Verfahren zur Herstellung von BCG-Vaccinen
Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von BCG-Vaccinen.
BCG (Bac. Calmette-Guerin) wird als Lebendvaccine zur Immunisierung gegen Tuberculose verwendet.
Die Vaccine wird aus BCG-Lebendkulturen, vorzugsweise durch Lyophilisierung, hergestellt.
Eine gute Vaccine soll einen möglichst hohen Gehalt an lebenden Zellen im Verhältnis zur Gesamtzahl der Keime aufweisen. Auch ist erforderlich, dass die Keime längere Zeit lebensfähig bleiben (Lagerungsfä- higkeit der Vaccine) und sich gut resuspendieren lassen. Die Erfüllung dieser Anforderungen bereitet grosse Schwierigkeiten, da BCG wenig temperaturbeständig, insbesondere auch empfindlich gegenüber den Bedingungen, wie sie bei der Gefriertrocknung und Lagerung der Vaccine auftreten, ist.
Um die Stabilität der lyophilisierten Vaccine zu erhöhen, werden der BCG-Suspension vor der Lyophili sierung verschiedene Schutzsubstanzen zugesetzt, deren Wirkungsweise aber noch nicht restlos abgeklärt ist. Nach Greaves (Ann. N. Y. Acad. Sci. 85 [1960], 723-28) suspendiert man das BCG-Sediment in einem aTrocknungsmedium , das ein Trägermaterial, z. B.
Dextran, zur Erzielung eines schwammigen Kuchens, eine Puffersubstanz zur Regulierung des Wassergehaltes der getrockneten Keime, z. B. Sucrose oder Natriumglutamat, und ein Neutralisierungsmittel für Carbonylgruppen, z. B. Natriumglutamat, enthält.
Auch die Einfriertemperatur, die Geschwindigkeit der Einfrierung und die Trocknungstemperatur haben einen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der lyophilisier- ten Zellen.
Es wurde auch vorgeschlagen (vgl. deutsche Patentschrift 1148 038), zwecks Erhöhung der Stabilität der lyophilisierten Vaccine BCG in einem Nährme- dium zu züchten, das keine carbonylgruppenhaltigen oder durch BCG in carbonylgruppenhaltige Verbindungen überführbare Substanzen enthält, insbesondere in einem Medium, das frei ist von Glycerin, Monosacchariden, Zuckeralkoholen und Polysacchariden. Das Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass BCG in den anzuwendenden Nährmedien weniger gut wächst und dass die Züchtung nicht in technischem Masstab in den bei der technischen Kultivierung von Mikroorganismen sonst üblichen Fermentern durchgeführt werden kann.
Es wurde nun gefunden, dass man auch unabhän- gig von der Art des Nährmediums die Stabilität von BCG im Hinblick auf Lyophilisierung und Lagerungsfähigkeit der Vaccine wesentlich verbessern kann und dass man daher auch Nährmedien verwenden kann, die sich für die Herstellung von BCG-Lebendkulturen in Fermentern besonders gut eignen.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine BCG-Kultur den Bedingungen der Herstellung und Lagerung der Vaccine unterwirft, die unter diesen Bedingungen am besten beständigen Einzell-Kulturen selektioniert, durch Züchtung vermehrt und danach zu Vaccine verarbeitet. Bei der Herstellung lyophilisierter BCG-Vaccine geht man beispielsweise so vor, dass man eine BCG-Kultur in bestimmter Weise lyophilisiert, längere Zeit, beispielsweise 1-6 Monate, bei einer eventuellen Lagerungstemperatur der Vaccine, z.
B. 30-40 C, oder beispielsweise 8 Tage bei maximal 50 C lagert, dann suspendiert, die Suspension auf einen festen Nährbo- den in solcher Konzentration aussät, dass die Kolonien getrennt wachsen, einzelne Einzell-Kolonien in flüssi- gem Nährmedium vermehrt, die so erhaltenen Einzell- Kulturen in gleicher Weise wie vorher lyophilisiert (ca.
10-20 Ampullen zu 1 mg/ml pro Einzell-Kultur), zur Feststellung der Oberlebensrate auf feste Nährböden aussät, die Einzell-Kulturen mit 80-100"/o Uberlebens- rate auswählt und als Ausgangsmaterial für die Hersteliung der Lebendkulturen verwendet.
