dimethylformamid.   



  Das erhaltene Produkt wird in    500      cm3      Dimethyl-      formamid   aufgelöst und    mit   100    cm3      Hydrazin   versetzt. Nach 24 Stunden bei 20  giesst man die Lösung    in   5 1 Wasser,    zentrifugiert,   löst den    öligen   Rückstand in 2 1 Essigester und wäscht die    erhaltene   Lösung mit    Wasser   bis zur    Neutralität.   Man    trocknet   mit    Natriumsulfat,   dampft zur Trockene ein und wäscht den Rückstand mit Äther.

   Man erhält 182 g    Tri-Ser-Tyr-NHNH2.      Smp.   120  (mit    Zers.).   [a]21 = -30  in    Dimethyl-      formamid.   



  Man löst 131g    CBO-Ser-0H   und 95g    H-Nle-OMe,   Hydrochlorid in 2 1    Chloroform   und 70    cm3      Triäthyl-      amin,   kühlt auf -10 , versetzt mit 124 g    DicyclohexyL      carbodiimid   und rührt 5 Stunden bei 20 . Man    filtriert,   dampft das    Filtrat   ein, wäscht den    Rückstand   mit    Pe-      troläther   und Wasser und trocknet.

   Man    kristallisiert   aus    Äthylacetat/Petroläther   und erhält 151 g    CBO-      Ser-Nle-OMe.      Smp.   71'. [a] D = -190 in    Methanol.   Man    spaltet   die    CBO-Gruppe   durch katalytische Hydrierung in Methanol in Anwesenheit eines    Palladiumkatalysatorg   und einer äquivalenten Menge Chlorwasserstoff. Nach Abtrennen des    Katalysators,   Abdampfen und    Versetzen   mit    Äthyläther   erhält man eine    quantitative   Ausbeute von    H-Ser-Nle-0Me,   Hydrochlorid. 



  Man löst 46 g    Tri-Ser-Tyr      NHNH2   in einem Gemisch von 120    cm3      Dimethylformamid,   120    cm3      Iso-      propanol   und 120    cm3   Wasser, kühlt auf -10 , gibt 44    cm3   6n Salzsäure zu und versetzt unter kräftigem Rühren mit 3,5g    Natriumnitrit.   Nach 5 Minuten gibt man 250    cm3      1n      Kaliumbicarbonat   und 1500    cm3   Wasser    zu.   Man saugt ab, löst das feste Produkt    in;

     200    cm3      Dimethylformamid,   gibt 24 g    H-Ser-Nle-0Me-      Hydrochlorid   und 23    cm3      Triäthylamin   zu und lässt bei    -20    16 Stunden    stehen.   



  Man giesst die    Lösung   in 1000    cm3   Wasser, extrahiert mit Essigester, trocknet über Natriumsulfat, und dampft ab. Nach Waschen des Rückstandes mit Äther erhält man 56,5g    Tri-Ser-Tyr-iSer-Nle-OMe.      Smp.   130 bis 140' (mit    Zers.).   

 <Desc/Clms Page number 4> 

 
 EMI4.1 
 Man -löst das erhaltene Produkt in 200 em3 :heissem Äthanol, versetzt mit 3 cm.3 Hydrazin, -lässt 24 .Stunden bei 20  stehen, gibt 200 cm3 Äther zu, filtriert, -wäscht mit Äther und trocknet im Vakuum über PhosphorpentGxyd -und konz. Schwefelsäure. Man erhält 51 g Tri-Ser-Tyr-Ser-N1e-NH NH2. -Smp. 205 . 



  Man I'öst 8,8 g Tri-Ser-Tyr-Ser-Nle=NH-NH2 in 30 cm3 Dimethylformamid, -gibt 10 cm3 Wasser zu, kühlt auf -1U , gibt 5 cm@ =6n -Salzsäure zu, versetzt mit 750 mg Natriumntrit, rührt 5 ;Minuten bei -5 , gibt 300 cm3 0,2n Kaliumbicarbonatlösung und zentrifugiert. Man löst das erhaltene Tri Ser-Tyr-Ser-NTe-N3 in 50 cm3 Dimethylformamid, versetzt :mit 20 -g H-GluHis-Phe-#Arg-Try-Gly-(For)Lys-Pro-Val GIy;(For)Lys- (For)Lys-Arg-Arg-Pro-Val:(For)Lys-Val-Tyr Pro-ValNH2 und 5 cm3 Wasser -und gibt Tiiäthylamn bis zur alkalischen Reaktion zu. Man lässt 12 -Stunden bei 0  stehen, gibt noch weitere, aus 4,8g Tri-Ser-Tyr-Ser-, Nle-NH-NH2 hergestellte Menge von Tetrapeptidazid zu, lässt 6 Stunden bei 20  stehen, dampft im Hoch vakuum zur Trockene ab, wäscht mit heissem Aceton, Essigester und Methylenchloiid und trocknet im Vakuum.

