Verfahren zur Herstellung von BCG-Vaccinen
Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von BCG-Vaccinen.
BCG (Bac. Calmette-Guerin) wird als Lebendvaccine zur Immunisierung gegen Tuberculose verwendet.
Die Vaccine wird aus BCG-Lebendkulturen, vorzugsweise durch Lyophilisierung, hergestellt.
Eine gute Vaccine soll einen möglichst hohen Gehalt an lebenden Zellen im Verhältnis zur Gesamtzahl der Keime aufweisen. Auch ist erforderlich, dass die Keime längere Zeit lebensfähig bleiben (Lagerungsfä- higkeit der Vaccine) und sich gut resuspendieren lassen. Die Erfüllung dieser Anforderungen bereitet grosse Schwierigkeiten, da BCG wenig temperaturbeständig, insbesondere auch empfindlich gegenüber den Bedingungen, wie sie bei der Gefriertrocknung und Lagerung der Vaccine auftreten, ist.
Um die Stabilität der lyophilisierten Vaccine zu erhöhen, werden der BCG-Suspension vor der Lyophili sierung verschiedene Schutzsubstanzen zugesetzt, deren Wirkungsweise aber noch nicht restlos abgeklärt ist. Nach Greaves (Ann. N. Y. Acad. Sci. 85 [1960], 723-28) suspendiert man das BCG-Sediment in einem aTrocknungsmedium , das ein Trägermaterial, z. B.
Dextran, zur Erzielung eines schwammigen Kuchens, eine Puffersubstanz zur Regulierung des Wassergehaltes der getrockneten Keime, z. B. Sucrose oder Natriumglutamat, und ein Neutralisierungsmittel für Carbonylgruppen, z. B. Natriumglutamat, enthält.
Auch die Einfriertemperatur, die Geschwindigkeit der Einfrierung und die Trocknungstemperatur haben einen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der lyophilisier- ten Zellen.
Es wurde auch vorgeschlagen (vgl. deutsche Patentschrift 1148 038), zwecks Erhöhung der Stabilität der lyophilisierten Vaccine BCG in einem Nährme- dium zu züchten, das keine carbonylgruppenhaltigen oder durch BCG in carbonylgruppenhaltige Verbindungen überführbare Substanzen enthält, insbesondere in einem Medium, das frei ist von Glycerin, Monosacchariden, Zuckeralkoholen und Polysacchariden. Das Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass BCG in den anzuwendenden Nährmedien weniger gut wächst und dass die Züchtung nicht in technischem Masstab in den bei der technischen Kultivierung von Mikroorganismen sonst üblichen Fermentern durchgeführt werden kann.
Es wurde nun gefunden, dass man auch unabhän- gig von der Art des Nährmediums die Stabilität von BCG im Hinblick auf Lyophilisierung und Lagerungsfähigkeit der Vaccine wesentlich verbessern kann und dass man daher auch Nährmedien verwenden kann, die sich für die Herstellung von BCG-Lebendkulturen in Fermentern besonders gut eignen.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine BCG-Kultur den Bedingungen der Herstellung und Lagerung der Vaccine unterwirft, die unter diesen Bedingungen am besten beständigen Einzell-Kulturen selektioniert, durch Züchtung vermehrt und danach zu Vaccine verarbeitet. Bei der Herstellung lyophilisierter BCG-Vaccine geht man beispielsweise so vor, dass man eine BCG-Kultur in bestimmter Weise lyophilisiert, längere Zeit, beispielsweise 1-6 Monate, bei einer eventuellen Lagerungstemperatur der Vaccine, z.
B. 30-40 C, oder beispielsweise 8 Tage bei maximal 50 C lagert, dann suspendiert, die Suspension auf einen festen Nährbo- den in solcher Konzentration aussät, dass die Kolonien getrennt wachsen, einzelne Einzell-Kolonien in flüssi- gem Nährmedium vermehrt, die so erhaltenen Einzell- Kulturen in gleicher Weise wie vorher lyophilisiert (ca.
10-20 Ampullen zu 1 mg/ml pro Einzell-Kultur), zur Feststellung der Oberlebensrate auf feste Nährböden aussät, die Einzell-Kulturen mit 80-100"/o Uberlebens- rate auswählt und als Ausgangsmaterial für die Hersteliung der Lebendkulturen verwendet.
