CH461706A - Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums - Google Patents

Description

  (Zusatzpatent zum Hauptpatent 428 097)         Verfahren    zur Herstellung     eines    neuen     Antilbiotieums       Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur  Herstellung der bisher unbekannten Verbindung     Mono-          desacetyl-Anguidin.     



  Diese Verbindung kann     erfindungsgemäss    durch  Züchtung von Stämmen der Pilzgattung     Fusarium    Link  ex Fr. (Fungi     imperfecti)    oder ihrer Mutanten in einer  Nährlösung und anschliessende Isolierung aus dem Kul  turfiltrat erhalten werden.

   Zur Gewinnung von     Monode-          sacetyl-Anguidin    auf mikrobiologischem Wege eignen  sich Stämme der Pilzgattung     Fusarium,    beispielsweise     Fu-          sarium        anguioides        Sherb.,    Stamm     NRRL    3020     (Northern     Regional Research     Laboratories,        Peoria,        Blinois,    USA).

    Es können aber auch andere Stämme verwendet werden,  wie sie zum Beispiel durch Selektion oder Mutation unter  der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen  oder durch Anwendung anderer bekannter Methoden,       z.B.    durch den Einfluss von Chemikalien, erhalten werden.  



  Die Züchtung kann entweder in ruhender Oberflä  chenkultur oder     submers    unter Schütteln bzw. in     Fer-          mentern    unter Rühren mit     Begasung    durch Luft oder  Sauerstoff erfolgen, bei Temperaturen zwischen 12 und  30  C.     Fusarium-Stämme    lassen sich auf vielerlei Nähr  boden, die die üblichen Nährstoffe enthalten, züchten.

   So  verwerten solche Stämme die für     kohlenstoffheterotrophe     Organismen üblicherweise benutzten Nährstoffe, bei  spielsweise Glucose, Stärke,     Dextrin,        Lactose,        Rohrzuk-          ker    usw. als     Kohlenstoffquelle,    organische und anorgani  sche, stickstoffhaltige Verbindungen, wie     Pepton,        Hefe-          oder    Fleischextrakte,     Ammoniumsulfat,        Ammoniumni-          trat,        Aminosäuren    usw.

   als     Stickstoffquelle,    sowie die üb  lichen Mineralsalze und Spurenelemente.  



  Es wurde nun gefunden, dass sich aus Kulturlösungen  einer Reihe von Stämmen verschiedener Arten der Pilz  gattung     Fusarium    die neue, antibiotisch wirksame Ver  bindung     Monodesacetyl-An,uidin    in reiner Form isolie  ren lässt.  



  Eine Form des     erfindungsgemässen    Verfahrens zur  Herstellung von     Monodesacetyl-Anguidin    besteht darin,  dass ein flüssiges Nährmedium mit einer Kultur eines       Fusarienstammes    beimpft und drei bis 25 Tage     inkubiert     wird.

   Sobald die Menge an     Monodesacetyl-Anguidin    in  der Kulturlösung ihren höchsten Wert erreicht hat, wird    diese Lösung filtriert und das     Monodesacetyl-Anguidin     aus dem Filtrat nach an sich bekannten Methoden aus  dem Filtrat isoliert, so     z.B.    durch Extraktion und/oder       Adsorption.    Für die Produktion im technischen Massstab  wird die Extraktion bevorzugt, da sie weniger zeitraubend  und billiger ist.

   Zur Extraktion eignen sich mit Wasser  nicht mischbare Lösungsmittel, wie chlorierte Kohlen  wasserstoffe,     z.B.        Methylenchlorid,        Äthylenchlorid,    Chlo  roform und dgl., ferner Alkohole mit geringer Wasser  löslichkeit, wie     Butanol,        Amylalkohol    und dgl.,     Alkylester     von Fettsäuren, wie     Äthylacetat,        Propylacetat,        Butylace-          tat,        Amylacetat    und dgl., wenig wasserlösliche     Ketone,     wie     Methylisobutylketon,

          Methylamylketon    und dgl. Der  Extrakt der Kulturflüssigkeit kann     vorteilhafterweise    im  Vakuum zur Trockne eingedampft werden, wobei man  das     Antibioticum    in roher Form erhält.  



