Verfahren zur Herstellung von Anthelvenein Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuartigen Antibiotikums, das mit der Bezeichnung Anthelvenein belegt wird sowie dessen Säureadditions- salze. Diese neuen Verbindungen können insbesondere zur Rezeptur von Tierfuttermitteln bzw. Zusatzfutter mitteln verwendet werden.
Anthelvencin ist eine basische stickstoffhaltige Ver bindung, die erhalten wird, wenn bestimmte, bisher nicht beschriebene Stämme der Acrynomycete Strepto- myces venezuelae unter geregelten Bedingungen ge züchtet werden. Als freie Base ist das Anthelvencin verhältnismässig unbeständig. Seine Verwendung und Charakterisierung erfolgt daher vorzugsweise in Form der Additionssalze mit organischen oder anorganischen, therapeutisch geeigneten Säuren. Vorzugsweise werden die Salze mit 2 Naphthalinsulfonsäure und Salicylsäure verwendet.
Die verschiedenen Eigenschaften von Anthelvencin in Form seines Additionssalzes mit 2-Naphthalinsulfon- säure werden weiter unter beschrieben.
Das Anthelvencin kann weiterhin in Tierfutter mitteln, Zusatzfuttermitteln bzw. Tierfuttermittelkonzen- traten enthalten sein.
Das Verfahren zur Herstellung von Anthelvencin ist dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces venezuelae ATCC <B>14583,</B> Streptomyces venezuelae ATCC 14854 oder Streptomyces venezuelae ATCC 14585 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorga nische Salze enthält, unter aeroben Bedingungen in Form eine Tauchkultur züchtet.
Anthelvencin kann auch zur Behandlung von Wurm krankheiten verwendet werden, indem man einem mit Parasiten befallenen Wirtsorganismus eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der aus Anthelvencin und seinen Säureadditionssalzen mit physiologisch ge eigneten Säuren bestehenden Gruppe verabreicht. Unter den verschiedenen Säureadditionssalzen ist z. B. 2-Naphthalinsulfonsäuresalz des Anthelvencins bekannt.
Es ist eine weisse, kristalline Festsubstanz, die bei etwa 18l-183 C schmilzt und in heissem Wasser, Methanol, Benzylalkohol, Dimethylformamid, Dimethyl- sulfoxyd, Phenol, Methylcellosolve und wässrigen Lö- sungsmittelgemischen wie wässrigem Aceton, wässrigem Alkohol und .dergleichen löslich ist.
In Äthanol ist es nur schwach und in Lösungsmitteln wie kaltem Wasser, Isopropanol, Aceton, Äthylacetat, Äther, Chloroform, Benzol und dergleichen verhältnismässig unlöslich.
Die elektrometrische Titration von Anthelvencin-2- naphthalinsulfonat in 66 % igem wässrigem Dimethyl- formamid zeigt das Vorliegen von zwei titrierbaren Gruppen mit pKä Werten von 9,58 und 11,95. Das aus der Titrationskurve bestimmte scheinbare Molekular gewicht beträgt etwa 847.
Ein Durchschnitt mehrerer Mikroanalysen von Anthelvencin-2-naphthalinsulfonat ergibt die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung: C 54,78 %; H 5,23 %; N 14,66 %; O 17,38 %; ,S 7,41 %. Die empi rische Formel des Salzes, die am besten mit diesen Daten in Einklang zu bringen ist, ist C:;9H44N909S2, woraus sich die empirische Formel der freien Base Anthelvencin zu C@gH"sN:30,3 ergibt.
Das Infrarotabsorptionsspektrum von Anthelvencin- 2 Naphthalinsulfonat in einer Verreibung in Mineralöl wird in Fig.l gezeigt.
Die unterscheidungskräftigen Banden in der Infrarotabsorptionskurve innerhalb des Bereichs von 2,0 bis 15,0,u sind wie folgt: 2,79; 3,04; 3,20; 3,41 (Mineralöl); 3,48 (Mineralöl); 5,8:6; 5,91 (Schulter); 6,08; 6,26; 6,47; 6,60 (Schulter); 6,83 (Mineralöl); 6,95; 7,07; 7,22 (zum grossen Teil auf das :Mineralöl zurückzuführen); 7,40; 7,55; 7,88; etwa 8,35 (breit); 8,55; 8,65; 8,79;<B>9,11;</B> 9,36; 9,64; 10,10 (schwach);<B>10,30;</B> 10,49 (schwach); 10,58; 10,95; 11,1l;
<B>11,25;</B> 11,52;<B>12,16;</B> 12,39; 12,98;<B>13,17;</B> 13,38; 13,89 und 14,78 ,u. Die spezifische optische Drehung von Anthelvencin- 2-naphthalinsulfonat - getrocknet bei Raumtemperatur in einem Vakuumexsiccator über Phosphorpentoxyd beträgt +11,7 , wenn die Bestimmung bei einer Tem peratur von<B>25'</B> C in einer Lösung in 95 % igem wässrigem Äthanol durchgeführt wird,
in der die Konzentration des Salzes des Antibioticums 1 % (auf Gewicht/Volumen- Grundlage) beträgt.
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum einer wässrigen Lösung von Anthelvencin-2-naphthalinsulfonat zeigt ein Maximum bei 225 my mit einer Absorption von Ei /-@1 = 2180 sowie ein weiteres Maximum bei 285 m,y mit einer Absorption von E i /m = 330.
Ein Pulverröntgenstrahlenbeugungsdiagramm dieses Salzes unter Verwendung von mit Hilfe von Nickel filtrierter Kupferstrahlung und eines Wellenlängenwertes von 1,5405 A zur Charakterisierung der Zwischenebenen abstände liefert folgende Werte:
EMI0002.0021
(d) <SEP> (I/Ii)
<tb> 11,70 <SEP> 0,10
<tb> 10,71 <SEP> 0,02
<tb> 9,50 <SEP> 0,10
<tb> 8,33 <SEP> 0,33
<tb> 8,00 <SEP> 0,02
<tb> 7,40 <SEP> 0,02
<tb> 7,07 <SEP> 0,10
<tb> 6,70 <SEP> 0,04
<tb> 6,25 <SEP> 0,20
<tb> 6,06 <SEP> 0,50
<tb> 5,86 <SEP> 0,27
<tb> 5,56 <SEP> 0,07
<tb> 5,23 <SEP> 0,20
<tb> 4,95 <SEP> 0;
02
<tb> 4,63 <SEP> <B>1,00</B>
<tb> 4,36 <SEP> 0,13
<tb> 4,15 <SEP> 0,07
<tb> 3,99 <SEP> 0,13
<tb> 3,79 <SEP> 0,04
<tb> 3,65 <SEP> 0,50
<tb> 3,45 <SEP> 0,27
<tb> 3,33 <SEP> 0,01
<tb> 3,28 <SEP> 0,10
<tb> 3,11 <SEP> 0,33
<tb> 3,00 <SEP> 0,10
<tb> 2,90 <SEP> 0,03
<tb> 2,82 <SEP> 0,02
<tb> 2,68 <SEP> 0,07
<tb> 2,59 <SEP> 0,07
<tb> 2,47 <SEP> 0,07
<tb> 2,46 <SEP> 0,01
<tb> 2,39 <SEP> 0;
03
<tb> 2,34 <SEP> 0,02
<tb> 2,27 <SEP> 0,02
<tb> 2,24 <SEP> 0,02
<tb> 2,18 <SEP> 0,02
<tb> 2,09 <SEP> 0,04
<tb> 2,01 <SEP> 0,04
<tb> 1,977 <SEP> 0,04
<tb> 1,870 <SEP> 0,02
<tb> 1,809 <SEP> 0,03
<tb> 1,747 <SEP> 0,03
<tb> 1,717 <SEP> 0,01
<tb> 1,657 <SEP> 0,02
<tb> 1,552 <SEP> 0,02 Anthelvencin-2-naphthalinsulfonat liefert ein posi tives Ergebnis beim Ehrlich-Test und negative Ergeb nisse beim Ninhydrintest auf a-Aminosäuren und beim Sakaguchi-Test auf Guanidinogruppen.