Es hat sich gezeigt, dass ca. 10-100 Einzell-Kolonien zur Auslese von thermostabilen Einzell-Kulturen erforderlich sind. Einen erhaltenen thermostabilen Stamm mit guten immunisierenden Eigenschaften kann man solange für die Gewinnung von BCG-Kulturen bzw. Vaccinen verwenden, bis sich eine Verschlechterung der Eigenschaften bemerkbar macht.
Das Lyophilisieren der BCG-Kultur wird in einem geeigneten Trocknungsmedium , vorzugsweise einer wässrigen Lösung von Dextran, Glutamat und einem Zucker, z. B. Saccharose, oder einer natürlichen Hexose, wie Glukose, Laktose oder Fruktose, vorgenommen. Man verwendet etwa 1 g Bakterientrockengewicht pro Liter Trocknungsmedium . Als bestes Trocknungsmedium erwies sich eine Lösung von 5 /o Dextran, 5 /o Natriumglutamat und 5 /0 Saccharose in dest. Wasser, fast gleich gut ist eine Lösung von 5 /o Dextran, 2 ouzo Natriumglutamat und 5 /o Glukose in dest. Wasser.
In der folgenden Tabelle 1 ist die tXberle- bensrate (Verhältnis der Anzahl lebender Keime pro ml nach Lyophilisierung zur Anzahl lebender Keime pro ml vor der Lyophilisierung) in Prozenten, bezogen auf Medium 1 = 100 /0, angegeben.
Tabelle I
Trocknungsmedium /o relative Überlebensrate
1 100
2 92
3 58
4 1
5 15
6 0 1 = 5 /o Dextran, 5 /o Natriumglutamat, 5 /o Saccharose, aq. dest. ad 1000 mol 2 = 5 ouzo Dextran, 2 ouzo Natriumglutamat, 5 Glukose, aq. dest. ad 1000 ml 3 = 3 /o Dextran, 2 /o Natriumglutamat, 3 /o Laktose, aq. dest. ad 1000 ml 2"/o.
Glukose
2 /o Fruktose 4 = 3 /o Dextran, 3 /o Natriumglutarnat, 0 /o 5 = 0 /o 2 /o Natriumglutamat, 8 /o Saccharose, aq. dest. ad 1000 ml 5 ouzo Albumin Frakt. V 6 = 0"/o 0"/o 3"/o Glyzerin, aq. dest. ad 1000 ml 5 /o Albumin
Frakt. V
Die zu lyophilisierende Bakteriensuspension wird bei etwa-50 C möglichst schnell (Temperaturabfall 1 bis 3 pro Minute) tiefgefroren.
Die Trocknungstemperatur beträgt vorzugsweise-15 bis-20 C. (bei 0, 02 mm Hg). In diesem Temperaturbereich ist die Überlebensrate ca. lOOmal grösser als bei-30| C.
Das Lyophilisat wird bei 0,02 mm Hg über Silikagel nachgetrocknet. Der Endwassergehalt der getrockneten BCG beträgt 1 bis 2 /0.
Das getrocknete Bakteriengut wird unter den schärfsten Bedingungen, die für die Lagerung der Vaccine in Betracht kommen, beispielsweise bei einer Temperatur von 30-40 C, längere Zeit, beispielsweise 6 Monate, oder kürzere Zeit bei maximal 50 gelagert.
Um aus dem so erhaltenen Bakteriengut die lyophilisierungs-und lagerungsbeständigsten Mutanten auszulesen, resuspendiert man es, beispielsweise in einer 0,25 /oigen Losung von Bovin Albumin Fraction V (Herstellung Pentex Inc., Kankakee, Illinois), und sät es auf feste Nährböden, beispielsweise Löwenstein-Jen- sen-Agar, aus. Die Konzentration der zur Aussaat verwendeten Suspension wird so gewählt, dass die Kolonien getrennt wachsen. Die Platten werden wie üblich bei 37 C inkubiert.