Es hat sich gezeigt, dass ca. 10-100 Einzell-Kolonien zur Auslese von thermostabilen Einzell-Kulturen erforderlich sind. Einen erhaltenen thermostabilen Stamm mit guten immunisierenden Eigenschaften kann man solange für die Gewinnung von BCG-Kulturen bzw. Vaccinen verwenden, bis sich eine Verschlechterung der Eigenschaften bemerkbar macht.
Das Lyophilisieren der BCG-Kultur wird in einem geeigneten Trocknungsmedium , vorzugsweise einer wässrigen Lösung von Dextran, Glutamat und einem Zucker, z. B. Saccharose, oder einer natürlichen Hexose, wie Glukose, Laktose oder Fruktose, vorgenommen. Man verwendet etwa 1 g Bakterientrockengewicht pro Liter Trocknungsmedium . Als bestes Trocknungsmedium erwies sich eine Lösung von 5 /o Dextran, 5 /o Natriumglutamat und 5 /0 Saccharose in dest. Wasser, fast gleich gut ist eine Lösung von 5 /o Dextran, 2 ouzo Natriumglutamat und 5 /o Glukose in dest. Wasser.
In der folgenden Tabelle 1 ist die tXberle- bensrate (Verhältnis der Anzahl lebender Keime pro ml nach Lyophilisierung zur Anzahl lebender Keime pro ml vor der Lyophilisierung) in Prozenten, bezogen auf Medium 1 = 100 /0, angegeben.
Tabelle I
Trocknungsmedium /o relative Überlebensrate
1 100
2 92
3 58
4 1
5 15
6 0 1 = 5 /o Dextran, 5 /o Natriumglutamat, 5 /o Saccharose, aq. dest. ad 1000 mol 2 = 5 ouzo Dextran, 2 ouzo Natriumglutamat, 5 Glukose, aq. dest. ad 1000 ml 3 = 3 /o Dextran, 2 /o Natriumglutamat, 3 /o Laktose, aq. dest. ad 1000 ml 2"/o.
Glukose
2 /o Fruktose 4 = 3 /o Dextran, 3 /o Natriumglutarnat, 0 /o 5 = 0 /o 2 /o Natriumglutamat, 8 /o Saccharose, aq. dest. ad 1000 ml 5 ouzo Albumin Frakt. V 6 = 0"/o 0"/o 3"/o Glyzerin, aq. dest. ad 1000 ml 5 /o Albumin
Frakt. V
Die zu lyophilisierende Bakteriensuspension wird bei etwa-50 C möglichst schnell (Temperaturabfall 1 bis 3 pro Minute) tiefgefroren.
Die Trocknungstemperatur beträgt vorzugsweise-15 bis-20 C. (bei 0, 02 mm Hg). In diesem Temperaturbereich ist die Überlebensrate ca. lOOmal grösser als bei-30| C.
Das Lyophilisat wird bei 0,02 mm Hg über Silikagel nachgetrocknet. Der Endwassergehalt der getrockneten BCG beträgt 1 bis 2 /0.
Das getrocknete Bakteriengut wird unter den schärfsten Bedingungen, die für die Lagerung der Vaccine in Betracht kommen, beispielsweise bei einer Temperatur von 30-40 C, längere Zeit, beispielsweise 6 Monate, oder kürzere Zeit bei maximal 50 gelagert.
Um aus dem so erhaltenen Bakteriengut die lyophilisierungs-und lagerungsbeständigsten Mutanten auszulesen, resuspendiert man es, beispielsweise in einer 0,25 /oigen Losung von Bovin Albumin Fraction V (Herstellung Pentex Inc., Kankakee, Illinois), und sät es auf feste Nährböden, beispielsweise Löwenstein-Jen- sen-Agar, aus. Die Konzentration der zur Aussaat verwendeten Suspension wird so gewählt, dass die Kolonien getrennt wachsen. Die Platten werden wie üblich bei 37 C inkubiert.
Von den gewachsenen Einzell Kolonien überträgt man eine Anzahl (beispielsweise 10-20) getrennt in ein flüssiges Nährmedium in Schüt- telkolben und inkubiert bei 37 C, bis die Kulturen gut gewachsen sind (opt. Dichte bei 655 m, u, gemessen in einem photoelektrischen Kolorimeter, 0,5 bis 0,8, entsprechend einem Zelltrockengewicht von 0,25 bis 0,4 g pto Liter Kulturlösung).
Zur Gewinnung einer homogenen Kultur überimpft man dann in neue Schüttelkol- ben mit der gleichen Nährlösung (5 Volé Kultur pro neue Schüttelkultur) und lässt bis zu einem Zelltrokkengewicht von 0,5 bis 0,75 g pro Liter Kulturlösung (optische Dichte 1,0 bis 1,5) wachsen.
