CH457489A - Verfahren zur Herstellung von L(+) Glutaminsäure - Google Patents

Description

      Verfahren        zur        Herstellung    von     L(+)        Glutaminsäure       Die vorliegende Erfindung     betrifft        ein;    Verfahren  zur Herstellung von L(+)     Glutaminsäure,        welches    er  möglicht, die     Glutamins,äure    durch Fermentation eines       Biotin-haltigen        Nährmediums    mit einem     Biotin-erfor-          dernden,        Glutaminsiäure    erzeugenden Mikroorganismus  in hohen Ausbeuten zu erzielen.  



  Die wirtschaftliche Herstellung der     Glutaminsäure     ist von besonderer kommerzieller Bedeutung, da das       Mononatriumsalz    derselben als ein sehr     nützliches    Ge  schmacksmittel in vielen Lebensmittelprodukten An  wendung findet.

   In der wissenschaftlichen Literatur  und in der Patentliteratur     sind    viele Methoden zur       Herstellung    der     Glutaminsäure        beschrieben.    Die mei  sten dieser sind entweder chemische     Methoden,    welche  zu der     racemischen    Form der     Glutaminsäure    führen und,  zur Erzielung der natürlichen Form, eine Trennungs  operation erfordern, oder diese Methoden sind Isolations  methoden, wobei die     Glutaminsäure    aus den verschiede  nen natürlichen Quellen gewonnen wird.

   Es wird auch  über die Herstellung von     Glutaminsäure    aus     a-Keton-          glutarsäure    berichtet. Alle diese Verfahren lassen vieles  zu wünschen übrig, indem sie entweder zu teuer sind,  niedrige Ausbeuten geben oder von Schwierigkeiten in  der Zugänglichkeit der Ausgangsmaterialien abhängen.  



  Erst in der letzten Zeit ist vorgeschlagen worden,  die in der Natur vorkommende Form der Glutamin  säure durch     direktes    Fermentieren eines Nährmediums  mit     einem    passenden Mikroorganismus zu     erzeugen.    So  sind     Herstellungsverfahren    von L(+)     Glutaminsäure     unter Verwendung verschiedener Mikroorganismen,  wie beispielsweise     Mikrococcus        glutamicus    oder von       Cephalosporium    C.,     bekanntgeworden.    Neuerdings ist  aus der Literatur zu entnehmen, dass     Glutaminsäure     mit einem Bazillus,

   welcher als     Zwischentypus    von       Bacillus        megaterium    -     Bacillus        cereus    identifiziert  wurde, hergestellt wird. Andere Sorten von Mikroorga  nismen die sich nach Berichten zur Herstellung von       L-Glutaminsäure    eignen sind die     Gattungen,    von     Brevi-          bacterium,        Pseudomonas,        Aspergillus        und        Arthrobac-          ter.       Es ist gefunden     worden.,

          dass        manche    von     diesen     zur     Herstellung    von     Glutaminsäure    befähigten     Mikro-          organismen    für ihr Wachstum     Biotin        erfordern..    Es ist  weiter gefunden worden, dass zwar     Biotin    für das  Wachstum der     Organismen    notwendig ist, dass aber ein  Überschuss an     Biotin    im     Fermentationsmedium        ein          äusserst    üppiges und reiches Wachstum hervorruft,

    welches im Endresultat die Herstellung der     Glutamin-          säure    entgegengesetzt     beeinflusst.    Es wird von der  Fachwelt zugegeben, dass diese Eigenschaft der     Biotin     erfordernden, die     Glutaminsäure    erzeugenden Mikroor  ganismen einen ernsten Nachteil bei der wirtschaft  lichen Herstellung von     Glutaminsäure    bildet, insbeson  dere deshalb, da die im allgemeinen verwendeten  Nährmaterialien einen relativ hohen     Biotingehalt    auf  weisen.

   Obwohl die optimale     Biotinkonzentration    in  einem     gänzlich    synthetischen Medium ohne     ernste     Schwierigkeiten eingestellt werden konnte, ist dies in  einem Medium, welches aus in der Natur vorkommen  den Nährstoffen, wie Melassen und     Maiseinweichflüs-          sigkeit,    zusammengestellt wurde, noch nicht möglich  gewesen.

   Für eine wirtschaftliche Herstellung von     Glu-          taminsäure    bedeutet dies ein schwieriges Problem, da  synthetische Medien gewöhnlich     sehr    kostspielig sind  und für die Herstellung im Grossen     normalerweise     nicht verwendet werden     können.     



  Es ist nun gefunden worden, dass das     Wachstum     der     Biotin    erfordernden     Organismen    in einem     Fermen-          tationsmedium,    welches     Biotin    enthält, wirksam durch  Hinzugabe     eines        Inhibitors    zu dem     Fermentationsme-          dium    begrenzt oder gelenkt werden kann.

   Es ist weiter  entdeckt worden, dass falls das Wachstum solcher  Organismen auf die beschriebene Weise gelenkt oder  begrenzt wird, mit diesem die Fähigkeit dieser Organis  men     Glutaminsäure    zu bilden, in der Regel in     keiner     Weise entgegengesetzt beeinflusst     wird        und:        dass    im  Gegenteil     Glutaminsäure    in bedeutenden Mengen ange  häuft werden kann.

   Dies ist ein sehr wichtiges charak  teristisches Merkmal, da manche das Wachstum der  Organismen begrenzenden Methoden auch die Gluta-           minsäurebildung    einschränken, und es     deshalb    klar er  sichtlich ist, dass solche     Verfahren,    nicht     zufriedenstel-          lend        sein    können.  



  Es ist nun das     Ziel    der vorliegenden     Erfindung,    ein       mikrobiologisches        Verfahren:        zur        Herstellung    von     Glu-          taminsäure    mit Hilfe von     Biotin    erfordernden Organis  men     in.    einem     Biotin        enthaltendem    Medium zu liefern:

  ,  bei welchem Verfahren     die        schädlichen        Auswirkungen          eines    Überschusses an     Biotin    auf die     Anreicherung    der       Glutaminsäure    unterbunden oder     neutralisiert    werden  können, und welches erlaubt,     billige        und        in    der     Natur          vorkommende    Nährmedien     zu    benützen.  