   Man -erhält 23g Tri=Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu=HisPhe-Arg-Try PIy-(For)Lys-Pro-Vall-Glfy-(For)Lys-(For)Lys Arg-Ärg-Pro-Val-(For)Lys-Val-Tyr=Pro=ValNH2. 



  c) L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-Irnorlencyl-L-g@utamylLhistidyl-L phenylalany1l-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-Lrlysyl-L-prolyl-L-valyl-gl@cylL-lysyl-Llysyl.-L-arginyl-Lrarginyl-L prolylLrvalyl-Llysyl-Lvalyl-Lrtysosyl-L-prolylr L-valinamid. [H-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu,His PheArg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-ArgArg @ro@Val Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NHz.] Man erwärmt unter Rühren und unter Ausschluss von Sauerstoff 10 g geschütztes Pentacos.apeptid in 5000 cm3 0,1n Salzsäure während 3 Stunden auf 100 , dampft im Vakuum ab, wäscht den Rückstand mit Aceton und Äthyläther und trocknet im Vakuum.

   Nach einer Gegenstromverteilung im System Trifluoresäigsäure/sek.Butanol/Wasser (1 : 120: 160) und Austausch der Trifluoressigsäure gegen Essigsäure durch Behandlung mit einem Anionenaustauscher in Acetat Form, erhält .man 7,8 g Pentakosapeptid-Acetat, das eine Wirksamkeit von 130   30 USP Einheiten pro mg aufweist und das sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese homogen verhält. Migration bei der Papierelektrophorese bei pH 5,8 und 40 V/cm: 56 mm in 60 Minuten (das als Referenz -gebrauchte Histidin wandert 61 mm). Migration bei der Papierelektrophorese :bei pH 1,9 und 40 V/cm: 121 mm in 60 Minuten (die als Referenz gebrauchte Glutaminsäure wandert 97 mm unter denselben Umständen). Referenz bei Papierchromatographie im System n^Butanoi/Essigsäure/Wasser, 70/10/20:0T01.

   (Totalhydrolyse gibt :die folgende Aminosäurezusammensetzung: Seri,sTyri,sN1ei,oGfuo,sHisl"Phel,oArgg,2Gly2,oI,ys4,1 Proz,9Val4,o, Try wird durch saure Totalhydrolyse bekanntlich zersetzt.) Zu einer Lösung von 7,5 g dieses Produktes, in ,6000 cm3 Wasser gibt man eine Lösung von 24 g 
 EMI4.2 
 -(kleinere oder :grössere Mengen -können auch gebraucht werden) Carboxymethylcellulose in 6000 cm3 Wasser zu, lässtwährend 3 'Stunden ibei Zimmertemperatur stehen und lyophilisirrt. Man erhält 31 g eines. sauren, Salzes oder -C arboxymethyl'cellulose mit dem Pentakosapeptid, :das. -stabil ist und das selbst eine längere Wirkungsdauer als; das oben beschriebene Acetat auf-. weist. 



  .Beispiel 2 Man, verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber 18 g Polygalakturonsäure anstatt der Carboxymethylcellulose. Beispiel _3 Man verfährt wie in Besipiel 1, gibt aber keinen Phosphatpuffer zu.    Beispiel   4 Man    verfährt      wies   in    Beispiel   1 oder 3,    ersetzt   aber, die 4;6 -g    Natriumchlorid   durch 28 g Glucose.    Beispiel   5    Man      verfährt   wie in den Beispielen 1 bis 4, ersetzt aber    .das      Zinkchlorid   durch die    entsprechende   Menge von    Zinkacetat.  

Claims (1)

  1. EMI4.16 PATENTANSPRUCH Verfahren:zur Herstellung stabiler, protrahiert wirksamer Iajektionapräparate des Pentacosapeptids L-Seryl Lrtyrosyl=L-seryl-L-norleucyl L glutamylLhistidyll-L-phenyl'alanyl-Irarginyl-L-tryptQ ph-anyl-g@ycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-g#ycylLlysyl-Llysyl!-Lrarginyl-L-arginyl-L-prolyl L-valyl-LIysyl-L valyl L-tyrosyl-L prolylLvalinamid in Form einer wässrigen Suspension eines Zinkkomplexes davon, dadurch gekennzeichnet, dass man die wässrige Lösung eines Salzes des Pentacosapeptids obiger Formel mit einem saure Gruppen enthaltenden Polysaccharid und eines physiologisch verträglichen., wasserlöslichen Zinksalzes durch Zugabe eines Alkalimetallhydroxyds oder -eines geeigneten Puffers auf einen pH-Wert von 7,2 bis 8,5 bringt. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach, Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man 1 bis 25 mg Zink pro 100 IE anwendet. 2.
    Verfahren. nach Patentanspruch, dadurch gekennkennzeichnet, dass man -Carboxymethylcellulose als Polysaccharid anwendet. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man Polygalacturonsäure als Polys.accharid anwendet. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man Dextransulfat als, Polysaccharid anwendet. 5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man Zinkchlorid als wasserlösliches Zinksalz anwendet.
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