Dann zentrifugiert man ab, wäscht das Sediment, beispielsweise mit einer 0,015 feigen Lösung von Albumin Fraktion V, suspendiert die verschiedenen Einzell-Kultursedimente in dem vorher verwendeten Trocknungsmedium und sät je einen Teil der Suspension auf ein festes Nährme- dium (Löwenstein-Jensen-Agar) aus, während man einen anderen Teil unter den gleichen Bedingungen wie vorher lyophilisiert, resuspendiert und eine vergleichbare Menge der Suspension auf das feste Nährmedium aussät. Beim Inkubieren zeigt sich, dass die t) berlebens- rate der verschiedenen Einzell-Kulturen sehr verschieden ist (vgl. Tabelle 2).
Tabelle 2 Einzell-Kultur Nr. Anzahl Kolonien pro ml Anzahl Kolonien pro ml tJberlebensrate in"/e vor Lyophilisierung. nach Lyophilisierung 1 1, 03. 108 1, 04. 1OÇ 100 2 9,0.107 3, 24. 107 40 3 7,8.107 7, 0. 10µ 8 4 8,6.107 5,44.107 52 5 4,8.107 0 0 6 1,47.1Os 1,46.1Os 100 7 1,07. ils1, 06.108 99 8 1,03.108 0 0 9 1,16. ifs1, 50.106 Bei den Einzell-Kulturen mit grosser Überlebensrate handelt es sich um Kulturen, die aus einer genotypisch thermostabilen Mutante des BCG-Stammes hervorgegangen sind. Solche Kulturen ergeben bei der Züchtung in hohem Masse lyophilisierungs-und lagerungsbeständige Lebenskulturen, die zur Herstellung von lyophilisierten Vaccinen besonders geeignet sind.
Die selektionierten Kulturen zeigen im Tierversuch die volle immunisierende Wirkung im Vergleich zu nicht lyophilisierten, frischen Lebendkulturen.
Die selektionierten Kulturen können zur Züchtung von BCG nach den bekannten Methoden verwendet werden. Ein besonderer Vorteil ist, dass man sie auch bei der technischen Züchtung von BCG in Fermentem nach dem in der französischen Patentschrift 1419 643 beschriebenen Verfahren als Ausgangsmaterial einsetzen kann. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung in einem Fermenter unter Verwendung einer Nährlösung, die Glyzerin als Kohlenstoff-und Energiequelle sowie Netzmittel vom Tween-Typ, z. B. Tween 80, enthält, durchführt. Glyzerin wird in Konzentrationen von 20-100 g/Liter Nährlösung, das Netzmittel in solchen von 1-20 g/ Liter gebraucht.
Die übrigen Nährlösungsbestandteile, Stickstoffquellen, Salze, Spurenelemente, entsprechen den in der Literatur für die Züchtung von BCG angegebenen Medien. Das Verfahren zeichnet sich durch hohe Ausbeuten bei der Durchführung im technischen Masstab (50-oder 500-Liter-Fermenter) aus.
Im folgenden Beispiel wird die Erfindung beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel
Eine BCG-Kultur wird zentrifugiert, das erhaltene Sediment mit einer sterilen 0,05 feigen Lösung von Bovin Albumin Fraction V gewaschen und in einem Trocknungsmedium (1 g BCG-Trockengewicht pro Liter) suspendiert. Das Trocknungsmedium stellt man her, indem man 50 g Dextran, 50 g Natriumglutamat und 50 g Saccharose mit dest. Wasser auf 1 Liter auffüllt, auf 90 erhitzt bis zur vollständigen Lösung und nach dem Abkühlen auf ca. 30 seitzfiltriert. Die Suspension wird in Ampullen abgefüllt (Inhalt der Ampullen z.
B. 1 mg BCG-Trockengewicht), in einer Kühl- truhe mit Umlufteinrichtung mit einer Geschwindigkeit voit 1-3O/Min. auf-50 abgekühlt, dann in den Gefriertrockner gebracht und bei 0,02 mm Hg und-15 bis-20 getrocknet. In einem mit einer Diffusionspumpe evakuierten Exsikkator mit Silikagel wird das Lyophilisat bei 0,02 mm Hg nachgetrocknet und mit chemisch reinem, wasserfreiem Stickstoff begast.