  Wie schon oben angegeben, erfordern     viele        Mikro-          organismen        die        fähig        sind,        Glutamins@äure        durch     direkte Fermentation herzustellen,     Biotun    zu     ihrem     Wachstum. Es ist aber     andererseits    bekannt, dass zwi  schen der Menge des     Zellenwachstums    und der herge  stellter Menge von     Glutammnsäure        eine    umgekehrte  Beziehung besteht.

   Falls also der     Biotingehalt    im  Medium ein gewisses     Optimum        überschreitet,    entsteht,  auf     Kosten        der    Bildung der     Glutaminsäure,    ein über  grosses und unkontrollierbares     Wachstum    der Organis  men.

   Es ist beobachtet werden, dass in den     meisten          Biotin    erfordernden,     Glutaminsäure        erzeugenden          Mikroorganismen    eine     optimale        Biotinkonzentration,     sowohl für das Wachstum der     Mikroorganismen    als zur       Glutaminsäureerzeugung,    von um 1,0 bis 5,0 Teile pro  Billion (d. h.1-5     Mikrogramm    per Liter) die in der  Regel Optimale ist.

   Während diese Konzentration in       einem    synthetischen     Medium        kontrolliert    werden     kann,     enthalten     in    den leicht     zugänglichen    und normalerweise  verwendeten     Ausgangnsmaterialien        soviel    wie 0,3     y/g    an       Biotin.    Bei Verwendung dieser     Materialien    als     Nähr-          medium    bildet sich     Biotin    in der     Fermentamonsbrühe     in Mengen von 30-50 Teilen pro Billion.

   Falls diese  Mengen unkontrolliert     belassen    werden, wachsen     die     Organismen in einem solchen Medium in einem Masse,  dass sich nur unbedeutende Mengen an     Glutaminsäure     bilden können.  



  Wir haben nun gefunden, dass bei     Hinzugabe        einer          kleinen    Menge eines     entsprechenden,        Inhibitors    zu dem       Fermentationsmedium    nach einer     anfänglichen    Periode  des Wachstums der Mikroorganismen, es möglich ist,  das Wachstum dieser Organismen     aufzuhalten.    und auf  diese Weise zu ermöglichen, dass sich bedeutende  Mengen an     Glutaminsäure    in diesem Medium anrei  chern.

   Als     Inhibitor        wird    vorgesehen, ein     Antibioticum     zu     verwenden,,    wie z. B.     Penicillin:,        Cephalosporin    C,       Oxamy        cin,        Novobiocin,        Oxytetracyclin,        Chlortetracy-          clin,        Tetracyclin,        Streptomycin,        Bacitracin    und ähn  liche.

   Aber auch andere     Inhibitoren,    wie Phenol,       Natriumpropionat,        Resorcinol,        Cetyltrimethylanunoni-          umbromid    und     ähnliche,    können mit Erfolg     benützt     werden.

   Als für die vorliegende     Erfindung    besonders       nützliche        Inhibitoren    wird vorgesehen,     ein.        Antibioti     cum aus der     Gruppe,    die oben beispielsweise durch  Penicillin,     Cephalosporin    und     Oxamycin        angegeben          wurde,    zu verwenden.

   Von diesen ist     Penicillin    das am  meisten     zufriedenstellendste.    Die hier verwendete Be  zeichnung für     Penicillin    umfasst die     verschiedenen     Arten der     Penicillin-Gruppe,    wie     Penicillin    G, a     -Phen-          oxyäthylpenicillin    und     andere    sog.  synthetische     Peni-          cilline ,    welche durch in     der    Fachwelt bekannte       Methoden    hergestellt werden     können.     



  Das Penicillin     wird        normalerweise    zu dem Fermen  tationsmedium in Form     eines        Salzes,    wie     Procan,          Dibenzyl-äthylendiamin    oder ähnlichen     Aminosalzen,       oder eines Metallsalzes, wie     Calcium,    Natrium oder       Kaliumpenicillin,    hinzugegeben.

   Da     die        Fermentation          im        allgemeinen    in     einem    wässrigen Medium durchge  führt wird, ist es von Vorteil, ein wasserlösliches     Peni-          cillinsalz,    am besten eine wässrige Lösung von     Kalium-          oder        Natriumpenicillin        zu    verwenden. Es     sind    nur       kleine    Mengen von     diesem        Antibioticum    erforderlich.

    Eine     Wachstumsverzögerung    mit entsprechender     An-          reicherung    an     Glutaminsäure    wird bei Anwesenheit  von 0,05 Einheiten     Penicillin    pro ml     Fermentationis-          brühe    erhalten, obschon für optimale Resultate 0,2 bis  etwa 10     Einheiten    pro     ml    Brühe     wünschenswert    sind.

         Grössere    Mengen     sind    auf die     Anreicherung    der     Gluta-          minsiäure        nicht    schädlich     und        können    auch     gewünsch-          tenfalls    benützt     werdn.    Die     optimale    Menge variiert       ein    wenig im     Verhältnis    mit dem     Biotingehalt    im  Medium.  



  Der     Inhibitor    wie das     Penicillin    wird nach der       Impfung    des Mediums mit dem:     genannten        Organismus     und nach wesentlicher     Vermehrung    dieses Organismus       im.        Nährmedium,    zum     Fermentationsmedium        hinzuge-          fügt.    Es ist wünschenswert, dass der Organismus unge  fähr soweit wächst, dass sich in     diesem    eine Menge  von etwa 1,0-5,

  0 Teile per     Billion        Biotin        befindet.    Das       Zellenwachstum    kann bequem     durch        Messen    der opti  schen Dichte des     Fermentationsmediums    in periodi  schen Zeitabschnitten, mit Hilfe     einer    im Beispiel 1       beschriebenen    Methode,     verfolgt    werden.

