CH456622A - Procédé pour la récupération de plasminogène à partir de sérum sanguin animal ou de plasma sanguin animal et de préférence à partir de sang de porc - Google Patents
Procédé pour la récupération de plasminogène à partir de sérum sanguin animal ou de plasma sanguin animal et de préférence à partir de sang de porcInfo
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Description
Procede pour la recuperation de plasminogene ä partir de serum sanguin aidmal ou de Plasma sanguin animal et de preference ä partir de sang de porc 0n sait que Fon recupere Je pl,asmi:nogene ä partir du Plasma sanguin humain en enlevant 1e fibrinogene que contient 1e Plasma, en precipitant la fraction appelee euglo-buhne dans 1e serum sanguin obtenu, puis en trai- tant 1'euglobuli@ne pour obtenir 1e pl'asminogene.
Apres elimination du fibrinogene, an emploie, dans certains procedes connus de recuperation du plasmino- gene ä partir de sang humain, 1e s6rum fortement dilue, precipite une fraction d'euglobuline ä un pH determin6, pu.is traite ladite fraction pour obtenir 1e plasm:inogene. Ainsi, il est connu de diluer 20 fois 1'e s6rum humain et de regler le pH du liquide obtenu entre 5,2 et 5,3 pour preci.piter une fraction d'euglobuline. Il est 6galement connu de 1e diluer 10 fois et de regler 1e pH ä 5,3 en operant ä une temp6rature de 0 ä 4(1 C.
La presente invention se rapporte ä un proc6de pour la r6cuperation der plasm:inogene ä partir de serum san- guin animal ou ä partir de Plasma animal, par preci- pitation d'euglobuline qui est traitee pour obtenir Je plasminogene, caracterise par 1e fait que 1'on dilue le serum ou 1e Plasma 5 ä 8 fois avec de 1'eau, ajuste 1e pH ä une valeur de 5 ä 6, puis separe 1e precipit6. Elle a pour but de foumir une precipitation d'euglobuline permettant d'obtenir une teneur satisfaisante de plas- minogene tourt en reduisant simultanement la quantite de matiere organique concomitante qui doit etre eli- minee par 1e processus ulterieur..
L'invention est fon & e sur les experiences suivantes 0n dilue, avee diverses quantites d'eau distillee, des portions de 50 ml de serum de sang de porc prepare comme indiqu6 ei-dessous. 0n amene ä un PH de 5,25 toutes les portions de s6rum d,ilu6 et les hisse Pendant la nuit ä 00 C. 0n obtient ainsi un precipiti que Fon dissout dann 25 ml d'acide sulfurique dslu6 ä un pH de 2 ä 3, apres separation du liquide par centrifugation. Les solu,tions obtenues sont alors analysees pour deter- miner leur teneur de plasm;in (activit(1, du plasmin apres activation du plasminogene contenu) et la quantit6 totale de mauere o:rganique contenue.
Apres avoir fixe ä<B>100</B> 1'activite du plasmin ainsi que la quantite totale de matiere organique precipitee ä un p:H de 5,3, ä une temp6rature de 00 C et ä une di- lution de 20, an calcule en pour Cent de ces valeurs de reference la teneur de plasmin et la quantite totale de matiere organique trouvees dans les RTI ID="0001.0269" WI="9" HE="4"LX="1674" LY="1565"> essais ci-dessus. Le degre de dilution > est 1e rapport entre 1e volume de solution diluee de precipitation et 1e vol'ume de la quan- tite de serum employ6e.
Les resultats des essais sont reunis sur 1e graphique represente au dessin. Les abscisses indiquent les de-res de dilution, les ordonnees indiauent les valeurs en pour cent trouvees po.ur la teneur de plasmin et la quantite totale de matiere organique Jans les pr6ci:pit6s. Ainsi, la ligne continue superieure du, graphi.que montre la relation entre Factivite de plasmin de la matiere preci- pitee et 1e de-r6 de dilution, tandis que la ligne discon- tinue infärieure montre la quantite totale de matiere or- aanique precipitee en relation avec 1e degre de dilution.