Schliesslich schmilzt man die Ampullen zu. Nachdem man sie 6 Monate bei 37 gelagert hat, suspendiert man den Inhalt der Ampullen in einer 0,25 /Oigen Lösung von Albumin Fraktion V und giesst die Suspension auf Löwenstein-Jensen-Platten in Petrischalen aus, so dass pro Petrischale nicht mehr als 100 Kolonien wachsen. Die Platten werden wie üblich 4-6 Wochen bei 37 inkubiert. Neun der gebildeten Einzell-Kolonien impft man in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit je 100 ml Nährlösung ab.
Die Nährlösung hat folgende Zusammensetzung :
Glyzerin 50, 0 g
Tween 80 15,0 g
Natriumacetat 1, 0 g L-Asparagin 2,0 g
Bacto Casiton 1,0 g
Hefeextrakt Difco 3,0 g Kaliumphosphat, prim. 1,0 g
Natriumphosphat, sek., 12H2O 2,5 g
Ferriammoniumcitrat 10mg
Magnesiumsulfat, 7 H20 10 mg Caiciumchlorid, 6 HO 0,5 mg
Zinksulfat, 7 HO 0, 1 mg
Kupfersulfat, 5 H20 0,1 mg deioniertes Wasser ad 1000 ml Die Lösung wird 20 Minuten bei 120 und 1,2 atü autoklaviert.
Die 9 Erlenmeyerkolben werden auf einer rotierenden Schüttelmachine mit 120 Umdrehungen pro Minute bei 37 inkubiert, bis die optische Dichte bei 655 mut 0, 5 bis 0,8 beträgt. Dann iiberträgt man je 5 Vol.- /o der Kulturen in 9 neue Schüttelkolben mit der gleichen Nährlösung, lässt bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 1,0 bis 1,5 wachsen, zentrifugiert ab und wäscht das Sediment jeweils mit 0,05'/piger Albumin-Fraktion V-Lösung. Dann suspendiert man die Sedimente in dem oben genannten Trocknungs- medium . Je 0,5 ml der Suspension giesst man auf Löwenstein-Jensen-Platten aus,
der Rest wird ampul- lielt, tiefgefroren und lyophilisiert, wie oben beschrieben. Danach resuspendiert man das Lyophilisat in ad äquaten Mengen sterilem dest. Wasser und giesst je 0, 5 ml auf Löwenstein-Jensen-Platten aus. Die Platten werden bei 37 inkubiert. Nach 4-6 Wochen zählt man die Kolonien der Vergleichsplatten mit nicht 1YQ- philislerten und mit lyophilisierten Kulturen. Das Ver hältnis der letzten zu den ersten gibt die tJberlebens- rate, vgl. Tabelle 2.
Die Isolationen Nr. 1, 6 und 7 zeigen eine praktisch 100 O/oige Oberlebensrate. Sie werden als Aus gangsmaterial für die Züchtung von BCG in Fermen ter-bzw. Schüttelkolben verwendet.
Die Züchtung wird wie folgt durchgeführt :
Der Inhalt der Ampulle Nr. 1 wird auf Löwenstein- Jensen-Platten ausgesät, bei 37 inkubiert und die so erhaltene Kultur mit einer 0,25 /Oigen Lösung von Albumin Fraktion V aufgeschwemmt. Die Suspension wird zur Beimpfung von 500 ml-Erlenmeyerkolben mit je 100 ml der obigen Nährlösung verwendet. Die Impfmenge beträgt 1 Vol.- /o. Auf diese Weise stellt man auf einer rotierenden Schüttelmaschine 1, 5 Liter einer 9 Tage alten Kultur her, die eine optische Dichte von 0,4 bis 0,6 (bei 655 m, a) aufweist.
Mit diesen 1,5 Litern beimpft man einen 50-Liter-Fermenter (der in der Antibiotika-Produktion üblichen Bauweise) mit Luftverteiler, Rührer und Temperaturregulator, der 30 Liter der obigen Nährlösung enthält. Die Züchtung erfolgt bei 37 , bei einem Luftumsatz von 0,25 Vol. pro Vol. Nährlösung pro Minute und unter Rühren mit einem 6-blättrigen Turbinenrührer mit 50 Umdre hungen pro Minute. Nach 10 Tagen weist die Kulturlö- sung eine optische Dichte von 4,40 (bei 655 m, u), d. h. ein Zelltrockengewicht von ca. 2,2 g pro Liter Kulturlösung, auf.
Die Kulturlösung wird zentrifugiert, gewaschen und, wie oben beschrieben, zu Vaccinen verarbeitet.