   Der     Inhibitor     wird     vorteilhafterweise    bei.     einer    optischen Dichte     der     ganzen Brühe innerhalb des Bereiches von etwa 15-30       hinzugefügt.    Es soll aber hervorgehoben werden, dass  dieses nur     einen        bevorzugten    Aspekt der     vorliegenden     Erfindung darstellt und dass     vorteilhafte        Ergebnisse          erhalten    werden können, falls der     Inhibitor    in einem       frühern    oder spätem Stadium der Fermentation zuge  setzt wird,

   und auch gute Ergebnisse können, durch       Hinzugabe    des     Inhibitors    bei einer optischen Dichte  des Mediums von etwa 5, erreicht werden. Die auf die  sem Gebiete Fachkundigen werden es,RTI ID="0002.0223" WI="15" HE="4" LX="1781" LY="1643">  sicherlich    zu  schätzen wissen, dass diese optische Dichte durch.

   ein       prozentuelles        Ärasteigen    im Zellenvolumen ausgedrückt  werden kann und dass dieses     Ansteigen    als Mass des       Wachstums    verwendet werden     kann.    In den meisten       Fällen    setzt sich ein begrenztes     Wachstum    der Mikro  organismen und ein Ansteigen     im        Zellenvolumen    nach       Hinzugabe    des     Inhibitors    fort,     diesies    Ansteigen ist aber       nicht        kontinuierlich,

      und auch     nicht    unkontrollierbar.  



  Die     in    dieser     Erfindung        bevorzugten        Inlubitoren     sind jene, welche die     Durchlässigkeit    der     Zellwand     oder der     Zellmembran    des     Biotin        erfordernden,        Glu-          taminsäure        produzierenden        Mikroorganismus    verän  dern,

   so dass die durch diesen     Organismus    erzeugte       Glutaminsäure    an das     Fermentationsmedium    freigege  ben     werden,    kann. So eine Freigabe     der        Glutaminsäure     an das umgebende     Medium    durch die     Zellern    erlaubt es  dem Organismus     die        Glutaminsäure    fortgesetzt zu     bio-          synthetisieren,    was     sonst    dieser     nicht    zu     tun    imstande  wäre.

   Die für das     erfindungsgemässe        Verfahren    besten       Inhibitoren    sind jene, welche ein     Verhältnis    der ausser  zellularen     Glutaminsäure    zur     innerzellularen        Glutamin,     säure nicht grösser als 50 zu bilden vermögen.

   In vie  len Fällen verursachen     dieselben    ein     Absinken    von       mindestens    etwa 50 % in der Menge der     intrazellularen          Glutaminsäure.        Wir    haben gefunden, dass     die        antibioti-          sehen        Penicilline        Cephalosporin    C,     Streptomycin    und       Oxamycin    hoch     wirksam    als     Inbibitoren        sind.     



  Die Fermentation als solche, sowie     die    Zusammen-           setzueg    des Nährmediums und die verwendeten     Bedin-          gungen,    sind im     allgemeinen    jene, welche in der Fach  welt als geeignet für die     direkte    Herstellung von     Gluta-          minsäure    in einem Nährmedium mit einem     Biotin    er  fordernden,     Glutaminsäure    erzeugenden Mikroorganis  mus bekannt sind.

   Das Nährmedium     muss    eine Quelle  von Kohlenstoff und Stickstoff enthalten und norma  lerweise auch     kleine        Mengen    von Salzen und Minera  lien, wie Phosphate, Sulfate, Magnesium, Mangan und  Kalium. In manchen Fällen können diese     kleinen        Men,     gen durch den als     Kohlenstoffquelle    benützten Nähr  stoff geliefert werden.

   Das Medium enthält     selbstver-          ständilich    auch     Biotin.       Als     Kohlenstoffquelle    können jene Materialien ver  wendet werden, welche normalerweise bei einer Fer  mentation benützt werden, wie     Dextrin,    Rübenmelasse,       Zuckerrohrmelasse,    Getreide, Sirupe     und    ähnliche.

   Da  diese Kohlenhydrate     Biotin    enthalten, wirken sie auch  als     Biotinquelle    für den     Organismus.        Falls    diese Koh  lenhydrate     in    solchen Mengen verwendet werden, dass  sie genügend Kohlenstoff zu liefern imstande sind, wird  gleichzeitig     eine    zu grosse     Menge    an     Biotin    eingeführt  und deshalb wird eine Zugabe     eines        Inhübitors,    vor  zugsweise eines Antibiotikums, in Übereinstimmung  mit unserer Erfindung, notwendig.

   Unter einer zu gros  sen Menge an     Biotin    wird jene     verstanden,    welche die       Konzentration    sowohl für ein optimales     Wachstum    als  auch für die     Glutaminsäureerzeugung    übersteigt. Der  Stickstoff kann durch organische oder durch anorgani  sche Salze, oder durch komplexe Nährstoffe, wie Mais  einweichflüssigkeit, Ammoniak oder Harnstoff, gelie  fert werden.

   In jenen Fällen., wo die     Stickstoffquelle     auch     Biotin    enthält, muss dasselbe beim     Inhibitorzu-          satz    in Betracht gezogen werden, um den unerwünsch  ten Effekt     eines    solchen Überschusses an     Biotin    auszu  schalten.  



  In der Regel ist es wichtig, dass der     pH    des     Fer-          mentationsmediums    zur Erzielung eines optimalen Er  trages an,     Glutaminsäure    gesteuert wird. Es wird vorge  zogen., den     pH    zwischen 6,0 und 8,5, vorzugsweise  zwischen 6,5 und 8,0, aufrechtzuerhalten.

   Dies wird in  geeigneter Weise durch Hinzugabe von Harnstoff oder  Ammoniak, falls notwendig während der Fermentation  erzielt, obwohl Basen, wie     Alkalimetallhydroxide,    ent  weder     allein    oder in Kombination mit     Ammoniumhy-          droxid,        gewünschtenfalls    benützt werden     können.    Die  Fermentationen führt man im allgemeinen bei Tempe  raturen von etwa 26-34  C aus, obgleich die bevor  zugte Temperatur in Abhängigkeit vom     verwendeten     Mikroorganismus     variiert    wird.  



  Die Fermentation wird     in    der Regel unter     aeroben     Bedingungen während einer     Zeitspanne    von etwa  24-72 Stunden, vorzugsweise während etwa 38-60       Stunden,    durchgeführt.