Es können auch andere Additionssalze hergestellt werden. So ist das Salicylsäuresalz von Anthelvencin eine weisse kristalline Festsubstanz, die bei etwa 153-.155 C schmilzt. Die Löslichkeitseigenschaften dieses :Salzes sind ähnlich wie diejenigen des 2-Naph- thalinsulfonats, mit Ausnahme einer etwas höheren Löslichkeit in kaltem Wasser.
Die elektrometrische Titration von Anthelvencin- salicylat in 66 % igem wässrigem Dimethylformamid zeigt das Vorliegen von titrierbaren Gruppen mit pK"rWerten von 9,75 und 11,98 und ein scheinbares Molekular gewicht von etwa 726.
Das Infrarotabsorptionsspektrum von Anthelvencinsalicylat, .das in Fig.2 gezeigt wird, besitzt innerhalb des Bereichs von 2,0-15,0,u die fol genden unterscheidungskräftigen Banden: 3,05; 3,42 (Mineralöl); 3,48 (Mineralöl); 3,65 (Schulter); 3,73 (Schulter); 4,00; 4,25 (schwach); 5,88; 6,10; 6,26; etwa 6,50 (breit); 6,73; 6,85 (Mineralöl); 7,24; 7,40; 7,69; 8,00; 8,15 (Schulter); 8,31; 8,68 (Schulter); 8,76; 8,92; 9,40 (schwach); 9,72; 10,43 (schwach); 11,27 (schwach); 11;66; 12,44; 13,2'2; 13,90; 14,27 und etwa 15,10 p.
Eine wässrige Lösung von Anthelvencinsalicylat zeigt in ihrem Ultraviolettabsorptionsspektrum zwei Maxima, eines bei 230 m,u mit einer Absorption von Ei - 508 eni und das andere bei 295 my mit einer Absorption von E i @m - 435.
Die Elementaranalyse von Anthelvencinsalicylat zeigt, dass das Salz die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung aufweist: C 56,27 7o; H 5,62 %; N 17,97 %; <B>0</B> 20,09 %.
Die auf Grund .dieser Werte berechnete empirische Formel für das Salz lautet C33H,oN909, woraus sich für die freie Base Anthelvencin wiederum die Formel CinH'aN903 ergibt.
Anthelvencinsalicylat weist eine spezifische Drehung von +7,9 auf, bestimmt bei 25 C an Hand einer 1 % igen Lösung des Salzes in 95 % igem wässrigem Äthanol.
Andere Säuren, und zwar sowohl organische als auch anorganische, können ebenfalls zur Herstellung von Additionssalzen des Anthelvencins verwendet werden. Zu verwendbaren anorganischen Säuren gehören Salz säure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
Als Beispiele organischer Säuren, die zur Salzbildung verwendet werden können, seien erwähnt; Citronensäure, Ameisensäure, Essigsäure, Weinsäure, p-Bromsalicyl- säure, Pikrinsäure, m-Nitrobenzoesäure, Flaviansäure, p-Nitrophthalsäure, p - (2 - Hydroxy -1- naphthylazo)- benzolsulfonsäure (Orange 1I) und dergleichen Säuren.
Im allgemeinen werden die Additionsalze des Anthel- veneins mit organischen Säuren vorzugsweise aus einem Salz mit einer anorganischen Säure hergestellt, wie z. B. aus dem Hydrochlorid.
Die vollständige Strukturformel von Anthelvencin konnte bis jetzt noch nicht bestimmt werden. Hydroly- tische Abbauuntersuchungen zeigen jedoch, dass Anthel- vencin einen oder mehrere Pyrrolreste und eine Viel zahl von Peptidverbindungen aufweist.
Die Abbau untersuchungen zeigen weiterhin, dass das Anthelvencin- molekül eine oder mehrere Einheiten von f-Alanin sowie entweder Glutaminsäure oder ein Bruchstück aufweist, das unter den Abbaubedingungen in Glutaminsäure um gewandelt wird.
Wie es bei Peptidantibiotica häufig der Fall ist, besteht das Anthelvencin, wie es normaler weise bei der fermentativen Herstellung erhalten wird, aus mindestens zwei eng verwandten Verbindungen, die im Anschluss hieran als Anthelvencin A und Anthel- vencin B bezeichnet werden. Die Bezeichnung Anthel- venein , wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf das Antibioticum in der Form, wie es bei der Fermen tation erhalten wird.
Die physikalischen Eigenschaften von Anthelvencin A und Anthelvencin B sind sehr ähnlich. Die Anti- biotica unterscheiden sich hauptsächlich durch ihr Ver halten in bestimmten chromatographischen Systemen. Ein besonders brauchbares Verfahren zur Unterschei dung der beiden Antibiotica besteht z. B. in einer Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel mit einem Lösungsmittelsystem, das aus 15 Teilen n Butanol, 10 Teilen Pyridin, 1 Teil Eisessig und 12 Teilen Wasser besteht.
In einem solchen System kann der Rf-Wert für Anthelvencin A 0,5 betragen, während er für Anthel- v encin B<B>0,3</B> beträgt.
Anthelvencin kann eine Hemmwirkung gegen das Wachstum bestimmter Mikroorganismenstämme, ein schliesslich bakterieller Krankheitserreger und pilz- bzw. schwammartiger Pflanzenkrankheitserreger, ausüben. Qualitativ sind die mikrobiologischen Wirksamkeiten von Anthelvencin A und Anthelvencin B praktisch iden tisch.
Auf der Grundlage gleicher Gewichtsmengen ist jedoch die mikrobiologische Wirksamkeit von Anthel- vencin-A-naphthalinsulfonat etwa 2mal so gross wie diejenige des entsprechenden ,Salzes von Anthelvencin B. Die Konzentrationen in Anthelvencin, bei denen im allgemeinen eine Hemmung des Wachstums verschie dener Organismen festzustellen ist, werden zahlenmässig in Tabelle I angegeben.