Der Inhalt der Ampullen Nr. 6 und 7 wird zur Züchtung in 500-ml-Erlenmeyerkolben wie oben beschrieben verwendet. Die beiden so erhaltenen Lebendkulturen werden ebenfalls zu Vaccinen verar- beitet.
In der folgenden Tabelle 3 sind die Ergebnisse eines Vergleichs der erfindungsgemäss erhaltenen Vaccinen aus Isolationen Nr. 1 (Fermenter) und 6 und 7 (Schüttelkolben) mit Vaccinen, die ohne Selektion aus dem BCG-Ausgangsstamm erhalten werden, hinsichtlich Thermostabilität angegeben. Es wurden je 5 Ampullen mit 1 mg BCG-Trockengewicht eine Woche bei 50 gelagert. Vor und nach der Lagerung wird der Gehalt an lebensfähigen, Kolonien bildenden Zellein heiten (viable units) bestimmt. Die Zahlen sind Mittelwerte aus 5 Ampullen.
Tabelle 3 BCG-Stamm Anzahl Kolonien/mg BCG-Trockengewicht Dberlebensrate in /o vor der Lagerung nah der Lagerung Selektion Nr. 1 (Ferm.) 1,30.108 1,62. in 1, 25 Selektion Nr. 6 (Schüttelk.) 3,98.107 6, 92, 105 1,74 Selektion Nr. 7 (Schüttelk.) 5,94.107 7,5.105 1,26 Grundstamm 1,84.107 2,31.104 0, 13
In Tabelle 4 ist die immunisierende Wirkung der obigen Vaccinen im Vergleich zu derjenigen einer frischen BCG-Kultur angegeben. Als Versuchstiere dienten weisse Mäuse.
Der Inhalt der Ampullen mit 1 mg BCG-Trockengewicht wurde in 3 ml destilliertem Wasser, dem 3 aöo Tween 80 zugesetzt sind, aufgeschwemmt und die Suspension mit physiologischer Natriumchloridlösung bis zu einer Konzentration von 10 bzw. ly BCG/0, 1 ml weiterverdünnt. Je 20 Mäuse pro Versuchseinheit werden mit 1 ml einer Suspension, die 1y bzw. 10y BCG-Trockengewicht enthält, subku- tan geimpft. 4 Wochen nach der Impfung werden die Tiere intravenös mit einer letalen Dosis (0,4ml) mit 300 000 Zelleinheiten (viable units) des bovinen Tb-Stammes Ravenel geimpft. Es wird die mittlere Überlebenszeit festgestellt.
Nicht geimpfte Tiere sterben im Durchschnitt 20 Tage nach der Infektion.
Tabelle 4 Impfstoff Mittlere Überlebenszeit (je 20 Mäuse) ly BCG/Maus 10y BCG/Maus Selektion Nr. 1 24 Tage 43 Tage (Fermenter) Selektion Nr. 6 35 Tage 39 Tage (Schüttelk.) Selektion Nr. 7 26 Tage 36 Tage frische BCG-Kultur (ca. 20-3Qz BCG 39 Tage Trockengewicht)
Process for the production of BCG vaccines
The invention relates to an improved process for the production of BCG vaccines.
BCG (Bac. Calmette-Guerin) is used as a live vaccine for immunization against tuberculosis.
The vaccine is produced from live BCG cultures, preferably by lyophilization.
A good vaccine should have the highest possible content of living cells in relation to the total number of germs. It is also necessary that the germs remain viable for a longer period of time (the vaccine can be stored) and that they can be easily resuspended. The fulfillment of these requirements causes great difficulties, since BCG is not very temperature-resistant, in particular also sensitive to the conditions that occur during the freeze-drying and storage of the vaccine.
In order to increase the stability of the lyophilized vaccine, various protective substances are added to the BCG suspension prior to lyophilization, but their mode of action has not yet been fully clarified. According to Greaves (Ann. N. Y. Acad. Sci. 85 [1960], 723-28), the BCG sediment is suspended in a drying medium that contains a carrier material, e.g. B.
Dextran, to achieve a spongy cake, a buffer substance to regulate the water content of the dried germs, e.g. B. sucrose or sodium glutamate, and a neutralizing agent for carbonyl groups, e.g. B. sodium glutamate contains.
The freezing temperature, the rate of freezing and the drying temperature also have an influence on the viability of the lyophilized cells.