0n a trouve en outre que Fallure des courbes ne change pas sensiblement lorsqu'on pr6cipite ä des tem- peratures plus 61evees, par exemple ä 25 C, quoi qu'on obtienne ä 00 C un rendement plus 61ev6 aussi bien de matiere precipitee que de plasmin.
Il ressort des deux courbes du graphique que 1'acti- vite du plasmin reste pratiquement egale ä 100% de Factivite de ref6rence lorsque 1e degre de dilution est reduit de 20 ä 10, tandis que 1e rendement total de la matiere organique precipitee est egalement reduite par cette diminution du degre de dilution. Cependant, lors- que ce dernier est abaisse ä une valeur inferieure ä 10, il se produit un changement brusque surprenant dans Fallure des courbes, celles-ci 6tant pratiquement paral leles ä un degr#, de dilution d'environ 8, car la courbe indiquant la teneur de plasmin aussi bien- que celle in-
diquant la quantit6 totale de matiere organique pr6ci pitee prAentent une brisure vers 1e bas. La courbe en trait continu pr6sentant une diminution considärable de la teneur de plasmin aux degr6s de dilution inf6rieurs ä environ 5, et les deux courbes se rapprochant rapide ment l'une de lautre dann ce domaine de dilution, an voit qu'en employant un degr6 de dilution relativement bas, an obtient une teneur de plasnün satisfaisante pour une production ä 1'dchelle .industrielle, ainsi qu'une re duction smultange de la quantite de matiere organique concomitante qui doit etre enlevde au cours du traite ment ult6rieur.
Des essais semblables aux essais ei-dessus ont mon tr6 qu'il n',est pas nicessaire de s6parer 1e fibrinogene du plasma avant la pr6cipitation d'euglobuline, et qu'en omettant ce stade, c'est-ä-dire en emplayant du plasma sanguin animal comme mauere de d6part, an peut 6ga lement obtenir un prgcipit6 d'euglobuline qui, apres trai tement et activation, possede une activit6 de plasmin satisfaisante.
Sur la base du r6sultat inattendu des recherches ci dessus, 1e proc6d6 selon 1'invention est caractdris6 par 1e fait qu'on ditue 1e s6rum au 1e plasma 5 ä 8 fois avec de 1'eau, regle 1e pH ä une valeur de 3 ä 6, puis s6pare 1e prdcipit6 obtenu.
Ce pr & ipit6 d'euglobuline peut etre trait6 de ma niere connue pour obtenir 1e plasminogene.
Ort peut employer comme agent de dilution 1'eau du robinet ou 1'eau distilke. L'agent de dilution peut cependant contenir des sels, mais seulement en quan tit6s assez falbles pour qu'ils ne changent pas consid6 rablement la concentration ionique rar, lorsque celle-ei est trop 61evee, la composition de la prot6ine pr & ipItee se trouve chang6e d6favorablement.
Le faible degr6 de dilution utilis6 pour 1e s6rum ou pour 1e Plasma sanguin animal est particuherement avantageux lorsqu'on produit 1e Plasma ä l'6chelle in dustrielle rar an 6vite la pr6sence des volumes consi derables de liquide qui devraient etre traitds ensuite si 1'on utilisait des degr6s 61ev6s de dilution.