Die Mindesthemmkonzentration konnte mit Hilfe des Agarverdünnungstestes oder mit Hilfe des Nährbrühen-Verdünnungstestes bestimmt werden, und .die Hemmkonzentrationen für die bakte riellen Krankheitserreger und die pilz- bzw. schwamm artigen Pflanzenkrankheitserreger wurden über einen Zeitraum von 72 Stunden bestimmt.
Beim Agarverdünnungstest wird der Testorganismus vorzugsweise auf eine Reihe von Agarplatten gestrichen bzw. implantiert, die verschiedene Konzentrationen an Anthelvencin im Agar enthalten, um die Mindestkon zentration des Antibiotikums in ,ug/cm3 zu bestimmen, bei der eine Hemmung des Wachstums des Organismus über einen Zeitraum von 48 Stunden eintritt.
Beim Nährbrühen- Verdünnungstest wird eine Reihe von Prüfröhrchen, die eine Nährbrühe mit verschiede nen Konzentrationen an Anthelvencin enthalten, mit dem Testorganismus beimpft, um die Mindestkonzen tration Anthelvencin in ,ug/cm3 in der Nährbrühe zu bestimmen, bei der eine Hemmung des Wachstums des Organismus über einen Zeitraum von etwa 24 Stun den eintritt.
EMI0003.0054
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Mindest Testorganismus <SEP> hemmkonzentration
<tb> ,ug/cm3 <SEP> 24 <SEP> Std.
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 25,0
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 50,0
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 12,5
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 1,56
<tb> myco. <SEP> tuberculosis <SEP> (607) <SEP> 50,0
<tb> myco.
<SEP> avium <SEP> 25,0
EMI0003.0055
<I>Tabelle <SEP> 1</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Mindest Testorganismus <SEP> hemmkonzentration
<tb> ,ug/cm3 <SEP> 24 <SEP> Std.
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 12,5
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 25,0
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> <B>100,0</B>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 25,0
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> 50,0
<tb> Shigella <SEP> paradysenteriae <SEP> 50,0
<tb> Vibrio <SEP> metschnikovii <SEP> 50,0
<tb> Saccharomyces <SEP> pastorianus <SEP> 6,25
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> <B>100,0</B>
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> 3,13
<tb> Trichophyton <SEP> interdigitale <SEP> 3,13 <SEP> a
<tb> Argobacterium <SEP> tumefaciens <SEP> 12,5
<tb> Corynebacterium <SEP> michiganense <SEP> 1,56
<tb> Erwinia <SEP> amylovora <SEP> 6,25
<tb> Pseudomonas <SEP> solanacearum <SEP> 6,
25
<tb> Xanthomonas <SEP> phaseoli <SEP> <B>12,5</B>
<tb> Alternaria <SEP> solani <SEP> 6,25
<tb> Botrytis <SEP> cinerea <SEP> 6,25
<tb> Caratostomella <SEP> ulmi <SEP> 25,0
<tb> Collletotrichum <SEP> pisi <SEP> 12,5
<tb> Endoconidiophora <SEP> fagacearum <SEP> 50,0
<tb> Fusarium <SEP> moniliforme <SEP> 50,0
<tb> Carotostomellaulmi <SEP> 25,0
<tb> Helminthosporium <SEP> sativum <SEP> 12,5
<tb> Penicillium <SEP> expansum <SEP> 50,0
<tb> Phoma <SEP> pigmentovora <SEP> 100,0
<tb> Polyporus <SEP> ostreatus <SEP> 3,13
<tb> Pullularia <SEP> sp. <SEP> 100,0
<tb> Verticillium <SEP> albo-atrum <SEP> 50,0
<tb> a) <SEP> bestimmt <SEP> während <SEP> 48 <SEP> Stunden Mit dem .Salicylsäuresalz des Anthelvencins werden identische Werte erhalten.
Aus diesen Daten ist ersicht lich, dass Anthelvencin in Form seiner äureadditions- salze zur Unterdrückung des Wachstums der verschie densten pathogenen Organismen brauchbar ist.
Die Säureadditionssalze des Anthelveneins können weiterhin zur Bekämpfung von Eingeweidewürmern und verschiedenen anderen Typen von parasitären Orga nismen gebraucht werden. So hat sich z.
B. eine Wirk samkeit gegenüber beiden Arten des Mäuse-Maden- wurmes, Syphacia obvelata und As,pivuluris tetraptera, und gegenüber den Schweinewürmern Ascaria summ,
Oeseophagostumum spp. und Trichuris suis gezeigt. Bei Einverleibung in die tägliche Futterration von Schweinen für einen Zeitraum von mindestens 35 Tagen erweisen sich die Anthelvencinsalze bei einer Konzen tration von nur 12 g je Tonne Futter als wirksam, den Wurmbefall der Tiere zu verringern. Kombinationen von Anthelvencin mit anderen Substanzen mit Anthel- minticumeigenschaften, wie z.
B. mit Piperazin, Hygro- mycin B und dergleichen, können ebenfalls verwendet werden. Weitere Organismen, die mit Hilfe von Anthel- vencin bekämpft werden können, sind u. a. Escherichia coli, Proteus vulgaris, Entamoeba histolytica und der gleichen.
Die akute Toxizität von Anthelvencinsalicylat konnte an der Maus bestimmt werden. Oral beträgt der LDäo- Wert dieses Salzes mehr als 500 mg/kg. Der LD5o-Wert von Anthelvencinsalicylat beträgt etwa 175 mg/kg, wenn das Arzneimittel intraperitoneal injiziert wird.
Anthelvencin wird durch Züchten von bisher unbe kannten Stämmen von Streptomyces venezuelae unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium ,erhalten, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stick stoff sowie anorganische Salze enthält. Die Organismen konnten zuerst aus Bodenproben isoliert werden. Anteile der Bodenproben wurden vorzugsweise in sterilem, destilliertem Wasser suspendiert und die Suspensionen auf Nähragarplatten gestrichen.
Die beimpften Nähr- agarplatten wurden in der Regel mehrere Tage bei etwa 25-35 C bebrütet. Am Ende der Bebrütungszeit wur den die Kolonien der Anthelvencin bildenden Orga nismen mit Hilfe einer sterilen Platinöse auf Schrägagar- medien übertragen. Die beimpften Schrägagarmedien wurden bebrütet, um grössere Mengen an Impfkultur zur Herstellung von Anthelvencin erhalten zu können.
Die neuartigen Organismen, die zur Bildung von Anthelvencin befähigt sind, sind bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C., USA, hinterlegt worden und stehen der Öffentlichkeit unter den ATCC- Hinterlegungsnummern 14583, 14584 und 14585 zur Verfügung.
Wegen der Unsicherheit, die bei klassifizierenden Untersuchungen bei der Streptomyces-Gruppe der Mikroorganismen besteht, ist die Klassifizierung eines neu entdeckten Organismus stets mit gewissen Zweifeln behaftet. Die Anthelvencin bildenden Organismen schei nen jedoch in ihren wichtigsten Eigenschaften den Be schreibungen am nächsten zu kommen, die für die Organismen S. cinnamonensis, S. roseoflavus und S. venezuelae (NRRL 902) gegeben worden sind, die sämtlich bestimmten Stämmen von S.lavendulae mit geraden Sporenketten ähneln.