It has also been proposed (cf. German patent specification 1148 038) to cultivate BCG in a nutrient medium that does not contain any carbonyl-containing substances or substances which can be converted into carbonyl-containing compounds by BCG, in particular in a free medium, in order to increase the stability of the lyophilized vaccine of glycerine, monosaccharides, sugar alcohols and polysaccharides. However, the method has the disadvantage that BCG grows less well in the nutrient media to be used and that the cultivation cannot be carried out on an industrial scale in the fermenters otherwise customary in the industrial cultivation of microorganisms.
It has now been found that, regardless of the type of nutrient medium, the stability of BCG with regard to lyophilization and storage of the vaccine can be significantly improved and that nutrient media can therefore also be used which are suitable for the production of BCG live cultures in Fermenters are particularly suitable.
The method according to the invention is characterized in that a BCG culture is subjected to the conditions for the production and storage of the vaccines, which single-cell cultures which are most stable under these conditions are selected, propagated by cultivation and then processed to vaccines. In the production of lyophilized BCG vaccines, the procedure is, for example, that a BCG culture is lyophilized in a certain way, for a longer time, for example 1-6 months, at a possible storage temperature of the vaccine, e.g.
B. 30-40 C, or for example 8 days at a maximum of 50 C, then suspended, the suspension sows on a solid nutrient medium in such a concentration that the colonies grow separately, individual single-cell colonies are propagated in liquid nutrient medium, the single-cell cultures obtained in this way are lyophilized in the same way as before (approx.
10-20 ampoules at 1 mg / ml per single-cell culture), to determine the survival rate, sow on solid nutrient media, select the single-cell cultures with 80-100% survival rate and use them as starting material for the production of the live cultures.
It has been shown that approx. 10-100 single-cell colonies are required for the selection of thermostable single-cell cultures. A thermostable strain obtained with good immunizing properties can be used for the production of BCG cultures or vaccines until a deterioration in the properties becomes noticeable.
The lyophilization of the BCG culture is carried out in a suitable drying medium, preferably an aqueous solution of dextran, glutamate and a sugar, e.g. B. sucrose, or a natural hexose such as glucose, lactose or fructose, made. About 1 g of dry bacterial weight per liter of drying medium is used. A solution of 5 / o dextran, 5 / o sodium glutamate and 5 / o sucrose in distilled water proved to be the best drying medium. Water, a solution of 5 / o dextran, 2 ouzo sodium glutamate and 5 / o glucose in distilled water is almost equally good. Water.
The following table 1 shows the survival rate (ratio of the number of living germs per ml after lyophilization to the number of living germs per ml before lyophilization) as a percentage, based on medium 1 = 100/0.
Table I.
Drying medium / o relative survival rate
1 100
2 92
3 58
4 1
5 15
6 0 1 = 5 / o dextran, 5 / o sodium glutamate, 5 / o sucrose, aq. Dist. ad 1000 mol 2 = 5 ouzo dextran, 2 ouzo sodium glutamate, 5 glucose, aq. dist. ad 1000 ml 3 = 3 / o dextran, 2 / o sodium glutamate, 3 / o lactose, aq. dist. ad 1000 ml 2 "/ o.
Glucose
2 / o fructose 4 = 3 / o dextran, 3 / o sodium glutarnate, 0 / o 5 = 0 / o 2 / o sodium glutamate, 8 / o sucrose, aq. Dist. ad 1000 ml 5 ouzo albumin fraction. V 6 = 0 "/ o 0" / o 3 "/ o glycerine, aq. dist. ad 1000 ml 5 / o albumin
Frakt. V
The bacterial suspension to be lyophilized is frozen as quickly as possible at about -50 C (temperature drop 1 to 3 per minute).
The drying temperature is preferably -15 to -20 ° C. (at 0.02 mm Hg). In this temperature range the survival rate is about 100 times greater than at -30 | C.
The lyophilizate is then dried over silica gel at 0.02 mm Hg. The final water content of the dried BCG is 1 to 2/0.
The dried bacterial material is stored under the harshest conditions that come into consideration for storing the vaccine, for example at a temperature of 30-40 ° C., for a longer time, for example 6 months, or for a shorter time at a maximum of 50.
In order to select the mutants that are most resistant to lyophilization and storage from the bacterial material obtained in this way, it is resuspended, for example in a 0.25% solution of Bovine Albumin Fraction V (manufactured by Pentex Inc., Kankakee, Illinois) and sown on solid culture media, for example Löwenstein-Jensen agar. The concentration of the suspension used for sowing is chosen so that the colonies grow separately. The plates are incubated at 37 ° C. as usual.
