CH485021A - Verfahren zur Herstellung eines Viruspräparates und so erhaltenes Präparat - Google Patents

Description

  



  Verfahren zur Herstellung eines Viruspräparates und so erhaltenes Präparat
Durch Viren verursachte Hepatitis, auch als akute infektiöse Hepatitis, katarrhalische Gelbsucht oder Serum-Hepatitis bekannt, ist eine Krankheit, die durch eine Invasion der Leber durch filtrierbare IH und SH Viren verursacht wird. Der IH Virus (auch als Virus A bekannt) verursacht   epidemische Hepatitis  . Er wird gewöhnlich im Stuhl und Blut der infizierten Individuen gefunden und wird auf Andere durch direkten Kontakt wie auch durch verunreinigte Träger, wie Lebensmittel, Wasser oder Blut, Serum und Blutplasma oder durch verunreinigte medizinische Instrumente übertragen.



          Serum Hepatitis  , verursacht durch den Virus SH (auch als Virus B bekannt) ist klinisch ähnlich mit der durch den Virus IH verursachten Hepatitis, mit Ausnahme, dass nach Ansicht verschiedener Autoren der Virus prinzipiell nur in Kreislaufflüssigkeit gefunden wird und nicht im Stuhl.



   Charakteristische Beweise für SH Viren können im Blut, Serum und Plasma von befallenen Individuen Monate, manchmal sogar Jahre nachdem das akute Stadium der Infektion abgeklungen ist, gefunden werden.



   Der Virus SH wird von einem Individuum zum anderen wahrend Blut-oder Plasmatransfusion oder Serumokulation übertragen. Es ist auch möglich, dass er übertragen wird durch Verletzung der Haut oder Adern mit Instrumenten, die mit   Trägerblut    verunreinigt sind.



  Da die Übertragung in diesen Fällen durch Infektion des menschlichen Serums erfolgt, wird die Krankheit häufig auch als   homologe Serum-Gelbsucht   oder   homologe   Serum-Hepatitis      klassifiziert. Verschiedene Autoren sind der Meinung, dass Virus A und Virus B kaum verschiedene Typen der gleichen Virusart darstellen oder sogar identisch sind. Die Bezeichnungen   epidemische Hepatitis  ,   infektöse Hepatitis   und durch Viren verursachte Hepatitis werden oft vertauschbar angewandt, um eine Vireninvasion der Leber, die einen pathologischen Zustand verursacht zu beschreiben. Die Bezeichnungen werden in dieser Weise zur Definition dieser Erfindung angewandt.



   In den vergangenen Jahren hat durch Viren verursachte Hepatitis solche   weltweiten,    epidemischen Ausmasse angenommen, dass die Aussichten der   Eindäm-    mung dieser Krankheit nicht gut sind. Kalk   (Helvetica    Medica Acta 1961,4) stellt fest, dass die Krankheit die menschliche Bevölkerung in Epidemie-wellen, die gewissen charakteristischen Gesetzen folgen, angegriffen hat, welche auf der Vervielfachung und Virulenz des verursachenden Agens, dem Grad der Verbreitung der Krankheit in einer Bevölkerung und der folgenden Anderung ihrer   Immunität    basieren. Europa zum Beispiel war in der Zeit von   1939-1950    von einer besonders ernsten Epidemie heimgesucht. Henneberg (Bundesgesundheitsblatt No.   1,    12.

   Januar   1962)    stellt fest, dass allein in   Westdeutschland    jährlich ungefähr 120 000 neue Fälle von   viröser    Hepatitis auftreten.



   Das Problem der Kontrolle der epidemischen Hepatitis wird nicht nur wegen   der grossen Zahl    von jährlich neuen, durchwegs in der   zivilisierten    Welt auftretenden Fällen ernster, sondern auch darum, weil ungefähr   10 ouzo    aller   Fille    nicht vollständig ausheilen. Ungefähr 5   zozo    werden chronisch und ungefähr 2     0 zirrhös,    daher nimmt die Zahl der Leberpatienten von Jahr zu Jahr zu.



   Es ist daher leicht einzusehen, dass ein akutes Bedürfnis für eine einfache Diagnose-methode besteht, welche die schnelle Bestimmung der Krankheit vor dem Auftreten der klinisch beobachtbaren Symptome erleichtert, speziell vor der   Praeicterus-phase.    Schnelle Diagnose in Fällen, wo Ausbreitung von Hepatitis auf einen   grossen    Teil der Bevölkerung oder eine grosse Institution wie ein Hospital zu befürchten ist,   ist besonders wün-    schenswert. Ferner ist eine schnelle Bestimmung unerlässlich in Fällen von beabsichtigter Bluttransfusion, wobei aber nicht mit absoluter Sicherheit bekannt ist, ob der Spender frei von aktiver Form von Hepatitis oder vielleicht Träger der latenten Form ist.



   Die gegenwärtig bekannten Bestimmungsmethoden für viröse Hepatitis sind mühsam und zeitraubend. Eine dieser Methoden hat zum Beispiel den Neutralisationseffekt des Immunserums zum Inhalt. Es ist bekannt, dass Blut von Individuen, die von viröser Hepatitis genasen, Antikörper enthält, die spezifisch gegen Hepatitis-virus sind. Darum zeigen, wenn Blutserum eines Testindividuums zu   Embryozellen    eines nichtinfizierten Individuums gefügt wird, die Gewebekultur mit Hepatitisviren geimpft und die geimpfte Kultur während einer Zeit von 9-14 Tagen bei   35  bis 40 CC gezüchtet    wird, die einschichtig gebildeten Zellen keinen   cytopathogenen    Effekt.