   Die meisten Organismen erfor  dern eine     Fermentationszeit    von etwa 48     Stunden    und  geben sehr     zufried;enstellende        Ergebnisse.    Nach Ablauf  dieser Zeit haben sich bedeutende     Mengen    an     Gluta-          minsäure,    d. h. über 15 g pro Liter angehäuft, in einem  Medium, welches überschüssige Mengen an     Biotin    und  einen     Inhibitor,    wie Penicillin, enthielt.  



  Die so erzeugte     Glutaminsäure    kann mit Hilfe der  in der Fachwelt bekannten Methoden aus dem     Medium     gewonnen werden. Diese umfassen Absorption und       Desorption    an geeigneten     Ionenaustauschharzen,    Ent  fernung der Zellen und Konzentrationen des die Glut  aminsäure enthaltenden Filtrates, und/oder Absorption    auf mit Säure gewaschener Tonerde und     eluieren    von  dieser mit verdünnter     Chlorwasserstoffsäure.     



  Bei der Ausführung des erfindungsgemässen Ver  fahrens, ist der besondere zur Fermentation verwen  dete     Mikroorganismus    nicht     entscheidend    und jeder       Biotin    abhängige,     Glutaminsäure    erzeugende Organis  mus ist dazu geeignet.

   Diese umfassen Bakterien,  Hefen und Pilze, wie     Glutaminsäure    erzeugende  Stämme von     Bacillus        subtilis,        Escherichia        coli,        Micro-          coccus        glutamicus,        Bacillus        megaterium-Bacillus        cereus     Zwischentypus,     Brevibacterium        divaricatum,        Brevibac-          terium        aminagenes,

          Arthrobacter        globiforme,        Bacillus          inegaterium,        Brevibacterium        alanncum,        Brevibacterium          lactofermentus    und ähnliche.  



  <I>Beispiel 1</I>  A. Es wurde ein wässriges Medium hergestellt, wel  ches die folgende     Zusammensetzung        besitzt:     
EMI0003.0106     
  
    Gew. /o
<tb>  NH4H2P04 <SEP> 0,1
<tb>  (NHIHP04 <SEP> 0,1
<tb>  M9S04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> 0,05
<tb>  MnS04 <SEP> - <SEP> 4H20 <SEP> 0,004
<tb>  KIS04 <SEP> 0,3
<tb>  (NH4)2S04 <SEP> 0,2
<tb>  Harnstoff <SEP> 0,5
<tb>  Hi-test <SEP> Melasse <SEP> zur <SEP> Erzielung <SEP> einer
<tb>  Kohlenhydratkonzentration <SEP> von <SEP> 12,

  7       Das     Ammoniumsulfat    und der     Harnstoff    werden  jedes für sich bei 100  C     sterilisiert    und der Rest des  Mediums bei 120  C     während    etwa 1     Minute.        Das     Medium enthält 37,5 Teile pro     Billion        Biotin    aus der  Melasse stammend.

   3,01 dieses Mediums werden in  einem     5-Liter        Fermentatiornsgefäss,    welches mit einem       Rührer    und einer Luftzufuhr versehen ist, aseptisch  mit 8     Volumprozenten        einer        Wachstumkultur        eines          Biotin    erfordernden,     Glutaminsäure    erzeugenden Stam  mes eines Organismus, beschrieben bei     Kinoshita        und     Mitarbeiter als Stamm M-560 von     Micrococcus        gluta-          micus,    geimpft.

       ( Taxonomical        Study    of     Glutamic          Acid        Accumulating        Bacteria,        Micrococcus        glutamicus          nov.        sp.,         Bull.        Agr.        Chem.        Soc.    Japan,     Vol.    22,     No.    3,  pp. 176-185, 1958).

   Eine Kultur dieses Organismus ist  in der Sammlung der amerikanischen Typenkulturen  unter     ATCC        No.    13761 deponiert.  



  Die Fermentation wurde bei 33  C     unter    Rühren  mit 700 U/min. und einer Belüftung von 1,75 Liter/Min.  durchgeführt. Während der Fermentation wurden, zur  Aufrechterhaltung des     pH    zwischen 7,0 und 8,0, falls  notwendig, 20 ml Mengen einer sterilen     30o/oigen        wäss-          rigen    Lösung von Harnstoff     hinzugegeben.     



       Falls    die optische Dichte der     Fermentations@brühe     nach 10-20 Stunden     die    Zahl 20 erreicht, werden  4000     Einheiten    vom sterilen     Kalimpienicilän    G per  Liter Brühe zu der Fermentation hinzugegeben.  



  Nach Ablauf der     Fermentationszeit    von 48     Stun@-          den        enthielt    das Medium 40 g/1 an     Glutam'nsäure.     



  B. In einem zweiten     in,    derselben Art wie oben be  schriebene Fermentation durchgeführten Vergleichsan  satz, aber ohne Hinzugabe von     Penicillin,    enthielt das  Medium nach Ablauf von 48     Stunden.    4 g/1     an        Gluta-          minsäure.     



  Die     in    diesem und in den     folgenden        Beispielen    be  schriebenen optischen     Dichtemessungen    werden so aus-           geführt,    dass man     eine        kleine    Portion aus der Fermen  tationsbrühe     entnimmt    und 1     ml    dieser Brühe auf ein       Volumen    von 100     ml    mit Wasser verdünnt.

   Die Dichte  der     verdünnten    Probe     wird    mit     einem        Becl@nan:-Spec-          trophotometer    bei einer Wellenlänge von 700 mg ge  messen. Die abgelesene Dichte multipliziert     mit    100  ergibt die hier     angegebenen    optischen     Dichtewerte.     



  Die     Fermentationsbrühen        werden    auf Glutamin  säure durch den     Decarboxylaseversuch    geprüft, wel  cher in der     Veröffentlichung        Manometric        Techniques          and        Methods,    bei Umbreit,     Burris    und     Stauffer,    3d     Ed.,          Burgess        Publishing    Co., S. 207, beschrieben ist.  