A number (for example 10-20) of the grown single-cell colonies are transferred separately to a liquid nutrient medium in shake flasks and incubated at 37 ° C. until the cultures have grown well (optical density at 655 m, measured in a photoelectric Colorimeter, 0.5 to 0.8, corresponding to a dry cell weight of 0.25 to 0.4 g pto liter of culture solution).
To obtain a homogeneous culture, new shake flasks are then inoculated with the same nutrient solution (5 Volé culture per new shake culture) and left up to a cell dry weight of 0.5 to 0.75 g per liter of culture solution (optical density 1.0 to 1.5) grow.
It is then centrifuged off, the sediment is washed, for example with a 0.015 fig solution of albumin fraction V, the various single-cell culture sediments are suspended in the previously used drying medium and each part of the suspension is sown on a solid nutrient medium (Löwenstein-Jensen agar ), while another part is lyophilized under the same conditions as before, resuspended and a comparable amount of the suspension is sown on the solid nutrient medium. During incubation it was found that the t) survival rate of the various single-cell cultures is very different (cf. Table 2).
Table 2 Single-cell culture No. Number of colonies per ml Number of colonies per ml Survival rate in "/ e before lyophilization. After lyophilization 1 1, 03. 108 1, 04.1OÇ 100 2 9.0.107 3, 24. 107 40 3 7, 8,107 7, 0. 10µ 8 4 8.6.107 5.44.107 52 5 4.8.107 0 0 6 1.47.1Os 1.46.1Os 100 7 1.07. Ils1, 06.108 99 8 1.03.108 0 0 9 1.16 .ifs1, 50.106 The single-cell cultures with a high survival rate are cultures that have emerged from a genotypically thermostable mutant of the BCG strain. When cultivated, such cultures result in high levels of lyophilization and storage-resistant life cultures which are used to produce lyophilized vaccines are particularly suitable.
In animal experiments, the selected cultures show the full immunizing effect in comparison to non-lyophilized, fresh live cultures.
The selected cultures can be used to grow BCG by the known methods. A particular advantage is that they can also be used as starting material in the technical cultivation of BCG in fermenters according to the process described in French patent 1419 643. This method is characterized in that the cultivation is carried out in a fermenter using a nutrient solution containing glycerine as a carbon and energy source and wetting agents of the Tween type, e.g. B. Tween 80 contains, performs. Glycerine is used in concentrations of 20-100 g / liter nutrient solution, the wetting agent in concentrations of 1-20 g / liter.
The remaining nutrient solution components, nitrogen sources, salts, trace elements, correspond to the media specified in the literature for the cultivation of BCG. The process is characterized by high yields when carried out on an industrial scale (50 or 500 liter fermenter).
The invention is described in the following example. The temperatures are given in degrees Celsius.
example
A BCG culture is centrifuged, the sediment obtained is washed with a sterile 0.05 fig solution of Bovine Albumin Fraction V and suspended in a drying medium (1 g BCG dry weight per liter). The drying medium is produced by mixing 50 g of dextran, 50 g of sodium glutamate and 50 g of sucrose with dist. Water made up to 1 liter, heated to 90 ° until completely dissolved and after cooling to about 30 side filtered. The suspension is filled into ampoules (content of the ampoules e.g.
B. 1 mg BCG dry weight), in a freezer with a circulating air device at a speed of 1-3O / min. Chilled to -50 then placed in the freeze dryer and dried at 0.02mm Hg and -15 to-20. In a desiccator with silica gel evacuated with a diffusion pump, the lyophilizate is dried at 0.02 mm Hg and gassed with chemically pure, anhydrous nitrogen.
Finally, the ampoules are melted shut. After they have been stored at 37 for 6 months, the contents of the ampoules are suspended in a 0.25% solution of albumin fraction V and the suspension is poured onto Löwenstein-Jensen plates in Petri dishes, so that no more than 100 per dish is obtained Colonies grow. The plates are incubated at 37 for 4-6 weeks as usual. Nine of the single-cell colonies formed are inoculated in 500 ml Erlenmeyer flasks with 100 ml nutrient solution each.
The nutrient solution has the following composition:
Glycerin 50.0 g
Tween 80 15.0 g
Sodium acetate 1.0 g L-asparagine 2.0 g
Bacto Casiton 1.0 g
Yeast extract Difco 3.0 g potassium phosphate, prim. 1.0 g
Sodium phosphate, sec., 12H2O 2.5 g
Ferriammonium Citrate 10mg
Magnesium sulfate, 7 H2O 10 mg calcium chloride, 6 HO 0.5 mg
Zinc sulfate, 7 HO 0.1 mg
Copper sulfate, 5 H20 0.1 mg deionized water to 1000 ml The solution is autoclaved for 20 minutes at 120 and 1.2 atmospheres.
