CH465768A - Verfahren zur Gewinnung von BCG-Kulturen - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur   Gewinnung    von BCG-Kulturen
Gegenstand der Erfindung ist ein   verbessertes    Verfahren zur Herstellung von BCG-Kulturen. Das abgeschwächte Mycobacterium tuberculosis var. BCG (Bac.



     CalmetteGuerin)    wird als Lebendvaccine zur   Immuni-      sierung gegen      Tuberculose    verwendet. Auch BCG-Zellextrakte weisen eine gewisse immunisierende Wirkung auf. Für die Herstellung der Vaccine und Zellextrakte in grossem Massstab sollten entsprechend grosse, einheitliche und lebensfähige   Teilmengen    zur Verfügung stehen. Das war aber bisher nicht der Fall. BCG ist hinsichtlich der Züchtung sehr empfindlich. Es gelang bisher nicht, BCG in technischem Massstab in den üblichen Fermentern aus rostfreiem Stahl unter Belüftung und Rühren   herzustl-    len, da BCG unter diesen Bedingungen nicht oder nur sehr langsam wuchs.



   Es wurde nun gefunden, dass die Zusammensetzung der   Nährlösung,    speziell hinsichtlich der Kohlenstoffquellen und des Zusatzes von oberflächenaktiven Stoffen, sowie im allgemeinen auch geringe Belüftung und Rührung für die Züchtung von BCG in technischem Massstab von ausschlaggebender Bedeutung sind.



   Es zeigte sich, dass die Kombination von Glycerin als Kohlenstoff- und Energiequelle mit Netzmitteln vom  Tween -Typ   d. 5.    Anhydride mehrwertiger Alkohole, deren freie Hydroxylgruppen zum Teil mit langkettigen Fettsäuren verestert, zum Teil mit Polyäthylenoxyd   ver-    äthert sind   (s.    The Merck Index, 7. Aufl. 1960, S. 970), insbesondere mit  Tween 80    (Pdyoxyäffiylensorbitan-    monooleat), optimales Wachstum des BCG in   Fermentern    ermöglicht.

   Das Verfahren gemäss der Erfindung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung von BCG in einem Fermenter unter Verwendung   einer    Nährlösung, die Glycerin als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie als Netzmittel cyclische Anhydride mehrwertiger Alkohole, deren freie Hydroxylgruppen zum Teil mit langkettigen Fettsäuren verestert und zum Teil mit Polyäthylenoxyd veräthert sind, enthält, durchführt.   



  Die Anteile e der beiden Komponenten Glycerin und    Netzmittel hängen von den übrigen   Nährlösungsbestand    teilen ab. Glycerin wird in der Regel in Konzentrationen von 20-100 g/l Nährlösung, das Netzmittel in der Regel in solchen von 1-20 g/l beigefügt. Die übrigen Nähr  lösungsb. standteile,    Stickstoffquellen, Salze, Spurenelemente,   entsprechen    im allgemeinen den in der Literatur für die Züchtung von BCG angegebenen Medien.   Die    Belüftung soll in der Regel schwach sein, ungefähr 0,1 bis 0,5 Vol. Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute. Auch die Rührung soll in der Regel   niednig    gehalten werden, beispielsweise bei etwa 50-100 Umdrehungen pro Minute.

   Die   Inkubafionstemperatur    in den Fermentern beträgt vorzugsweise   37     C. Zur Beimpfung der Fermenter dienen z. B. 6-9 Tage alte, bei 370 C inkubierte   Schüttelkulturen;    man beimpft z. B. mit 2-5   Vol.%    Schüttelkultur.



   Das Wachstum der Kultur wird im allgemeinen turbidimetrisch verfolgt,   z.B.    indem die Lichtabsorption bei 655   m, u    in einem photoelektrischen   Kolorimeter    ge  messen en wird. Man erntet z. B. bei einer optischen Dichte    von 2-10, entsprechend etwa 1-5 g   Zelltrockengewicht    pro Liter Kulturlösung. Diese Dichte ist nach 5-15 Tagen erreicht. Für die Propagation in höhere Fermenterstufen (scale up) verwendet man Kulturen mit einer optischen Dichte von 1-3, wie sie nach etwa   4- bis    6tägiger Inkubation erhalten wird.



   Wenn die gewünschte Dichte erreicht ist, werden beispielsweise die Bakterien von der Nährlösung durch Zentnifugieren abgetrennt. Sie können zwecks Herstellung von BCG-Vaccine gefriergetrocknet oder zur Gewinnung von   Zellextrakten    aufgearbeitet werden.



   Die Erfindung wird in den   folgenden    Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.



   Beispiel I
In einen 50-Liter-Fermenter (der in der Antibiotika Produktion üblichen Bauweise) mit Luftverteiler, Rührer und Temperaturregulator werden 30 Liter Nährlösung ,eingefüllt, welche pro Liter folgende Zusammensetzung hat:  
Glycerin 75,0 g   Tween 80  2,0 g
Albuminlösung 5   %    ig 50,0 ml
L-Asparagin 2,0 g
Bacto-Casiton 1,0 g
Kaliumphosphat, prim. 1,0 g
Natriumphosphat, sek., 12   HssO    2,5 g    Ferriammoniumcitrat    10,0 mg
Magnesiumsulfat,   7 H2O    10,0 mg
Calciumchlorid, 6   HZO    0,5 mg
Zinksulfat, 7   H2O    0,1 mg
Kupfersulfat, 5   H2.O    0,1 mg deionisiertes Wasser ad 1000 ml
Die Nährlösung wird vor dem Einfüllen, ohne Zusatz der Albuminlösung, 20 Min.