  Die für die     Fermentationen    oben beschriebene       Impfkultur    wurde durch das.     Wachstum.    der Organis  men in einem Keimmedium mit der     im    weitern angege  benen     Zusammenstellung,        hergestellt.     
EMI0004.0035     
  
     /o
<tb>  Glucose <SEP> (anhydr.) <SEP> 5,0
<tb>  KH2P04 <SEP> 0,05
<tb>   & HP04 <SEP> 0,05
<tb>  MgS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> 0,025
<tb>  FeS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> 0,001
<tb>  MnS04 <SEP> - <SEP> 41-120 <SEP> 0,001
<tb>  f4)2so4 <SEP> 0,5
<tb>  Harnstoff <SEP> 0,

  5
<tb>  Biotin <SEP> 11 <SEP> Teile
<tb>  per <SEP> Billion       Die Fermentation wurde     unter        Rühren        und:    Belüf  tung bei 27,5  C, während 8-14 Stunden, bei einem       pH    von 7,0-8,0 gesteuert und durch periodische     Hin-          zugabe    von Harnstoff, durchgeführt.  



  <I>Beispiel 2</I>  Bei Wiederholung der im Beispiel 1A und 1B be  schriebenen Versuche unter Verwendung des im Kana  dischen Patent Nr. 562 728 beschriebenen     Micrococ-          cus        glutamicus    Stamm Nr. 541     (ATCC    Nr. 13058),  wurden     ähnliche        Glutaminsäureausheuten    erhalten.  



  <I>Beispiel 3</I>  Eine Serie von 250     ml-Schüttelflaschen    vom Typ  Hinton enthielt jede eine Menge von 35     ml        eines    steri  len wässrigen     Mediums        der    folgenden     Zusammenset-          zung:     
EMI0004.0055     
  
    <U>Gew. / </U>
<tb>  Dextrose <SEP> (anhydr.) <SEP> 11,5
<tb>  NH4112P04 <SEP> 0,1
<tb>  <B>(NH4)2</B>HP<B>O4 <SEP> 0,1</B>
<tb>  MgS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> 0,05
<tb>  MnS04 <SEP> - <SEP> 4H20 <SEP> 0,004
<tb>  <B>K2S04</B> <SEP> 0,3
<tb>  Harnstoff <SEP> 0,5
<tb>  <B>4)2</B>S<B>04</B> <SEP> 0,2
<tb>  Biotin <SEP> wie <SEP> in <SEP> Tab. <SEP> I.

         welches mit einer     Kultur    des im Beispiel 1 verwende  ten Organismus geimpft, hierauf die Flaschen mit steri  ler Gaze bedeckt und auf einer     Rotationsschüttelma-          schine    (50,8 mm Schub bei 220     U/min)    bei 33  C wäh  rend 48 Stunden geschüttelt, wobei der     pH        zwischen     7,0 und 8,0 durch periodische     Hinzugabe    einer sterilen  Lösung von     Harnstoff    aufrechterhalten wurde.

   Wie aus  der Tabelle I ersichtlich, wurde zu     gewissen    Flaschen    nach     Beginn    der     Fermentation    steriles     Kaliumpenicillin     G     hinzugefügt.    Die     einzelnen.    Flaschen wurden auf       Glutaminsäure    nach 48 Stunden geprüft. Die erhalte  nen Resultate sind in Tabelle I eingesetzt.

    
EMI0004.0071     
  
     <I>Beispiel 4</I>  Es wurden Fermentationen ausgeführt unter Benüt  zung des Organismus und     unter    den     Bedingungen    vom  Beispiel 1 und in den     folgenden    Medien:  
EMI0004.0075     
  
    Medium <SEP> A <SEP> Medium <SEP> B
<tb>   /a <SEP>  / 
<tb>  NH4H2P04 <SEP> 0,1 <SEP> 0,1
<tb>  (NH4)2EP04 <SEP> <B>0,1 <SEP> 0,1</B>
<tb>  M9S04.7H20 <SEP> 0,05 <SEP> 0,05
<tb>  MnS04.4H20 <SEP> 0,004 <SEP> 0,004
<tb>  K,S04 <SEP> 0,3 <SEP> 0,3
<tb>  (NH4)2S04 <SEP> 0,2 <SEP> 0,2
<tb>  Harnstoff <SEP> 0,5 <SEP> 0,5
<tb>  Dextrose <SEP> Monohydrate, <SEP> 12,5 <SEP> -.

    HL-test <SEP> Melassen
<tb>  die <SEP> eine <SEP> Kohlen  hydratkonzentration
<tb>  ergeben <SEP> von <SEP> -- <SEP> 12,5
<tb>  Biotin <SEP> 37,5 <SEP> Teile <SEP> 37,5 <SEP> Teile
<tb>  per <SEP> Billion <SEP> per <SEP> Billion       *     anwesend    in den Melassen.  



  Zu der     Fermentation    mit dem Medium A wurde       beim:    Erreichen der optischen Dichte von etwa 6 der  Brühe     Kaliumpenicillin    G     in    Form einer sterilen     wäss-          rigen    Lösung in     einer    Menge von     5000,u/1    der Brühe      hinzugefügt. Dies geschah 1 Stunde nach Beginn der  Fermentation. Eine zweite     gleiche    Hinzugabe von  Penicillin wurde zu der Fermentation mit dem Medium A  38 Stunden nach der Impfung vorgenommen. Dagegen  wurde zu der Fermentation mit dem Medium B     kein     Penicillin     hinzugegeben.     



  Die folgenden Ausbeuten an     Glutaminsäure        wurden     erhalten:  
EMI0005.0006     
  
    Zeit <SEP> nach <SEP> der <SEP> Impfung <SEP> Glutaminsäure <SEP> g/1
<tb>  Medium <SEP> A <SEP> 48 <SEP> 29
<tb>  Medium <SEP> B <SEP> 46 <SEP> 4       <I>Beispiel 5</I>  Es wurden zwei Fermentationen mit dem Organis  mus     und.        unter    den Bedingungen vom Beispiel 1 durch  geführt.