Comme il ressort du graphique comment6 ci-dessus qu'ä un degr6 de dilution d'environ 8 an obtient par tiellement un prdcipit6 d'euglobuline ayant une haute teneur de plasmin, partiellement une quantite relative ment petite de matiere organique concomitante, seule ment, an pourrait 6videmment avoir une rai.son de pr6 Mrer un degr6 de dilution se trouvant dans la Partie sup6rieure de 1',intervalle de 5 ä B. Cependant, une re cherche plus pouss6e muntre que 1e proced6 1e plus 6conomique comprend un de,-,r6 de dilution de 5 ä 6. Selon 1'invention an pr6fere donc tout particulierement
utiliser rette dilution. La raison, pour fixer ce degr6 de dilution optimum du point de vue economique, est que 1e prix par unit6 de plasmin r6cup6r6 peut eire calcu16 comme la somme de deux variables d'ont tune a sa va leur la p#1us hasse ä des degr6s de dilution se tro,uvant dans la partie sup6rieure de l'intervalle utilis6, tandis que lautre a sa valeur la plus hasse dans 1a partie in f6rieure de 1'intervalle.
0n ne pouvait pas s'attendre ä ce que la valeur de pH d'environ 5,2 ä 5,3 utilisde dans les proced6s con nus de pr6cipitation de 1'euglobuline dann 1e s6rum sanguin humain sofft dgalement la valeur optimum dans la presente pr6cipitation. Cependant an a trouv6 sel'on linvention que 1e r6glage du pH ä 5,25, apres d.ilution, est parfaitement approprie.
Le proced6 selon 1'invention est illustr6 par les exem ples suivants. 0n pr6pare 1e pl'asma et 1e serum sanguins utili@s6s comme maueres de depart dans les essais indi qu6s ci-dessus de la maniere suivante : 0n ajoute au sang imm6diatement apres qu'il ait 6t6 pr61ev6, une so lution contenant un agent anti-coagulant, et, si an 1e desire un ou plusieurs antibiotiques, puis an refroidit. 0n centrifuge 1e sang ainsi trait6, apres 611minati.on des globules sanguins il reste 1e plasma sanguin.
0n pr6pare 1e s6rum en recalcifiant 1e plasma par addition de chlorure de calcium, an agite vigoureuse ment 1e Plasma Pendant quelques heures ce qui a po.ur effet de precipiter la fibrine. 0n separe celle-ci et utilise 1e serum r65istant comme matiere de d6part pour les essais.
R6cup6ration du plasminogene ä parti.r du s6rum de sang de porc.
<I>Exemple 1</I> 0n ajoute 200 ml d'eau distillee ä 50 ml de s6rum sanguin de po:rc (degr6 de dilution f = 5), an regle 1e pH ä 5,00 avec de l'acide acdtique, laisse 1e mdlange Pendant la nuit ä, 0 C, puis 1e centrifuge. 0n s6pare 1e pr6cipit6 d'euglobuline forme, <B>la</B> dissout dans 25 ml d'acide sulfurique dilu6, puis analyse la solution pour d6terminer la quantit6 .totale de matiere organique et 1'activit6 de plasmin du plasminogene contenu, apres activationles valeurs obtenues par une prcipitation d'euglobune correspondante, ä un degre de dilution de 20, ä un pH de 5,3 et ä une temp6rature de 00 C, etant fix6es ä 100. 0n calcule ensuite les quantit6s trouv6es dans 1'essai en pour cent des valeurs de r6ference.
On trouve de rette maniere une teneur de plasmin de 71,5 <B>%</B> et une activit6 specifique relative de 124 % (rapport entre la teneur de plasmin en po,ur cent et la quantit6 de matiere organique pr6cipit6e en pour cent apres multiplication par 1e facteur l00).
De fapon semblable, an obtient les r6sultats suivants en utilisant d'autres combinaisons de temp6ratures, de valeurs du pH et de degr6s de dilution que cel'les employ6es ci=dessus.