   bei 1200 und 1,2 atü autoklaviert, dann die an zwei aufeinander folgenden Tagen je 2 Std. bei 560 inaktivierte, durch ein Seitzfilter filtrierte Albuminlösung hinzugegeben. Man beimpft den   Eermenter    mit 900 ml einer 9 Tage alten, in 500 ml Erlenmeyerkolben mit je 100 ml Nährlösung auf einer rotierenden Schüttelmaschine gezogenen BCG-Kultur, die eine optische Dichte von   0,3-0,4    (Messung bei 655   me)    aufweist (die Nährlösung der Erlenmeyerkolben entspricht der obigen, enthält jedoch statt 50 ml Albuminlösung pro Liter 100 ml und kein Glycerin und Tween). Die Züchtung erfolgt bei 370, bei einem Luftumsatz von 0,25 Vol. pro Vol. Nährlösung pro Minute und unter Rühren mit einem 6blätterigen Turbinenrührer mit 50 Umdrehungen pro Minute.



   Nach 10 Tagen weist die Kulturlösung eine optische Dichte von 4,40 (bei 655   mop),    d. h. ein Zelltrockengewicht von etwa 2,2 g pro Liter Kulturlösung, auf.



   Verwendet man unter sonst gleichen Bedingungen eine Nährlösung, welche statt des Glycerins 75 g Glucose enthält, so ist die optische Dichte nach 10 Tagen   0,13;    bei einer   Nährlösung    ohne Glycerin und mit nur 0,5 g  Tween , jedoch mit 100 statt 50 ml Albuminlösung pro Liter ist die optische Dichte nach 10 Tagen 0,02.



   Beispiel 2
Unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen wird in einem   50-Liter-Fermenter    eine BCG-Kultur in 30 Liter einer Nährlösung gezüchtet, die pro Liter folgende Zusammensetzung hat:
Glycerin 50,0 g   Tween 80  15,0 g
Natriumacetat 1,0 g
L-Asparagin 2,0 g
Bacto Casiton 1,0 g
Hefeextrakt Difco 3,0 g
Kaliumphosphat, prim. 1,0 g
Natriumphosphat, sek.,   12 HrO    2,5 g
Ferriammoniumcitrat 10 mg
Magnesiumsulfat, 7   ff2O    10   mg   
Calciumchlorid, 6   H.2O    0,5 g
Zinksulfat, 7   HO    0,1 mg
Kupfersulfat, 5   H2O    0,1 mg deionisiertes Wasser ad 1000 ml
Die Lösung wird 20 Min. bei 1200 und 1,2 atü autoklaviert.



   Nach 10 Tagen weist die Kulturlösung eine opti  sche Dichte von 5,65 (bei 655 m, u) auf, entsprechend    etwa 2,8 g Zelltrockengewicht pro Liter.



   Verwendet man eine Nährlösung, die statt Glycerin und  Tween  10,0 g Glucose und 15,0 g Triton (WR 1339) enthält, so ist die optische Dichte nach 10 Tagen 0,27.



   Beispiel 3
Man beimpft 50-Liter-Fermenter, welche 30 Liter der in Beispiel 2 genannten Nährlösung enthalten, mit 900 ml einer   Schüttielkultur,    die in Erlenmeyerkolben wie in Beispiel 1 beschrieben aber in einer Nährlösung von der ion   Beispiel    2 angegebenen Zusammensetzung gezogen wurde. Nach 4- bis 6tägiger Inkubation der Fermenter werden je 15 Liter der Kulturlösung in 500-Liter-Fermenter mit 300 Liter Nährlösung   üb,    tragen. Die 500-Liter-Fermenter entsprechen im Bau den   50-Liter-Fermentern.    Die Züchtung erfolgt bei 370, bei einer Belüftung von 0,1 bis 0,5 Vol. Luft pro Vol.



  Nährlösung pro   Minute    und unter Rühren mit 100 Umdrehungen pro Minute. Nach 7tägiger Inkubation beträgt die optische Dichte 4-6, entsprechend   24    g Zelltrockengewicht pro Liter   Kufturlösung.    Die Ausbeute kann durch Verlängerung der   Züchtungsdauer    noch wesentlich erhöht werden.   

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Gewinnung von BCG (Bac. Calmette Guerin-Kulturen; durch Züchtung von BCG unter aeroben Bedingungen in einer Nährlösung, welche eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung in einem Fermenter unter Verwendung einer Nährlösung, die Glycerin als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie als Netzmittel cyclische Anhydride mehrwertiger Alkohole, deren freie Hydroxyltiruppen zum Teil mit langkettigen Fettsäuren verestert und zum Teil mit Polyäthylenoxyd veräthert sind, enthält, durchführt.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung als Netzmittel Polyoxyäthylensorbitanmonooleat enthält.

   2. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Züchtung die Belüftung und Rührung niedrig gehalten werden.

   3. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung 20-100 g Glycerin pro Liter Nährlösung enthält.

   4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung 1-20 g cyclische Anhydride mehrwertiger Alkohole, deren freie Hydroxylgruppen zum Teil mit langkettigen Fettsäuren verestert und zum Teil miit Polyäthylenoxyd veräthert sind, pro Liter Nährlösung enthält.

   5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung neben synthetischen Stick stoffquellen, etwa 50 g Glycerin und 10-15 g Polyoxy äthylensorbitanmonooleat pro Liter enthält.