   Beim Erreichen der optischen Dichte von etwa  20 in der Brühe, wurden 4 Einheiten von     Kaliumpeni-          cil.lin    G pro ml der Brühe zu .dem ersten     Fermentator     und 100 Einheiten von     Kaliumpenicillin    G pro ml der  Brühe zu dem andern     Fermentator    hinzugefügt. Nach  Ablauf von 48 Stunden wurden 30 g/1     Glutaminsäure     in dem ersten     Fermentator    und 33 g/1     Glutaminsäure    in  dem zweiten     Fermentator    gefunden.  



  <I>Beispiel 6</I>  A. ES wurde ein wässriges     Medium    mit der folgen  den Zusammensetzung hergestellt:  
EMI0005.0019     
  
    Gew.o/o
<tb>  <B>NH4H2P0 <SEP> 0,1</B>
<tb>  (NH4)2HPO4 <SEP> <B>0,1</B>
<tb>  MgS04 <SEP> 7H20 <SEP> 0,05
<tb>  MnS04 <SEP> 41120 <SEP> 0,004
<tb>  <B>K,S04</B> <SEP> 0,3
<tb>  (NH4)2S04 <SEP> 0',2
<tb>  Harnstoff <SEP> 0,4
<tb>  Antischaummittel
<tb>  der <SEP> Marke <SEP> Swifi <SEP> Nr.

   <SEP> 51 <SEP> 0,02 <SEP> (im <SEP> Vol.)
<tb>  Dextrose <SEP> für <SEP> die <SEP> Kohlen  hydratkonzentration <SEP> von <SEP> 12,7
<tb>  Biotin <SEP> 2,5 <SEP> y/Liter       Das     Kaliumsulfat    und     Amrnoniumsulfat    wurden  zusammen sterilisiert und der     Harnstoff    separat steri  lisiert bei 115  C, das     Biotin        sterilisiert,    separat bei  120  C und der Rest des Mediums wurde bei 115  C  sterilisiert.

   53 000 Liter dieses Mediums wurden     in          einem        Fermentator,    welcher mit einem     Rührer    und       Luftzufuhr    ausgerüstet     war,    aseptisch geimpft mit einer  9,2     Vol.o/oigen    Wachstumskultur     eines        Biotin    erfor  dernden,     Glubamin!säure        prodzierenden        Stammes    eines  Organismus,

   welcher von     Kinoshita        und    Mitarbeiter als  Stamm M-560 von     Micrococcus        glutamicus        in    der  Schrift      Taxonomical        Study    of     Glutamic        Acid        Accu-          mulating        Bacteria,        Micrococcus        glutamicus        nov.        sp.,,

            Bull.        Agr.        Chem.        Soc.    Japan.     Vol.    22,     No.    3, pp.     176--          185,    1958), beschrieben wurde. Eine Probe     dieser    Kul  tur wurde     in    der Sammlung der amerikanischen Kul  turtypen unter     ATCC    Nr. 1.3761 deponiert.  



  Die Fermentation. wurde bei 33  C unter Rühren       mit    100     U/min.    und bei einer Belüftung von 1421/       min.,    bei     einem    positiven Druck von 0,35     kg/cm2     durchgeführt. Zur     Aufrechterhaltung    des     pH        zwischen     7,0 und 8,0 wurden während der     Fermentation    be-    stimmte Mengen     einer    sterilen     30o/oigen    wässrigen  Lösung von Harnstoff     hinzugegeben.     



  B. Nach einer     Fermnentationsdauer    von 18 Stunden,  wurde ein     aliquoter    Teil der Brühe entnommen.  200 ml Portionen dieses Gemisches     wurden    zentrifu  giert und die oben schwimmende Flüssigkeit entfernt.

    Zu diesen nassen Zellen     wurde;    eine wässrige Lösung  von 0,1 M     Phosphatpuffer        hinzugegeben    und die  Lösung auf ein Volumen von 200 ml     aufgefüllt.    Her  nach wurde Dextrose, auf     eine        Endkonzentration    von       7,5        bis        8,0        %,

          hinzugefügt.        Zu        dieser        Lösung        wurde          eine        kleine    Menge     eines        pH-Indicators,        Phenolrot-          Bromthymolblau        hinzugegeben    und diese Lösung in  Portionen. von 35 ml     in    Schüttelflaschen vom Typ Hin  ton geteilt.

   In diese Flaschen wurde     Biotin        und        Phen-          oxy-methyl-penicillin,    in Mengen wie sie aus der fol  genden Tabelle zu entnehmen sind, hinzugegeben. Die  Flaschen wurden hernach mit einer sterilen Gaze be  deckt und auf einer     Rotationsschüttelmaschine    50,8 mm  Schub bei 220 U/min. bei 33  C, während     211/2    Stun  den,     geschüttelt,    wobei der     pH    zwischen 7,0 und 8,0  durch periodische Hinzugabe einer     sterilen    Lösung von  Harnstoff     aufrechterhalten    wurde.

   Nach Ablauf von       211/2    Stunden wurden die einzelnen Flaschen auf     Glu-          taminsäure    geprüft. Die     Ergebnisse        sind    im folgenden  angeführt:

    
EMI0005.0117     
  
    Glutamin  Biotin <SEP> Antibiotikum <SEP> säure
<tb>  Flasche <SEP> y/Liter <SEP> Einheiten/ml <SEP> mg/ml
<tb>  1--4 <SEP> 35 <SEP> 0 <SEP> 14,1
<tb>  5-8 <SEP> 35 <SEP> 3,5 <SEP> 31,3
<tb>  9-12 <SEP> 35 <SEP> 35,0 <SEP> 35,9
<tb>  13-16 <SEP> 35 <SEP> 100 <SEP> 36,9       <I>Beispiel 7</I>  Man arbeitet wie im Beispiel 6, ausgenommen dass  der     aliquote    Teil der Brühe nach einer     14-stündigen          Fermentationszeit    entnommen     wurde.    und     eine        7,5o/oige.          Dextrosekonzentration    und eine     24-stündige    Inkuba  tionszeit beim Vorgehen im Beispiel 6B verwendet  wurde.  