Trotz gewisser Ähnlich- keiten bestehen jedoch ausreichende Unterschiede, um die neuartigen Organismen, die im erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung von Anthelvencin verwendet werden, von sämtlichen bisher beschriebenen Orga nismen zu unterscheiden. Die neuen Organismen kom men den obengenannten S. venezuelae (NRRL 902) in ihren Eigenschaften näher als irgendeinem anderen bisher beschriebenen Organismus. Zwischen den neuen Kulturen und S. venezuelae (NRRL 902) bestehen jedoch zahlreiche Unterschiede.
Die neuartigen Orga nismen des vorliegenden erfindungsgemässen Verfahrens sind daher als neue Stämme von S. venezuelae anzu sehen.
Die folgende ausführliche Beschreibung bezieht sich auf die neu aufgefundenen Organismen ATCC 14583, 14584 und 14585 und deren Verwendung zur erfin dungsgemässen Herstellung von Anthelvencin durch Züchten von Mutanten dieser Antfhelvencin bildenden Organismen. Derartige andere Mutanten können nach bekannten Verfahren erhalten werden, wie z. B. da durch, dass man einen der obigen Stämme mit Röntgen strahlen oder Ultraviolettstrahlen oder mit chemischen Mitteln, wie z. B. mit Stickstofflostverbindungen, be handelt.
Bei den Klassifizierungsuntersuchungen der Anthel- vencin bildenden Stämmen von C. venezuelae ATCC 14583, 14584 und 14585 konnten Verfahren ange wendet werden, wie sie bei der Klassifizierung von Antinomyceten üblich sind. Die Kohlenstoffverwertungs- Prüfversuche wurden nach dem Verfahren von Prid- ham und Gottlieb, J. Bact. 56, 107 (1948), durchge führt.
Die bei den klassifizierenden Untersuchungen erhaltenen Daten werden im folgenden in Tabellenform angegeben. Die in Klammern gegebenen Zahlen bezie hen sich auf die Farbtafeln von Maers und Paul, Dictio- nary of Color (1950). Die Kulturen wurden in der Regel bei 30 C gezüchtet und die morphologischen, physiologischen und Züchtungseigenschaften nach 14tägiger Bebrütung und die Kohlenstoffverwertung nach 10 Tagen Bebrütung bestimmt.
EMI0004.0079
<I>Tabelle <SEP> 11</I>
<tb> Beschreibung <SEP> der <SEP> Kulturen <SEP> ATCC <SEP> 14583, <SEP> 14584 <SEP> und <SEP> 14585
<tb> Verglichene <SEP> Eigenschaften <SEP> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 14584 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> Morphologie <SEP> Sporenketten <SEP> gerade <SEP> oder <SEP> Sporenketten <SEP> gerade <SEP> oder <SEP> Sporenketten <SEP> gerade <SEP> oder
<tb> gekrümmt; <SEP> Sporen <SEP> gekrümmt; <SEP> Sporen <SEP> gekrümmt; <SEP> Sporen
<tb> 0,7-1,0<I>,u <SEP> X</I> <SEP> 1,0-1,8<I>,u,</I> <SEP> 0,7-1,0 <SEP> <I>,u <SEP> X</I> <SEP> 1,0-1,8 <SEP> <I>,u,</I> <SEP> 0,7-1,0 <SEP> <I>,u <SEP> X</I> <SEP> 1,2-1,8 <SEP> <I>,It,</I>
<tb> oval <SEP> bis <SEP> zylindrisch. <SEP> oval <SEP> bis <SEP> zylindrisch. <SEP> zylindrisch.
<tb> Kolonieeigenschaften <SEP> auf: <SEP> Wachstum <SEP> reichlich; <SEP> Wachstum <SEP> reichlich;
<SEP> Wachstum <SEP> reichlich;
<tb> Tomatenpaste- <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich,
<tb> Hafermehl <SEP> rosagrau <SEP> (43-1B); <SEP> Rück- <SEP> hellgrau <SEP> (35-A1); <SEP> Rück- <SEP> rosagrau <SEP> (51-2A); <SEP> Rück seite <SEP> rotbraun <SEP> <B>(</B>16-11A); <SEP> Seite <SEP> braun <SEP> (15-E7); <SEP> Seite <SEP> dunkel <SEP> rotbraun
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> (8-9H); <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> dunkel <SEP> rotbraun.
<tb> Nähragar <SEP> Wachstum <SEP> befriedigend; <SEP> Wachstum <SEP> befriedigend; <SEP> Wachstum <SEP> befriedigend;
<tb> kein <SEP> Luftmycel; <SEP> kein <SEP> Luftmycel; <SEP> kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Rück Rückseite <SEP> gelb <SEP> (10-1E); <SEP> Rückseite <SEP> gelb <SEP> (11L7);
<SEP> Seite <SEP> gelb <SEP> (10-3H);
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> Hefe <SEP> Wachstum <SEP> reichlich; <SEP> Wachstum <SEP> mässig; <SEP> Wachstum <SEP> reichlich;
<tb> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> weiss <SEP> Luftmycel <SEP> spärlich,
<tb> hellgrau <SEP> (20=1A); <SEP> bis <SEP> hellbraun <SEP> (4-A8); <SEP> weiss <SEP> (1-1B);
<tb> Rückseite <SEP> hell <SEP> rotbraun; <SEP> Rückseite <SEP> braun <SEP> (14-J8); <SEP> Rückseite <SEP> rotbraun;
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
EMI0005.0001
<I>Tabelle <SEP> 11</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Verglichene <SEP> Eigenschaften <SEP> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 14584 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> Salze-Stärke-Agar <SEP> Wachstum <SEP> reichlich; <SEP> Wachstum <SEP> reichlich; <SEP> Wachstum <SEP> reichlich;
<tb> Luftmycel, <SEP> grauweiss <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> weiss <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich,
<tb> (12-1A); <SEP> Rückseite <SEP> bis <SEP> hellbraun <SEP> (10-A2); <SEP> hell <SEP> orangegelb <SEP> (9-2A);
<tb> braun <SEP> (14-11G); <SEP> Rückseite <SEP> braun <SEP> (14A5); <SEP> Rückseite <SEP> braun <SEP> (8-10J);
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> sehr <SEP> hellbraunes <SEP> lösliches
<tb> Pigment.
<tb> Czapekscher <SEP> Agar <SEP> Wachstum <SEP> mässig; <SEP> Wachstum <SEP> mässig;
<SEP> Wachstum <SEP> mässig;
<tb> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> nahezu <SEP> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> weiss <SEP> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> weiss;
<tb> weiss <SEP> (2-7A); <SEP> bis <SEP> hellbraun <SEP> (3-B7, <SEP> 3A8); <SEP> Rückseite <SEP> rotbraun <SEP> (5-9G);
<tb> Rückseite <SEP> gelb <SEP> (11-4J); <SEP> Rückseite <SEP> rotbraun <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> (7-H9);
<SEP> schwach <SEP> rotes
<tb> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> Einwirkung <SEP> auf <SEP> Milch <SEP> Koagulierung, <SEP> Reichlich <SEP> bräunlichgelbes <SEP> Koagulation,
<tb> Peptonisierung. <SEP> Oberflächenwachstum, <SEP> Peptonisierung.