       Monodesacetyl-Anguidin    kristallisiert aus Äther und  hat einen Schmelzpunkt von 164-167  C. Die spezifische  Drehung beträgt     [2]25n    = -25  (c = 0,48 in Chloroform).  



  Die Elementaranalysen ergeben folgende Werte:  C 63,0% H     7,5 j,     Das     Antibioticum    enthält weder N, noch S, noch Ha  logen..  



  Die berechneten Werte für     C"H2405    sind:  C     62,95%    H     7,46 j,     Das     IR.-Spektrum    einer Lösung der Substanz in     Me-          thylenchlorid    zeigt Banden bei 3590, 3440, 2940, 1730,  1670, 1450-1430, 1390-1365, 1240, 1165,<B>1</B>105, 1073,  1040, 988, 960, 935-920 cm-'     (Fig.    1).  



  Die Testreaktionen nach     Benedict,        Fehling,        Tollens,          Millon,    sowie mit Eisenchlorid und Kaliumpermanganat  in Aceton sind negativ. Brom in     Tetrachlorkohlenstoff     wird langsam entfärbt.

       Monodesacetyl-Anguidin    ist lös  lich in Aceton, Äthanol,     Dioxan,    Chloroform,     Methylen-          chlorid,        Pyridin,    Benzol,     Toluol,    schwerlöslich in Wasser,       Diäthyläther,        Diisopropyläther,        Pentan,        Hexan    und     Hep-          tan.     



  Die     pharmakodynamischen    Eigenschaften von     Mono-          desacetyl-Anguidin    decken sich weitgehend mit denen  des     Anguidins,    so dass es für dieselben therapeutischen      Zwecke verwendet werden kann,     z.B.    als Medikament für  die Behandlung von     Infektionskrankheiten.    Ausserdem  besitzt die neue Verbindung     antimitotische    Wirksamkeit  und kann daher zur medikamentösen Bekämpfung von  Tumoren dienen. In dem nachfolgenden Beispiel, wel  ches die Ausführung des Verfahrens erläutert, den Um  fang der     Erfindung    aber in keiner Weise einschränken  soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

    Die Schmelzpunkte sind     unkorrigiert.     



       Beispiel   <I>1</I>  Mit einer Kultur von     Fusarium        anguioides    (Stamm       NRRL    3020) werden in einem     Fermenter    10 Liter einer  Nährlösung, die pro Liter 30     g    Glucose,     (Cerelose        San-          doz),    2 g Malz-Extrakt (Schweiz.

   Ferment AG), 2 g     Bac-          to-yeast    Extrakt     (Difco),    4 g     Ammoniumnitrat        p.a.,    2 g       Kaliumhydrogenphosphat        p.a.,    2 g     Magnesiumphosphat     x     7H20        p.a.    und     entmineralisiertes    Wasser ad 1 Liter  enthält, 135 Stunden lang bei 27  unter Rühren (1450       U/Min.)    und Belüftung (5 Liter Luft pro Minute)

       in-          kubiert.    Die Kulturbrühe wird in einer     Becherzentrifuge     in einen festen Schlamm und eine schwachtrübe Lösung  getrennt. 7,0 Liter der überstehenden Lösung werden  zweimal mit dem gleichen Volumen Essigester und     an-          schliessend    dreimal     mit    demselben Volumen     n-Butanol     extrahiert. Die organischen Lösungsmittel werden je  zweimal mit Wasser gewaschen und     einzeln    im Umlauf  verdampfer am     Wasserstrahlvakuum    eingeengt.

   Der aus  dem     Essigester-Extrakt    nach gründlicher Trocknung im  Hochvakuum verbleibende Rückstand wird zweimal zwi  schen je 100     ml        Petroläther    und 100     ml        90a/oigem        wäss-          rigem    Methanol verteilt.