  Das benützte Antibiotikum war     a-Phenoxymethyl-          penicillin        (Syncillin)        statt    dem     Phenoxymethyl-penicl-          lin.    Die folgenden Resultate wurden erhalten:  
EMI0005.0132     
  
    Glutamin  Biotin <SEP> Antibiotikum <SEP> säure
<tb>  Flasche <SEP> y/Liter <SEP> Einheiteniml <SEP> mg/ml
<tb>  1-4 <SEP> 35 <SEP> 0 <SEP> 4,1
<tb>  5-8 <SEP> 35 <SEP> 3,5 <SEP> 33,2
<tb>  9-12 <SEP> 35 <SEP> 35,0 <SEP> 36,0
<tb>  13-16 <SEP> 35 <SEP> 100 <SEP> 37,3       <I>Beispiel 8</I>  Das Beispiel 6     wurde    mit den folgenden Änderun  gen wiederholt:

   Der     aliquote    Teil der Brühe wurde aus  der Fermentation aus 20     Stunden        entnommen,    die     Inr-          kubation    vom Beispiel. 6B wurde während 21 Stunden  unter     Benützung    einer     Dextrosekonzentration    von       7,5        %        ausgeführt.        Statt        dem        Phenoxymethyl-penicillin     wurde zu den.

   Flaschen das     Oxamycin        hinzugefügt.    Es  wurden folgende Resultate erzielt:      Glutamin  Biotin     Oxamycin        säure     Flasche     y/Liter        y/ml        mg/ml          1-4    35 0 2,4  9-12 35 300 27,2  13-16 35 500 30  <I>Beispiel 9</I>  Es wurde eine Serie von 250 ml Schüttelflaschen  vom Typ Hinton zusammengestellt, deren jede 35 ml  eines sterilen wässrigen Mediums von der folgenden       Zusammensetzung    enthielt:

    
EMI0006.0008     
  
    Gew.o/o
<tb>  Dextrose <SEP> 11,5
<tb>  NH4H2P04 <SEP> 0,1
<tb>  <B>M4)204 <SEP> 0,1</B>
<tb>  MgS04 <SEP> - <SEP> 7H20 <SEP> 0,05
<tb>  MnS04 <SEP> - <SEP> 4H20 <SEP> 0,004
<tb>  K2S04 <SEP> 0,3
<tb>  Harnstoff <SEP> 0,5
<tb>  <B>M4/2504</B> <SEP> 0,2
<tb>  Biotin <SEP> 37,5 <SEP> Teile
<tb>  pro <SEP> Billion
<tb>  Phenol-Rot-Indikator <SEP> 0,0005
<tb>  Bromthymol-BlauIndikator <SEP> 0,0005       und mit     einer        Biotin    erfordernden,     Glutaminsäure    pro  duzierenden Kultur des Organismus     Micrococcus        gluta-          micus        geimpft,    die Flaschen mit einer sterilen Gaze  bedeckt,

   und auf einer     Rotationsschüttelmaschine     (50,8     mm    Schub bei 220     U/min.    bei 33  C)     während     48 Stunden,     geschüttelt,    wobei der     pH    zwischen 7,0  und 8,0 durch     periodische    Hinzugabe     einer        15o/oigen     sterilen Lösung von Harnstoff aufrechterhalten wurde.  Wie aus der weiter unten angegebenen Tabelle zu     ent-          nehmen    ist, wurden     verschiedene    Substanzen zu den  Gruppen der Flaschen nach dem     Beginn    der Fermenta  tion hinzugefügt.

   Die Flaschen wurden auf Glutamin  säure nach 48 Stunden     geprüft.     
EMI0006.0030     
  
   
EMI0006.0031     
  
     <I>Beispiel ZO</I>  A. Bei     dieser    Fermentation geht man wie im Bei  spiel 6A vor. Nach einer     18-stündigen        Fermentations-          zeit    wurde     ein,        akquoter    Teil der Brühe     entnommen.     200 ml Portionen dieses     aliquoten    Teiles wurden zen  trifugiert und die     obenschwimmende    Flüssigkeit ent  fernt.

   Die so erhaltenen nassen     Zellen    wurden mit  einem 0,1 M     Phosphatpuffer    vermischt und bis auf     ein     Volumen von 200 ml aufgefüllt. Zu diesem wurde eine       7,8o/oige        Dextroselösung    und eine kleine Menge     eines          Phenolrot-Bromthymolblau-Indikators        hinzugefügt.    In       Schüttelflaschen    vom Typ Hinton wurden 35 ml Por  tionen dieser so erhaltenen     Zensuspension    angesetzt.

         Biotin    und     Oxytetracyclin,    in Mengen wie sie aus der  folgenden Tabelle zu     entnehmen    sind, wurden zu den  einzelnen Flaschen hinzugegeben. Die Flaschen wurden  dann     mit    steriler Gaze bedeckt und auf     einer        Rota-          tionsschüttelmaschine    (50,8     mm    Schub bei 220     U/min.)     bei 33  C, während 221/2 Stunden geschüttelt der     pH     wurde zwischen 7 und 8 durch     Hinzugabe,    falls erfor  derlich,     einer    sterilen Lösung von Harnstoff aufrecht  erhalten.

   Nach     221/,Stunden    wurden die Flaschen auf       Glutamins:äuregehalt    geprüft. Die     Ergebnisse    sind in  der folgenden Tabelle     angegeben,    der     Glutaminsäure-          gehalt    ist     -ein    Durchschnitt aus 4     Flaschen,.     
EMI0006.0071     
  
    Oxytetra- <SEP> Glutamin  Biotin <SEP> cychn <SEP> säure
<tb>  Flasche <SEP> y/Liter <SEP> Y/ml <SEP> mg/ml
<tb>  a-d. <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 37,4
<tb>  e-h <SEP> 35 <SEP> 0 <SEP> 3,2
<tb>  i <SEP> -I <SEP> 35 <SEP> 5 <SEP> 22,2
<tb>  m-p <SEP> 35 <SEP> 10 <SEP> 23,9
<tb>  q-t <SEP> 35 <SEP> 20 <SEP> 22,8
<tb>  u-x <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 34,5       B.