The 9 Erlenmeyer flasks are incubated on a rotating shaker at 120 revolutions per minute at 37 until the optical density at 655 mut is 0.5 to 0.8. Then 5 vol / o of the cultures are transferred to 9 new shake flasks with the same nutrient solution, allowed to grow until an optical density of 1.0 to 1.5 is reached, centrifuged and the sediment is washed with 0.05% each. / piger albumin fraction V solution. The sediments are then suspended in the above-mentioned drying medium. 0.5 ml of the suspension is poured onto Löwenstein-Jensen plates,
the rest is ampouled, deep-frozen and lyophilized as described above. The lyophilizate is then resuspended in adequate amounts of sterile distilled water. Water and pour 0.5 ml each onto Löwenstein-Jensen plates. The plates are incubated at 37. After 4-6 weeks, the colonies of the comparison plates with non-1YQ-philised and with lyophilised cultures are counted. The ratio of the last to the first gives the survival rate, cf. Table 2.
Isolation No. 1, 6 and 7 show a practically 100% survival rate. They are used as starting material for the cultivation of BCG in Fermen ter or. Shake flask used.
Breeding is carried out as follows:
The contents of ampoule no. 1 are sown on Löwenstein-Jensen plates, incubated at 37 and the culture obtained in this way is suspended with a 0.25% solution of albumin fraction V. The suspension is used to inoculate 500 ml Erlenmeyer flasks with 100 ml each of the above nutrient solution. The inoculation amount is 1 vol / o. In this way, 1.5 liters of a 9-day-old culture is produced on a rotating shaker, which has an optical density of 0.4 to 0.6 (at 655 m, a).
These 1.5 liters are used to inoculate a 50-liter fermenter (of the type commonly used in antibiotics production) with an air distributor, stirrer and temperature regulator, which contains 30 liters of the above nutrient solution. The cultivation takes place at 37, with an air turnover of 0.25 vol. Per vol. Nutrient solution per minute and with stirring with a 6-blade turbine stirrer at 50 revolutions per minute. After 10 days, the culture solution has an optical density of 4.40 (at 655 m, u), i. H. a dry cell weight of approx. 2.2 g per liter of culture solution.
The culture solution is centrifuged, washed and processed into vaccines as described above.
The contents of ampoules No. 6 and 7 are used for culturing in 500 ml Erlenmeyer flasks as described above. The two live cultures obtained in this way are also processed into vaccines.
Table 3 below shows the results of a comparison of the vaccines obtained according to the invention from isolations No. 1 (fermenter) and 6 and 7 (shake flasks) with vaccines obtained without selection from the BCG parent strain, with regard to thermal stability. 5 ampoules with 1 mg BCG dry weight were stored at 50 for one week. Before and after storage, the content of viable, colony-forming cell units (viable units) is determined. The numbers are mean values from 5 ampoules.
Table 3 BCG strain number of colonies / mg BCG dry weight D survival rate in / o before storage close to storage selection no. 1 (Ferm.) 1.30.108 1.62. in 1, 25 Selection No. 6 (Schüttelk.) 3.98,107 6, 92, 105 1.74 Selection No. 7 (Schüttelk.) 5.94.107 7.5.105 1.26 Basic line 1.84.107 2.31.104 0.13
Table 4 shows the immunizing effect of the above vaccines in comparison with that of a fresh BCG culture. White mice were used as test animals.
The contents of the ampoules with 1 mg BCG dry weight were suspended in 3 ml of distilled water to which 3 aöo Tween 80 were added and the suspension was further diluted with physiological sodium chloride solution to a concentration of 10 or 1 l BCG / 0.1 ml. 20 mice per experimental unit are inoculated subcutaneously with 1 ml of a suspension containing 1 μg or 10 μg dry weight BCG. 4 weeks after the vaccination, the animals are vaccinated intravenously with a lethal dose (0.4 ml) containing 300,000 cell units (viable units) of the bovine Tb strain Ravenel. The mean survival time is determined.
Unvaccinated animals die on average 20 days after infection.
Table 4 Vaccine mean survival time (20 mice each) ly BCG / mouse 10y BCG / mouse selection no. 1 24 days 43 days (fermenter) selection no. 6 35 days 39 days (shaker) selection no. 7 26 days 36 days fresh BCG culture (approx. 20-3Qz BCG 39 days dry weight)