Von den gewachsenen Einzell Kolonien überträgt man eine Anzahl (beispielsweise 10-20) getrennt in ein flüssiges Nährmedium in Schüt- telkolben und inkubiert bei 37 C, bis die Kulturen gut gewachsen sind (opt. Dichte bei 655 m, u, gemessen in einem photoelektrischen Kolorimeter, 0,5 bis 0,8, entsprechend einem Zelltrockengewicht von 0,25 bis 0,4 g pto Liter Kulturlösung).
Zur Gewinnung einer homogenen Kultur überimpft man dann in neue Schüttelkol- ben mit der gleichen Nährlösung (5 Volé Kultur pro neue Schüttelkultur) und lässt bis zu einem Zelltrokkengewicht von 0,5 bis 0,75 g pro Liter Kulturlösung (optische Dichte 1,0 bis 1,5) wachsen.
Dann zentrifugiert man ab, wäscht das Sediment, beispielsweise mit einer 0,015 feigen Lösung von Albumin Fraktion V, suspendiert die verschiedenen Einzell-Kultursedimente in dem vorher verwendeten Trocknungsmedium und sät je einen Teil der Suspension auf ein festes Nährme- dium (Löwenstein-Jensen-Agar) aus, während man einen anderen Teil unter den gleichen Bedingungen wie vorher lyophilisiert, resuspendiert und eine vergleichbare Menge der Suspension auf das feste Nährmedium aussät. Beim Inkubieren zeigt sich, dass die t) berlebens- rate der verschiedenen Einzell-Kulturen sehr verschieden ist (vgl. Tabelle 2).
Tabelle 2 Einzell-Kultur Nr. Anzahl Kolonien pro ml Anzahl Kolonien pro ml tJberlebensrate in"/e vor Lyophilisierung. nach Lyophilisierung 1 1, 03. 108 1, 04. 1OÇ 100 2 9,0.107 3, 24. 107 40 3 7,8.107 7, 0. 10µ 8 4 8,6.107 5,44.107 52 5 4,8.107 0 0 6 1,47.1Os 1,46.1Os 100 7 1,07. ils1, 06.108 99 8 1,03.108 0 0 9 1,16. ifs1, 50.106 Bei den Einzell-Kulturen mit grosser Überlebensrate handelt es sich um Kulturen, die aus einer genotypisch thermostabilen Mutante des BCG-Stammes hervorgegangen sind. Solche Kulturen ergeben bei der Züchtung in hohem Masse lyophilisierungs-und lagerungsbeständige Lebenskulturen, die zur Herstellung von lyophilisierten Vaccinen besonders geeignet sind.
Die selektionierten Kulturen zeigen im Tierversuch die volle immunisierende Wirkung im Vergleich zu nicht lyophilisierten, frischen Lebendkulturen.
Die selektionierten Kulturen können zur Züchtung von BCG nach den bekannten Methoden verwendet werden. Ein besonderer Vorteil ist, dass man sie auch bei der technischen Züchtung von BCG in Fermentem nach dem in der französischen Patentschrift 1419 643 beschriebenen Verfahren als Ausgangsmaterial einsetzen kann. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung in einem Fermenter unter Verwendung einer Nährlösung, die Glyzerin als Kohlenstoff-und Energiequelle sowie Netzmittel vom Tween-Typ, z. B. Tween 80, enthält, durchführt. Glyzerin wird in Konzentrationen von 20-100 g/Liter Nährlösung, das Netzmittel in solchen von 1-20 g/ Liter gebraucht.
Die übrigen Nährlösungsbestandteile, Stickstoffquellen, Salze, Spurenelemente, entsprechen den in der Literatur für die Züchtung von BCG angegebenen Medien. Das Verfahren zeichnet sich durch hohe Ausbeuten bei der Durchführung im technischen Masstab (50-oder 500-Liter-Fermenter) aus.
Im folgenden Beispiel wird die Erfindung beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel
Eine BCG-Kultur wird zentrifugiert, das erhaltene Sediment mit einer sterilen 0,05 feigen Lösung von Bovin Albumin Fraction V gewaschen und in einem Trocknungsmedium (1 g BCG-Trockengewicht pro Liter) suspendiert. Das Trocknungsmedium stellt man her, indem man 50 g Dextran, 50 g Natriumglutamat und 50 g Saccharose mit dest. Wasser auf 1 Liter auffüllt, auf 90 erhitzt bis zur vollständigen Lösung und nach dem Abkühlen auf ca. 30 seitzfiltriert. Die Suspension wird in Ampullen abgefüllt (Inhalt der Ampullen z.