<tb> Koagulierung, <SEP> teilweise
<tb> Peptonisierung.
<tb> Nährgelatine <SEP> vollständige <SEP> Verflüssigung <SEP> 50 <SEP> % <SEP> ige <SEP> Verflüssigung <SEP> vollständige <SEP> Verflüssigung
<tb> nach <SEP> 19 <SEP> Tagen. <SEP> nach <SEP> 19 <SEP> Tagen. <SEP> nach <SEP> 19 <SEP> Tagen.
<tb> Nitratredukthon <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> H,-S-Bildung <SEP> - <SEP> - <SEP> In <SEP> der <SEP> folgenden <SEP> Tabelle <SEP> III <SEP> sind <SEP> die <SEP> Ergebnisse <SEP> suche <SEP> wiedergegeben.
<SEP> In <SEP> der <SEP> Tabelle <SEP> wurden <SEP> die <SEP> folgen der <SEP> an <SEP> den <SEP> Organismen <SEP> ATCC <SEP> 14583, <SEP> 14584 <SEP> und <SEP> den <SEP> Symbole <SEP> verwendet:
<tb> 14585 <SEP> durchgeführten <SEP> Kohlenstoffverwertungs-Prüfver + <SEP> = <SEP> Wachstum <SEP> und <SEP> Verwertung
<tb> - <SEP> = <SEP> Wachstum <SEP> oder <SEP> Verwertung <SEP> nicht <SEP> erkennbar.
EMI0005.0002
<I>Tabelle <SEP> 111</I>
<tb> Kohlenstoffverwertung <SEP> von <SEP> Anthelvencin <SEP> bildenden <SEP> Organismen
<tb> Subtrat <SEP> Wachstum
<tb> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 15484 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> L <SEP> (+)-Arabinose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> L <SEP> (+)-Rhamnose <SEP> - <SEP> - <SEP> D-Ribose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D <SEP> (+) <SEP> Xylose <SEP> + <SEP> + <SEP> Dexeose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D <SEP> (-)Fructose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Mannose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Lactose <SEP> - <SEP> - <SEP> Maltose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Saccharose <SEP> - <SEP> - <SEP> D <SEP> (+)-Trehalose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Inulin <SEP> - <SEP> - <SEP> D <SEP> (+)
-Raffinose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> i-Inosit <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> Mannit <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Sorbit <SEP> - <SEP> - <SEP> Cellulose <SEP> - <SEP> - <SEP> Salicin <SEP> + <SEP> + <SEP> + Bei der Herstellung von Anthelvencin durch Züchten der oben beschriebenen Organismen können die ver- schiedensten Kulturmedien verwendet werden, da aus den Ergebnissen der oben beschriebenen Verwertungs- Prüfversuche ersichtlich ist, dass die Organismen ver schiedene Energiequellen zu verwerten vermögen.
Aus Gründen einer wirtschaftlichen Herstellung, einer maxi malen Ausbeute an Antibioticum und der Leichtigkeit der Isolierung des Antibioticums sind jedoch bestimmte Kulturmedien vorzuziehen, die verhältnismässig einfache Nährstoffquellen enthalten. Zum Beispiel enthalten die Medien, die zur Herstellung von Anthelvencin brauch bar sind, eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, wie z. B.
Glukose, Fructose, Maltose, Mannose, lösliche Stärke, Melassen, Dextrin, braunen Zucker, Maisquell- feststoffe und dergleichen. .Eine bevorzugte Quelle für Kohlenstoff ist Glukose. Zusätzlich enthalten die ver wendbaren Medien eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, wie z. B. Hafermehl, Rindfleischextrakt, Pep tone (aus Fleisch oder Sojabohnen), hydrolysiertes Casein, Hefe, Aminosäuregemische und dergleichen.
Zur Zeit bevorzugte Stickstoffquellen sind P'eptone, hydrolysiertes Casein und Rindfleischextrakte.
Mineralsalze, wie z. B. solche, .die Calcium-, Magne sium-, Natrium-, Kalium-, Chlorid-, Sulfat- und Carbo- nationen liefern, sowie eine Quelle für Wachstumsfakto ren, wie z. B. Hefe oder Hefeextrakt, sind in die Medien mit günstigen Ergebnissen einverleibt..
Wie bei vielen Mikroorganismen ist es wünschens wert anzusehen, dem für die Züchtung der-erfindungs- gemässen hergestellten Actinomyceten benutzten Kultur medium die sogenannten Spurenelemente zuzusetzen. Diese Spurenelemente werden gewöhnlich als Verunrei nigungen zwang ,läufig mit der Zugabe der anderen Bestandteile des Mediums zugeführt.
Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann innerhalb breiter Grenzen variiert werden. Es hat sich jedoch als wünschenswert erwiesen, den Anfangs-pH- Wert des Mediums zwischen etwa 6,0 und etwa 7,5 und vorzugsweise zwischen etwa 6,5 und etwa 7,3 ein zustellen. Wie es bei anderen Actinomyceten beobachtet worden ist, erhöht sich der pH-Wert des Mediums allmählich während der ganzen Wachstumsperiode des Organismus, während Anthelvencin gebildet wird und kann eine Höhe von etwa 7,0 bis etwa 8,0 oder dar über erreichen.
Der End-pH-Wert ist mindestens zum Teil vom Anfangs-pH-Wert des Mediums, den im Medium vorhandenen Puffersubstanzen und der Zeit dauer abhängig, die der Organismus wachsen gelassen wird.
Die aeroben Tauchkulturbedingungen können bei der Herstellung von Anthelvencin verschieden sein. Zur Herstellung verhältnismässig kleiner Mengen kön nen Schüttelflaschen und Oberflächenkulturen in Fla schen verwendet werden; für die Herstellung grosser Mengen ist jedoch die aerobe Tauchkultur in Steril tanks vorzuziehen. Das in dem Steriltank befindliche Medium kann mit einer Sporensusp.ension beimpft wer den; wegen der Wachstumsverzögerung, die bei Ver wendung einer Sporensuspension als Impfmaterial be obachtet wird, ist jedoch die vegetative Form der Kultur zu bevorzugen.
Indem man auf diese Weise die Wachs tumsverzögerung vermeidet, erreicht man eine wirksamere Ausnutzung der Fermentationsanlagen. Dementspre chend ist es wünschenswert, zunächst eine vegetative Impfkultur des Organismus herzustellen, indem man eine verhältnismässig geringe Menge Kulturmedium mit der Sporenform des Organismus beimpft; und wenn eine junge, aktive vegetative Impfkultur erhalten wor den ist., wird die vegetative Impfkultur unter asep tischen Bedingungen auf den grossen Fermentationstank übertragen.