Exemple Degr6 Activite Activit6 NO de Temp6rature V'aleur plasminogene sp6cifique d'älution f. o C <B>du,</B> PH /o relative 0/0 2 8 0 5,00 89,3 123 3 5 0 5,25 75,4 122 4 8 0 5,25 100,6 122 5 5 0 5,50 68,8 116 6 8 0 5,50 86,2 116 7 5 12,5 5,25 58,5 121 8 8 12,5 5,25 82,8 120 9 5 25 5,25 57,6 122 10 8 25 5,25 81,6 117 Il ressort du tableau ei-dessus que dans un intervalle de temperatures relativement large, particulierement pour une valeur de pH de 5,25, an obtient aussi bien une activit6 plasminogene 61evee qu'une activiti spdcifique relative elevde, en utilisant des degrds de dilution de 5 ä 8 respectivement.
Recupdration du plasminogene ä partir du s6rum de sang de boeuf. Exemples <I>11 et 12</I> 0n pr6pare, de la maniere decrite dans les exemples precedents, des precipit6s d'euglobuline partir de portions de 50 ml de sdrum de sang de beruf.
Exemple Degr6 Activit6 Matiere Activite N de Temp6rature Valeur plasminogene organique specifique d.ilution f. O C du pH /0 % relative % 11 8 0 5,3 101 79,5 127 12 _ 5 0 5,3 85,1 63,6 134 Rdcupdration du plasminogene partir du Plasma de sang de porc. Exemple <I>13</I> 0n dilue 5 fois, 50 ml de Plasma de sang de Pore avee de 1'eau distillee (200 ml), regle 1e pH ä 5,3 avec de l'acide acdtique et laisse 1e mdlange Pendant la nuit 0" C, puis an le centrifuge. 0n spare 1e pr6cipit6 d'euglobuline Forme et 1e dissout dans 25 ml d'acide sulfurique dilu6, puis an analyse la solution pour determ,iner la teneur totale de matiere organique ainsi que 1'activitd de plasmin du plasminogene precipit6, apres activation, les valeurs pour lesdites variables trouvees par une precipitation d'euglobuline de s6rum ä un degr6 de dilution de 20, ä une valeur de pH de 5,3 et ä une temperature de 00 C 6tant fixees ä 100, an calcule ]es quantites trouvees dans 1'essai en pour cent des val'eurs de refdrence.
0n trouve de cette maniere pour 1'exemple ci-dessus une activit6 de plasmin de 81,8'0/0, une teneur en matiere orgamque de 149,0/() et une acti.vit6 spdcifique relative de
De fa@on semblable, les r6sultats rdun.is dann 1e tableau ci-apres sont obtenus en utilisant Plasma de porc et diverses combinaisons de degres de dilution, de temperatures et de valeurs de pH.
Exemple Degre Activite Matiere Activite <B><I>NO</I></B> de Temperature Valeur plasminogene organique specifique dilution f. O C du pH /0 % relative 0/0 14 5 0 5,3 78,8 159 49,6 15 8 0 5,3 98,4 153 64,3 16 8 0 5,3 101 155 65,2 <B>11</B> ressort des exemples ci-dessus que dans des conditions correspondant ä celles de la precipitation ä partir du Serum, il est possible de precipiter une quantite considerable de 1.'activit6 de plasmin directement ä partir du Plasma de porc.
Claims (3)
- REVENDICATION Procdd6 pour la r6cup6rati,on de plasminogene ä par- tir de s(#rum sanguin animal o-u ä partir de Plasma san- guin animal, par pr6cipitation d'euglobuline qui est trait6e pour obtenir 1e plasminogene, caractdris6 par 1e fait que Fon d,ilue 1e Serum ou 1e Plasma 5 ä 8 fois avec de 1'eau, ajuste 1e pH ä une valeur de 5 ä 6, puls s6pare 1e precipite.SOUS-REVENDICATIONS1. Procdde selon la revendication, caracterise par 1e fait qu'on d'il'ue le Serum 5 ä 6 fois.
- 2. Procede selon la revendication, caracteris6 par 1e fait qu'on ajuste 1e pH ä 5,25.
- 3. Procdd6 selon la revendication, caract@ris6 par 1e fait que 1'on r6cupere 1e plasm,inogene ä partir de sang de Pore.
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