   Die Wirkung von     Chloramphenicol,        Oxytetracy-          clin    und andern     Verbindungen    wurde durch Wiederho  len des obigen Experiments     festgestellt,    wobei die fol  genden     Änderungen        vorgenommen    wurden:

   Die     Zellen          wurden    nach     19-stündiger        Fermenfiationszeit        gesam-          melt,        die        Dextrose-Konzentration        war        7,5        %        und        die     gewaschene     Zellsuspension    wurde während 16 Stunden  statt 221/2 Stunden geimpft.

   Die folgenden Ergebnisse  wurden erhalten:    
EMI0007.0001     
  
     <I>Beispiel 11</I>  Ein     Fermentationsmedium    mit der folgenden Zu  sammensetzung wurde     hergestellt:     
EMI0007.0004     
  
    <I><U>9n</U></I>
<tb>  Dextrose <SEP> (anhydr.) <SEP> 45,0
<tb>  lN<B>H4)2HP04 <SEP> 1,0</B>
<tb>  (NH4)H2P04 <SEP> 1,0
<tb>  MgS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,5
<tb>  FeS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 10 <SEP> mg
<tb>  MnS04 <SEP> - <SEP> 4H20 <SEP> <I>40 <SEP> mg</I>
<tb>  lN<B>H4)2SO4</B> <SEP> 2,0
<tb>  KIS04 <SEP> 3,0
<tb>  Harnstoff <SEP> 5,0
<tb>  Biotin <SEP> 100 <SEP> Microgramm
<tb>  Destilliertes <SEP> H20 <SEP> für <SEP> 11       Das Medium wurde durch Erhitzen bei 120  C,  und 1,

  05     kg/cm2        sterilisiert.    40     ml    dieses Mediums  wurden zu jeder Serie von 250 ml Flaschen hinzugege  ben und jede Flasche mit 0,4     ml    einer sterilen     wässri-          gen    Zensuspension des im Beispiel. 1 benützten Orga  nismus     geimpft.    Der     Impfstoff    wurde durch Suspendie  ren einer     Blake        bottle        Agrar        culbure    des     Organismus    in  15 ml     sterilem    Wasser erhalten.

   Die Fermentation  wurde auf einer     Rotationsschüttelmaschine    mit 220 U/  min. bei 28 C durchgeführt.  



  Nach     12-stündiger    Fermentation wurde zu     einigen     dieser Flaschen     ein.        Inhibitor        hineingegeben.    Die  Menge der     Zellkultur,    die Mengen der sich gebildeten       innenzellularen    und     ausserzellularen        Glutaminsäure     und das Verhältnis von     Glutaminsäure    in     der    Fermen  tationsbrühe und in den Zellen wurde in periodischen  Zeitabschnitten bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse  sind aus den folgenden Tabellen zu ersehen.  



  Aus der weiter unten angegebenen     Tabelle    I sind  Ergebnisse von Versuchen ersichtlich, in welchen     kein          Inhibitor        hinzugegeben    wurde. In der Tabelle     II    sind  die Ergebnisse der     Fermentationen    angegeben, die in       derselben    Weise wie die der Tabelle I erhalten wurden,  ausgenommen     dass    40     Einheiten    von     Natrium-pencil-          lin    G nach     12-stündiger        Fermentationsdauer    zugesetzt  wurde.

    
EMI0007.0044     
  
     Die weitem Tabellen     III,    IV und V enthalten die  Ergebnisse ähnlicher Experimente in welchen 400     y/ml          Novobiocin    nach     12-stündiger        Fermentationsdauer     (Tabelle     III)    hinzugefügt wurde;

   bei den Versuchen der  Tabelle IV wurden 10 y     Streptomycin    pro     ml        Fermen-          tationsbühe,    in Form des     Streptomycincalciumchlorid-          komplexes,    nach     12-stündiger    Fermentation hinzugege  ben,     und.    15     y/ml    von     Natrium-Cephalosporin    C pro  ml     Fermentationsbrühe    wurden nach     12-stündiger    Fer  mentation der Versuche von Tabelle V hinzugefügt.  
EMI0007.0063     
  
     
EMI0008.0001     
  

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Glutammsäure durch Fermentation eines Biotin-haltigen Nährmedi ums mit Biotin erfordernden, Glutammsäure,erzeugen- den Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass ein das Wachstum der Mikroorganismen hemmender Inhibitor in,

   das Fermentationsmedium nach der Imp fung des Mediums mit dem genannten Organismus und nach wesentlicher Vermehrung dieses Organismus im Nährmedium hinzugefügt wird.

   UNTERANSPRGCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass man einen Biotin erfordernden, Glutammsäure erzeugenden Mikroorganismus in;

   einem Biotin enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedin gungen wachsen lässt und zu diesem Fermentationsme- dium, nachdem ein wesentliches Wachsture stattgefun den hat, Penicillin hinzufügt. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass das Nährmedium eine Biotin-Menge enthält, welche die zu einem normalen Wachstum er forderliche Biotin-Menge übertrifft.

   3. Verfahren nach Unteranspruch 2, unter Benüt zung eines Mediums mit einem Biotin-überschuss von etwa 5 Teilen pro Billion, dadurch gekennzeichnet, dass nach einem wesentlichen Wachstum des Mikroor- ganismus eine kleine Menge Penicillin hinzugefügt wird. 4.

   Verfahren nach Unteranspruch 3, dadurch ge kennzeichnet, dass ein Alkalimetallsalz von Penicillin G zu dem Fermentationsmedium gegeben wird. 5. Verfahren nach Patentanspruch und Unteran spruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Penicillin zu der Fermentationsbrühe hinzugegeben wird, falls diese eine optische Dichte von etwa 15 erreicht.

   6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass ein Inhibitor zu dem Fermenta- tionsmedium hinzugegeben wird, der ein, Absinken der intrazellularen Glutaminsäure auf weniger als die Hälfte desjenigen Gehaltes, der bei einer Fermentation, ohne Inhibitor erzielt wird,

   hervorruft und gleichzeitig das Verhältnis der extrazellularen zu der intrazellula ren Glutaminsäure auf einen grösseren Wert als 50 anwachsen lässt und dass das Verfahren bei einem pH von 6,0 bis 8,5 geführt wird.