Das Medium, in dem die vegetative Impf kultur hergestellt wird, kann entweder das gleiche oder ein anderes als das Medium sein, das für die im grossen Massstabe erfolgende Herstellung von Anthelvencin ver wendet wird.
Die Organismen wachsen in der Regel am besten bei Temperaturen im Bereich von etwa 26-33 C. Eine optimale Anthelvencinbildung scheint bei Tempe raturen von etwa 26-30 C stattzufinden.
Wie es bei unter aeroben Bedingungen durchgeführ ten Tauchkulturverfahren üblich ist, wird insbesondere sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Zur Er zielung eines wirksamen Wachstums des Organismus und einer wirksamen Anthelvencinbildung beträgt das bei der Tankherstellung von Anthelvencin verwendete Luftvolumen vorzugsweise mindestens 0,1 Volumteil Luft je Minute und je Volumteil Kulturmedium.
Die Zunahme der Anth:elvencinaktivität in dem Kulturmedium kann während der Fermentationsdauer leicht verfolgt werden, indem man aus dem Kultur medium entnommene Proben auf ihre Hemmwirksam keit gegenüber dem Wachstum eines Organismus, von dem bekannt ist, dass sein Wachstum in Gegenwart von Anthelvenein gehemmt wird, prüft. Die Verwendung des Organismus Bacillus subtilis hat sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Die Prüfung kann unter Anwendung wohlbekannter Trübungsmessungsverfahren oder Becher-Platten-Verfahren erfolgen.
Im allgemeinen findet eine maximale Bildung des Antibioticums innerhalb von etwa 4-7 Tagen nach der Beimpfung des Kulturmediums statt, wenn eine aerobe Tauchkultur oder eine Schüttelflaschenkultur angewen det wird, sowie innerhalb von etwa 5-10 Tagen, wenn eine Oberflächenkultur durchgeführt wird.
Das Mycel und die ungelösten Feststoffe werden im allgemeinen aus der Fermentationsbrühe mit Hilfe bekannter Mittel, wie z. B. durch Filtrieren oder Zen trifugieren, entfernt, gewöhnlich nach Einstellung des pH-Wertes auf etwa 3,5. Die antibiotische Wirksamkeit ist in der filtrierten Brühe enthalten und kann aus ihr unter Anwendung der üblichen Adsorptionsverfahren entfernt werden.
Es können die verschiedensten Adsorp- tionsmittel verwendet werden, jedoch werden im allge meinen Ionenaustauschharze von saurem Charakter be- vorzugt. Ein besonderes bevorzugtes Harz ist IRC-50 , ein schwach kationisches Carbonsäureharz, das von der Rohm and Haas Company auf den Markt gebracht wird.
Bei der Anwendung des Säulenadsorptionsverfahrens kann das Anthelvencin isoliert werden, indem man die filtrierte Brühe durch eine Säule gibt, die mit einem geeigneten lonenaustauschharz, wie z. B. IRC-50 , be schickt ist. Wenn 1 Teil Harz je 30-35 Teile filtrierter Brühe verwendet werden, wird üblicherweise eine prak tisch vollständige Entfernung des Anthelvencins aus der Fermentationsbrühe erreicht, wenn die Fliessgeschwin digkeit durch eine Säule mit einem Durchmesser von 7,62 cm bei etwa 5-10 cm2 je Minute gehalten wird.
Die Säule wird dann gründlich mit Wasser gewaschen, bis das Eluat farblos ist, und die antibiotische Wirksamkeit aus der Säule unter Verwendung eines Lösungsmittels eluiert, das eine verdünnte wässrige Säure und ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthält.
So hat sich ein Lösungsmittelgemisch, das aus 80 Volum- teilen 0,5 n Salzsäure und 20 Volumteilen Aceton be steht, als zur Eluierung der Anthelvencinwirksamkeit hoch wirksam erwiesen.
Zur Entfernung gewisser begleitender Verunreini gungen kann der pH-Wert des Eluats mit einer Base auf etwa 5,5 ,eingestellt werden, und das Eluat kann auf etwa seines ursprünglichen Volumens eingeengt, das eingeengte Eluat mit etwa 3 Vollumina Aceton unter Rühren versetzt und der pH-Wert des erhaltenen Ge misches erneut auf etwa 8,5 eingestellt werden.
Das Gemisch wird dann vorzugsweise durch eine Säule ge geben, die mit Florisil mit einer Teilchengrösse ent sprechend 0,149-0,250 mm lichter Siebmaschenweite (ein von der Floridin Company auf den Markt ge brachtes Magnesiumsilikat-Adsorptionsmittel) gefüllt ist, um färbende Substanzen und teerartige Stoffe zu ent fernen.
Die Säule wird weiter mit 75 % igem wässrigem Aceton gewaschen, bis sich das Eluat gegenüber Ehrlich- schem Reagenz negativ verhält, worauf man das ur sprüngliche Eluat und die Waschflüssigkeiten gewöhn lich vereinigt und einengt. Zu dem Konzentrat wird in der Regel Natriumchlorid in einer Menge von etwa 250 g je Liter Konzentrat gegeben. Der sich abschei dende dunkle, ölige Rückstand kann dann entfernt, das Gemisch filtriert und das klare Filtrat mit Benzyl- alkohol extrahiert werden.
Das Wasser wird üblicher weise aus den Benzylalkoholextrakten im Vakuum ent fernt und die erhaltene trockene Lösung in Benzyl- alkohol langsam zu etwa 9 Volumina Aceton gegeben. Beim Kühlen des erhaltenen Gemisches scheidet sich vor allem das Hydrochlorid des Anthelvencins ab. Das auf diese Weise erhaltene Produkt besteht in der Hauptsache aus dem Hydrochlorid von Anthelvencin A und enthält eine kleinere Menge Anthelvencin-B-hydro- chlorid.
Von Anthelvencin B freies Anthelvencin A kann in Form eines seiner Säureadditionssalze erhalten wer den, indem man das wie oben beschriebene Präparat einer weiteren Behandlung unterwirft: So kann z. B. das Gemisch der Anthelvencinhydrochloride in einem Lö- sungsmittelsystem, das n Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser enthält, gelöst und die erhaltene Lösung durch eine Säule gegeben werden, die mit vorbehandel tem Cellulosepulver beschickt ist.
Das Cellulosepulver ist vor allem in Wasser zu einer Ausschlämmung suspen diert, sodann abfiltriert und erneut nacheinander in 0,2 n wässriger Salzsäure, Wasser und einem aus n Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 15:10:1 :12 bestehenden Lösungsmittelsystem suspendiert worden.
Das aus der Säule fliessende Eluat wird vorzugsweise in regelmässigen Zeitabständen frak tioniert aufgefangen und der Verlauf der chromatogra- phischen Fraktionierung durch Prüfung der Fraktionen mit Hilfe der Dünnschichtschromatographie überwacht. Die zuerst aufgefangenen Fraktionen enthalten lediglich Anthelvencin-A-hydrochlorid. Sie werden von Zwischen fraktionen gefolgt, die die Salze beider Anthelvencine enthalten. In den zuletzt aufgefangenen Fraktionen ist in der Regel reines Anthelvencin-B-hydrochlorid ent halten.