   Der nach Einengen und Trock  nen des     Methanol-Wasser-Extraktes    resultierende Rück  stand wird in der üblichen Weise an     Kieselgel        chroma-          tographiert.    Die mit     Chloroform-Methanol    (199:1)       eluierten    Fraktionen enthalten     Anguidin,    aus zwei Fak  toren, die mit     Chloroform-Methanol    (49: 1)     eluiert    wer  den, wird nach     Kristallisation    aus Äther reines     krist.        Mo-          nodesacetyl-Anguidin    gewonnen.

           Beispiel   <I>2</I>  Mit einer Kultur von     Fusarium        sambucinum,    Stamm       ATCC    11 852, werden in einem     Fermenter    10 Liter einer  Nährlösung, die pro Liter 20 g Glucose     (Cerelose        San-          doz),    2 g     Pepton        (Cudahy),    2 g Malzextrakt (Schweiz.

    Ferment     A.G.),    2 g     Bacto-yeast        Extract        (Difco),    2 g     Ka-          liumdihydrogenphosphat,    2 g     Magnesiumsulfat    X 7H20,  und     entmineralisiertes    Wasser ad 1 Liter enthält, 145 Std.  lang bei 27  unter Rühren (450     U/Min.)    und Belüftung  (5 Liter Luft/Min.)     inkubiert.       Die dunkelrote Kulturbrühe wird filtriert und das  Filtrat der Reihe nach je drei Mal mit 10 Litern     Benzin,     10 Litern     Äthylacetat    und 10 Litern     n-Butanol    extrahiert.

    Der     Äthylacetatextrakt    wird mit 2 Litern Wasser nach  gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Va  kuum eingeengt. Der     Eindampfrückstand        wird    in     Chlo-          roform    gelöst und an 4,18 g Kieselgel     chromatographiert.     Die mit Chloroform     eluierten    Anteile werden verworfen.

    Die mit     Chloroform-Methanol-(99:1)        eluierten    Frak  tionen geben aus     Äther-Hexan    kristallines     Anguidin.    In  den mit     Chloroform-Methanol-(1    : 1)     eluierten    Fraktio  nen kann     Monodesacetyl-Anguidin        dünnschichtchroma-          tographisch    nachgewiesen werden.  



       Beispiel   <I>3</I>  Eine Kultur von     Fusarium        scirpi    (Stamm S 1497)  wird in 500     ml-Erlenweyerkolben    mit je 100 ml der glei  chen Nährlösung wie bei Beispiel 1, jedoch ohne     Bacto          yeast        extract        (Difco)    25 Tage lang bei 27      inkubiert.     37 solcher Kulturen werden durch Filtration vom     Mycel     getrennt und das Kulturfiltrat     mit    3 Mal je 2 Litern       Äthylacetat    extrahiert, die Extrakte mit wenig Wasser  nachgewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am  Vakuum eingeengt.

   Der erhalten Rückstand wird an  30 g Kieselgel     chromatographiert.    Die mit Benzol und  Chloroform     eluierten    Teile werden verworfen. Die     mit          Chloroform-Methanol-(99:    1)     eluierten    Fraktionen geben  aus     Äther-Hexan    kristallisiertes     Anguidin    vom Schmelz  punkt 155-162 .     In    den mit     Chloroform-Methanol-(99:1y          eluierten    Fraktionen kann     Monodesacetyl-Anguidin          dünnschichtchromatographisch    nachgewiesen werden.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Monodesacetyl-An- guidin, dadurch gekennzeichnet, dass man Stämme der Pilzgattung Fusarium Link ex Fr. (Fungi imperfecti) oder Mutanten dieser Stämme in einer Nährlösung züch tet und hierauf Monodesacetyl-Anguidin aus der Nähr lösung isoliert. UNTERANSPRUCH Verfahren zur Gewinnung von Monodesacetyl-An- guidin nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man Stämme der Gattung Fusarium Link ex Fr.

   (Fungi imperfecti) in einer Nährlösung züchtet und hier auf Monodesacetyl-Anguidin aus der Nährlösung isoliert.