B. 1 mg BCG-Trockengewicht), in einer Kühl- truhe mit Umlufteinrichtung mit einer Geschwindigkeit voit 1-3O/Min. auf-50 abgekühlt, dann in den Gefriertrockner gebracht und bei 0,02 mm Hg und-15 bis-20 getrocknet. In einem mit einer Diffusionspumpe evakuierten Exsikkator mit Silikagel wird das Lyophilisat bei 0,02 mm Hg nachgetrocknet und mit chemisch reinem, wasserfreiem Stickstoff begast.
Schliesslich schmilzt man die Ampullen zu. Nachdem man sie 6 Monate bei 37 gelagert hat, suspendiert man den Inhalt der Ampullen in einer 0,25 /Oigen Lösung von Albumin Fraktion V und giesst die Suspension auf Löwenstein-Jensen-Platten in Petrischalen aus, so dass pro Petrischale nicht mehr als 100 Kolonien wachsen. Die Platten werden wie üblich 4-6 Wochen bei 37 inkubiert. Neun der gebildeten Einzell-Kolonien impft man in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit je 100 ml Nährlösung ab.
Die Nährlösung hat folgende Zusammensetzung :
Glyzerin 50, 0 g
Tween 80 15,0 g
Natriumacetat 1, 0 g L-Asparagin 2,0 g
Bacto Casiton 1,0 g
Hefeextrakt Difco 3,0 g Kaliumphosphat, prim. 1,0 g
Natriumphosphat, sek., 12H2O 2,5 g
Ferriammoniumcitrat 10mg
Magnesiumsulfat, 7 H20 10 mg Caiciumchlorid, 6 HO 0,5 mg
Zinksulfat, 7 HO 0, 1 mg
Kupfersulfat, 5 H20 0,1 mg deioniertes Wasser ad 1000 ml Die Lösung wird 20 Minuten bei 120 und 1,2 atü autoklaviert.
Die 9 Erlenmeyerkolben werden auf einer rotierenden Schüttelmachine mit 120 Umdrehungen pro Minute bei 37 inkubiert, bis die optische Dichte bei 655 mut 0, 5 bis 0,8 beträgt. Dann iiberträgt man je 5 Vol.- /o der Kulturen in 9 neue Schüttelkolben mit der gleichen Nährlösung, lässt bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 1,0 bis 1,5 wachsen, zentrifugiert ab und wäscht das Sediment jeweils mit 0,05'/piger Albumin-Fraktion V-Lösung. Dann suspendiert man die Sedimente in dem oben genannten Trocknungs- medium . Je 0,5 ml der Suspension giesst man auf Löwenstein-Jensen-Platten aus,
der Rest wird ampul- lielt, tiefgefroren und lyophilisiert, wie oben beschrieben. Danach resuspendiert man das Lyophilisat in ad äquaten Mengen sterilem dest. Wasser und giesst je 0, 5 ml auf Löwenstein-Jensen-Platten aus. Die Platten werden bei 37 inkubiert. Nach 4-6 Wochen zählt man die Kolonien der Vergleichsplatten mit nicht 1YQ- philislerten und mit lyophilisierten Kulturen. Das Ver hältnis der letzten zu den ersten gibt die tJberlebens- rate, vgl. Tabelle 2.
Die Isolationen Nr. 1, 6 und 7 zeigen eine praktisch 100 O/oige Oberlebensrate. Sie werden als Aus gangsmaterial für die Züchtung von BCG in Fermen ter-bzw. Schüttelkolben verwendet.
Die Züchtung wird wie folgt durchgeführt :
Der Inhalt der Ampulle Nr. 1 wird auf Löwenstein- Jensen-Platten ausgesät, bei 37 inkubiert und die so erhaltene Kultur mit einer 0,25 /Oigen Lösung von Albumin Fraktion V aufgeschwemmt. Die Suspension wird zur Beimpfung von 500 ml-Erlenmeyerkolben mit je 100 ml der obigen Nährlösung verwendet. Die Impfmenge beträgt 1 Vol.- /o. Auf diese Weise stellt man auf einer rotierenden Schüttelmaschine 1, 5 Liter einer 9 Tage alten Kultur her, die eine optische Dichte von 0,4 bis 0,6 (bei 655 m, a) aufweist.