Diejenigen Fraktionen, die reines Anthelvencin- A-hydrochlorid bzw. Anthelvencin-B-hydrochlorid ent halten, werden zusammengefasst und zur Trockne ein gedampft, wobei reine Abscheidungen des Hydro- chlorids von Anthelvencin A bzw. Anthelvencin B er halten werden können.
Zur Trennung des Gemisches von Anthelvencin A und B in seine Einzelbestandteile können auch andere Salze als die Hydrochloride benutzt werden. So kann man z. B. das Gemisch der Hydrochloride in ein Ge misch umwandeln, das die Naphthalinsulfonat- oder Salicylatsalze enthält, und sodann dieses Gemisch in ähnlicher Weise chromatographisch fraktionieren, um das entsprechende Salz von Anthelvencin A frei von dem Salz des Anthelvencins B zu erhalten.
<I>Beispiel 1</I> Herstellung von Anthelvencin Eine Kultur von Streptomyces venezuelae ATCC 14584 wird hergestellt, indem man den Organismus auf einem Schrägnähragar wachsen lässt. Der Nähragar wird aus 65 g Hafermehl hergestellt, das zu einer Auf- schlämmung verkocht und durchgeseiht und mit 20 g Agar und genügend Wasser vermischt wird, um ein Gesamtvolumen von 1 Liter zu erhalten.
Das Schräg nährmedium wird mit Sporen von S. venezuelae ATCC 14584 beimpft und 5 Tage bei 30 C bebrütet. Das auf dem Schrägnährmedium befindliche Kulturwachstum wird mit etwa 6 cm,', destilliertem Wasser bedeckt, und das Schrägnährmedium wird vorsichtig abgekratzt, um eine wässrige Suspension der Organismen zu erhalten.
1 cm3 der auf diese Weise erhaltenen Suspension wird verwendet, um unter aseptischen Bedingungen <B>100</B> cm3 eines sterilen vegetativen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung anzuimpfen: Cerelose 15 g Sojabohnenmehl 15 g Maisquellflüssigkeit 5 g Natriumchlorid 5 g Calciumcarbonat 2 g Wasser bis auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter Das angeimpfte vegetative Medium wird 48 .Stunden bei etwa 30 C bebrütet.
Innerhalb dieser Zeit werden die Kolben auf einer Schüttelmaschine, die sich jeweils um 5 cm hin und her bewegt, mit einer Geschwindig keit von 108 Schüttelbewegungen pro Minute geschüttelt.
5 cm,' der vegetativen Impfkultur werden zum asep tischen Beimpfen von 100-cm-3-Anteilen eines in 500- cm3-Erlenmeyerkolben enthaltenen Mediums verwendet, das 30 Minuten bei 120 C sterilisiert worden ist und die folgende Zusammensetzung aufweist: Sojabohnenmehl 15 g Casein 1 g Natriumnitrat 3 g Roher Glukosesirup 20 cm3 Calciumcarbonat 2,5 g Wasser bis auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter Die beimpfte Kultur wird 5 Tage bei etwa 30 C bebrütet, wobei wie oben beschrieben auf einer Schüttel maschine geschüttelt wird.
Der pH-Wert des Ausgangs mediums beträgt etwa 6,9. Am Ende der Bebrütungs- zeit hat sich der pH-Wert des Mediums auf etwa 7,3 erhöht.
Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe wird zur Entfernung des Mycels und der ungelösten Feststoffe filtriert. Die filtrierte Brühe enthält das von den Orga nismen gebildete Anthelvencin.
<I>Beispiel 2</I> Herstellung von Anthelveneinhydrochlorid Eine Kultur von Streptomyces venezuelae ATCC 1.4584 wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung eines Nährmediums hergestellt, das 20 g Stärke, 3 g Rind fleischextrakt, 1 g Asparagin, 20 g Agar und Wasser in einer solchen Menge, wie zum Auffüllen bis auf ,ein Gesamtvolumen von 1 Liter erforderlich ist, enthält. Die Schrägkulturen werden 5-7 Tage bei einer Tempe ratur von etwa 30 C wachsen gelassen.
Die auf der Schrägkultur gewachsenen Organismen werden dann wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert, und 1 cm3 der auf diese Weise erhaltenen Suspension wer den zum aseptischen Beimpfen von 100 cm3 eines steri lisierten vegetativen Kulturmediums verwendet, die sich in einem 500-cm3 Erlenmeyerkolben befinden und die folgende Zusammensetzung aufweisen Dextrose,
technisch rein 15 g Sojabohnenölmehl mit Lösungsmitteln extrahiert 15 g Maisquellflüssigkeit 10 g Natriumchlorid 5 g Calciumcarbonat 2 g Wasser bis auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter Das beimpfte Medium wird 24 Stunden bei<B>301C</B> bebrütet, wobei auf einer Drehschüttelmaschine, die Schüttelbewegungen von 5 cm bewirkt, mit 250 Schüttel bewegungen pro Minute geschüttelt wird.
Etwa 25 cm3 der erhaltenen vegetativen Kultur werden dann mit Hilfe einer sterilen Pipette in einen abgeänderten 4-Liter- Erlenmeyerkolben eingeführt, der 1 Liter eines Mediums der gleichen Zusammensetzung aufweist. Die Bebrütung wird 48 Stunden unter den beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Der gesamte Inhalt des Kolbens, der die vegetative Kultur enthält, wird in einen mit Prallplatten versehenen 45 Liter Fermentationsbehälter aus rost freiem Stahl überführt, der mit je 2 Rührblättern aus gestatteten Turbinenrührern von 12,7 cm Durchmesser versehen ist und 28 Liter eines Produktionsmediums der folgenden Zusammensetzung enthält:
Dextrose, technisch rein 30 g Sojabohnenölmehl mit Lösungsmitteln extrahiert 20 g Natriumnitrat 3 g Calciumcarbonat 5 g Baumwollsamenöl 2 cm3 Casein 2 g Wasser bis auf 1 Liter Die Fermentation wird bei 30 C 4 Tage unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 400'-450 Um drehungen pro Minute durchgeführt. Das Schäumen wird, falls erforderlich, durch Zugabe von Sojabohnenöl geregelt.
Während der ganzen Dauer der Fermentation wird das Medium durch Einführung von steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 30 Litern pro Minute belüftet. Am Ende der Fermentationadauer wird die gesamte Brühe mit 5 n Schwefelsäure auf etwa pH = 3,5 eingestellt, worauf etwa 3 % (Gewicht/Volu- men) eines handelsüblichen Filtrierhilfsmittels zugegeben werden. Nach dem Filtrieren liegen etwa 22 Liter fil trierte Fermentationsbrühe vor.
Die aus 4 Tank-Fermentationen vereinigten Fer- mentationsbrühen werden durch eine Säule mit 7,62 cm Durchmesser gegeben, die .etwa 2650 cm3 feuchtes IRC- 50-Harz in der Säureform enthält. Wenn die Fliessge schwindigkeit auf etwa 6 cm3 je Minute eingestellt wird, weist die aus der Säule herausfliessende Flüssigkeit; keine biologische Aktivität auf, was anzeigt, dass die Adsorp- tion des Antibioticums am Harz praktisch vollständig ist.
Wenn die gesamte Menge der filtrierten Fermen tationsbrühe, insgesamt etwa 88 Liter, durch die Säule gegeben worden sind, wird die Säule wiederholt mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser farblos ist.
Das Anthelvencin wird aus der Säule wie folgt isoliert: Die Säule wird ununterbrochen mit einem Ge misch aus 30 VolA Aceton und 70 Vol. % 0,5n wässriger Salzsäure so lange eluiert, wie das Eluat auf Ehrlichsches Reagenz positiv reagiert. Eine Gesamtmenge von etwa 10;4 Liter Eluat wird aufgefangen. Das Eluat wird mit <B>10</B> % iger wässriger Natriumhydroxydlösung auf etwa pH = 5,5 eingestellt und auf ein Volumen von etwa 8,5 Litern eingeengt.
Zu dem eingeengten Eluat werden unter Rühren 3 Volumina Aceton gegeben, und der pH-Wert des erhaltenen Gemisches wird weiter bis auf etwa 8,5 eingestellt. Das Gemisch wird durch eine Säule gegeben, die mit etwa 1750 cm3 feuchtem Florisil , mit einer Teilchengrösse entsprechend 0,149-0,250 mm lichter Siebmaschenweite gefüllt ist, um färbende und teerartige Substanzen zu entfernen. Die Säule wird dann mit 75 % igem wässrigem Aceton gewaschen, bis die Waschflüssigkeit gegenüber dem Ehrlich Reagenz negativ reagiert.
Das ursprüngliche Eluat und die Waschflüssig- keiten werden vereinigt und auf ein Volumen von etwa 9 Litern eingeengt, worauf 2250g Natriumchlorid zuge geben werden. Der sich bildende dunkle, teerartige Rückstand wird abfiltriert und das erhaltene Filtrat 3mal mit je 90 cm3 Benzylalkohol extrahiert. Das restliche Wasser wird aus den vereinigten Extrakten unter Vakuum entfernt und die erhaltene benzylalkoholische Lösung langsam unter raschem Rühren zu 9 Volumina Aceton gegeben.
Nachdem über Nacht bei etwa 3 C stehengelassen worden ist, wird die abgeschiedene Fest substanz abfiltriert, gründlich mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das auf diese Weise erhal tene Anthelvencinhydrochlorid kann der weiteren Reini gung unterworfen oder in ein anderes Salz umgewandelt werden, wie es in den folgenden Beispielen beschrieben wird.
<I>Beispiel 3</I> Herstellung von Anthelvencinr2-naphthalinsulfonat Zu einer Lösung von 1 g Anthelvencinhydrochlorid, nach Beispiel 2 hergestellt, werden 40 cm3 einer 5 % igen wässrigen Lösung von Natrium-2-naphthalinsulfonat ge geben. Das Gemisch wird zur Erzielung einer vollstän digen Auflösung erwärmt und sodann langsam abkühlen gelassen. Ein dunkles Öl, das sich abzuscheiden beginnt, wenn die Temperatur der Lösung etwa 20 C erreicht, wird durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Lösung gekühlt, um das Anthelvencin-2-naphthalinsulfo- nat zur Kristallisation zu bringen.
<I>Beispiel 4</I> Herstellung von Anthelvencinsalicylat Zu 30 cm3 einer 5%igen wässrigen Lösung von Natriumsalicylat werden 1 g Anthelvencinhydrochlorid, hergestellt nach Beispiel 2, gegeben. Das Gemisch wird etwa 10 Minuten auf einem Wasserdampfbad erhitzt und in heissem Zustand filtriert, um ungelöste Festsubstanzen zu entfernen.
Das klare Filtrat wird auf Raumtempe ratur abkühlen gelassen und die Kristallisation durch Kratzen der Seitenwände des Kolbens mit einem Glas stab eingeleitet. Beim ersten Anzeichen einer Kristalli- sation wird das Gemisch auf etwa 3 C abgekühlt, um eine vollständige Kristallisation zu ermöglichen. Das kristalline Anthelvencinsalicylat wird abfiltriert, 2mal auf dem Filter mit je 10 cm3 Eiswasser gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd bei Raumtempe ratur getrocknet.
Die Umkristallisation erfolgt aus einer 2 ö igen wässrigen Natriumsalicylatlösung.
<I>Beispiel 5</I> Herstellung von Anthelvencin A, das von Anthelvencin B frei isst Eine Chromatographiesäule, die einen Durchmesser von 3,17 cm und eine Länge von 43,2 cm aufweist, wird mit einem in der folgenden Weise vorbehandelten Cellulosepulver beschickt;
eine Suspension von 100 g Whatman-Cellulosepulver (CM 70) wird hergestellt und etwa 30 Minuten gut gerührt. Die Cellulose wird ab filtriert und sodann erneut nacheinander in 0,2 n Salz säure, Wasser und einem Lösungsmittelgemisch suspen diert, das aus n Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 15 :<B>10:</B> 1 :12 besteht.
Eine Lösung von 5 g Anthelvencinhydrochlorid, her gestellt nach Beispiel 2, in 40 cm3 des oben beschriebe nen Lösungsmittelsystems wird durch die Säule gegeben. Die Säule ist mit einem automatischen Fraktionssammler ausgestattet, der auf Zeitabstände von 30 Minuten ein gestellt ist.
Die Fliessgeschwindigkeit aus der Säule wird so eingestellt, dass innerhalb dieses Zeitintervalls etwa 5-7 om3 Eluat ausfliessen. Der Verlauf der chromatogra- phischen Fraktionierung wird durch Prüfung des Eluats in jedem 5. Rohr mit Hilfe einer Dünnschichtchromato- graphie auf Kieselsäuregel verfolgt.
Die beiden Anthel- vencine unterscheiden sich auf den Chromatographie- platten leicht infolge der Tatsache, dass sich die Salze des Anthelvencins A in diesem System rascher bewegen als die entsprechenden Salze des Anthelvencins B. Die Rf-Werte betragen in diesem System 0,5 bzw. 0,3. Die Fraktionen, die nach Bestimmung durch dieses Verfah ren lediglich Anthelvencin A enthalten, werden zusam mengefasst und zur Trockne eingedampft.
Das auf diese Weise erhaltene feste Anthelvencin-A-hydrochlorid kann weiter gereinigt oder nach dem Verfahren der Beispiele 4 und 5 in andere Salze des Anthelvencins A umge wandelt werden.
Die Fraktionen, die lediglich Anthelvencin B ent halten, werden ebenfalls zusammengefasst und in der gleichen Weise behandelt. Die Zwischenfraktionen, die sowohl Anthelvencin A als auch Anthelvencin B ent halten, können zur Erzielung einer weiteren Trennung einer weiteren Chromatographie unterworfen werden, um zusätzliche Mengen der reinen Einzelverbindungen zu erhalten.