Mit diesen 1,5 Litern beimpft man einen 50-Liter-Fermenter (der in der Antibiotika-Produktion üblichen Bauweise) mit Luftverteiler, Rührer und Temperaturregulator, der 30 Liter der obigen Nährlösung enthält. Die Züchtung erfolgt bei 37 , bei einem Luftumsatz von 0,25 Vol. pro Vol. Nährlösung pro Minute und unter Rühren mit einem 6-blättrigen Turbinenrührer mit 50 Umdre hungen pro Minute. Nach 10 Tagen weist die Kulturlö- sung eine optische Dichte von 4,40 (bei 655 m, u), d. h. ein Zelltrockengewicht von ca. 2,2 g pro Liter Kulturlösung, auf.
Die Kulturlösung wird zentrifugiert, gewaschen und, wie oben beschrieben, zu Vaccinen verarbeitet.
Der Inhalt der Ampullen Nr. 6 und 7 wird zur Züchtung in 500-ml-Erlenmeyerkolben wie oben beschrieben verwendet. Die beiden so erhaltenen Lebendkulturen werden ebenfalls zu Vaccinen verar- beitet.
In der folgenden Tabelle 3 sind die Ergebnisse eines Vergleichs der erfindungsgemäss erhaltenen Vaccinen aus Isolationen Nr. 1 (Fermenter) und 6 und 7 (Schüttelkolben) mit Vaccinen, die ohne Selektion aus dem BCG-Ausgangsstamm erhalten werden, hinsichtlich Thermostabilität angegeben. Es wurden je 5 Ampullen mit 1 mg BCG-Trockengewicht eine Woche bei 50 gelagert. Vor und nach der Lagerung wird der Gehalt an lebensfähigen, Kolonien bildenden Zellein heiten (viable units) bestimmt. Die Zahlen sind Mittelwerte aus 5 Ampullen.
Tabelle 3 BCG-Stamm Anzahl Kolonien/mg BCG-Trockengewicht Dberlebensrate in /o vor der Lagerung nah der Lagerung Selektion Nr. 1 (Ferm.) 1,30.108 1,62. in 1, 25 Selektion Nr. 6 (Schüttelk.) 3,98.107 6, 92, 105 1,74 Selektion Nr. 7 (Schüttelk.) 5,94.107 7,5.105 1,26 Grundstamm 1,84.107 2,31.104 0, 13
In Tabelle 4 ist die immunisierende Wirkung der obigen Vaccinen im Vergleich zu derjenigen einer frischen BCG-Kultur angegeben. Als Versuchstiere dienten weisse Mäuse.
Der Inhalt der Ampullen mit 1 mg BCG-Trockengewicht wurde in 3 ml destilliertem Wasser, dem 3 aöo Tween 80 zugesetzt sind, aufgeschwemmt und die Suspension mit physiologischer Natriumchloridlösung bis zu einer Konzentration von 10 bzw. ly BCG/0, 1 ml weiterverdünnt. Je 20 Mäuse pro Versuchseinheit werden mit 1 ml einer Suspension, die 1y bzw. 10y BCG-Trockengewicht enthält, subku- tan geimpft. 4 Wochen nach der Impfung werden die Tiere intravenös mit einer letalen Dosis (0,4ml) mit 300 000 Zelleinheiten (viable units) des bovinen Tb-Stammes Ravenel geimpft. Es wird die mittlere Überlebenszeit festgestellt.
Nicht geimpfte Tiere sterben im Durchschnitt 20 Tage nach der Infektion.
Tabelle 4 Impfstoff Mittlere Überlebenszeit (je 20 Mäuse) ly BCG/Maus 10y BCG/Maus Selektion Nr. 1 24 Tage 43 Tage (Fermenter) Selektion Nr. 6 35 Tage 39 Tage (Schüttelk.) Selektion Nr. 7 26 Tage 36 Tage frische BCG-Kultur (ca. 20-3Qz BCG 39 Tage Trockengewicht)