   Abwesenheit von   Cvtopathogenesis    zeigt, dass das Blut des   Testindividuums Antikörper enthält.    Diese und andere gleich gut bekannte Techniken sind abhängig von der Züchtung menschlicher Gewebe oder von menschlichen Embryozellen für die Züchtung des Hepatitisvirus.



   Es wurde nun gefunden, dass menschlicher Hepati  tisvirus    auf Gewebekulturen von trypsinbehandelter tierischer Niere oder an einer permanenten, aus tierischer Niere gezüchteten Zellreihe erfolgreich kultiviert werden kann und aus dem Lipoidanteil des so vermehrten Virus ein hochwirksames, diagnostisches   Antigen für viröse    Hepatitis erhalten werden kann.



   Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines menschliches Hepatitisvirus enthaltenden Materials, das sich dadurch auszeichnet, dass man das Virus in einer Gewebekultur von tierischen Nierenzellen züchtet.



   Ferner betrifft die Erfindung ein nach dem erfin  dungsgemässen    Verfahren hergestelltes menschliches Hepatitisvirus enthaltendes Material.



   Wie bereits erwähnt, kann das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Material als Ausgangsmaterial bei der Herstellung eines Präparates zur Diagnose   viröser    Hepatitis dienen, insbesondere desjenigen Präparates, das in der Schweizer Patentschrift Nr.



  479 288. beschrieben wird.



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des menschliches Hepatitisvirus enthaltenden Materials wird mit Vorteil so durchgeführt, dass man tierische Nierengewebe-zellen mit menschlichem Hepatitisvirus impft, die geimpften Zellen mit   Nährflüssigkeit,    die geeignet ist, das Wachstum der tierischen   Nierengewebe-    zellen zu unterstützen, versorgt und die geimpfte Kultur bebrütet.



   Eine spezielle Ausführungsart des   erfindungsgemäs-    sen Verfahrens wird anhand der folgenden Arbeitsmethode veranschaulicht : Schweine werden geschlachtet, die Nieren unter aseptischen Bedingungen entfernt und mit einer Phosphatpuffer-salzlösung (Hank's Lösung oder ein gleichartiges Medium) gespült, in Stücke von   ungefähr 2-3    mm Kantenlänge geschnitten und drei oder viermal in einer der oben angegebenen Lösungen gewaschen. Eine 0,25"/oigne gepufferte   Trypsinlösung,    pH Wert 7,5,   lässt    man unter Rühren bei   37c mit    den Gewebestücken reagieren.

   Ungefähr 20 oder 30 ccm   Trypsinlösung    sind erforderlich für schätzungsweise 50 g   Nierenstücke.    Nach ungefähr 20 Minuten wird der Prozess unterbrochen, die Zellen enthaltende Flüssigkeit entfernt und verworfen. Das Reaktionsgefäss wird erneut mit dem gleichen Volumen   Trvpsinlösung    beschickt. Der Prozess wird sechsmal, alle 10 Minuten, wiederholt, alle weiteren, dabei erhaltenen   Zellsuspensionen    werden in einem   Gefäss    gesammelt und mit Eiswasser gekühlt. Die Suspension wird zentrifugiert, während 10 Minuten bei 1000 Touren pro Minute (180fache Schwerkraft). Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt, das Sediment bei 37  C mit   Phosphatpuffer-salzlösung gewaschen    und zusätzlich dreimal zentrifugiert.

   Irgendwelche   vorhande-    nen Erythrozyten werden so gut als möglich abgesaugt.



  Ein Aliquot der Zellsuspension wird während etwa 10 Minuten bei ungefähr 100 bis 150facher Schwerkraft sedimentiert und das Sediment zu genügend   präparier-    tem Nährmedium hinzugefügt, um eine   Zellenzahl    von ungefähr 100 000 bis 250 000   Zellen ! cc sicherzustellen.   



  Das verwendete Nährmedium kann das     Medium 199      sein, entsprechend Morgan, Morten und Parker (Proc.



  Soc. Exp. Biol. and Med. 73,1,1950) mit   10"/o    Kälberserum, Penicillin und   Streptomycin    in den üblichen Proportionen. Bovin-Amnion Flüssigkeit mit   10  /o    Kälberserum als auch Penicillin und   Streptomycin    oder andere   Kutturflüssigkeiten    können ebenso als Nährmedien benützt werden. Von dieser Zellsuspension werden Kulturen in Proberöhrchen oder Flaschen durch   Einfül-    len von   2 cc    pro Proberöhrchen   (1,      6 x 16    cm) oder 15 cc pro Flasche (4,5 x 4,5 x 12 cm) hergestellt. Die Kulturgefässe werden bei   37 CC bebrütet.    Das Medium wird alle 3 oder 4 Tage durch frisches Kulturmedium ersetzt.

   Nach 7 bis 9 Tagen Bebrütung wird der Serumgehalt auf etwa 3  /o reduziert, die Kulturbehälter enthalten eine   einschichtige    Lage von Epithelzellen und sind bereit für die Impfung mit dem Virenmaterial.



   Die Impfung der Gewebekulturen mit lebendem Hepatitisvirus zum Gebrauch entsprechend der Erfindung kann mit wässrigen Fäzessuspensionen, Blut, Blutserum, Blutplasma oder Suspensionen von zerkleinerten Organen von mit   viröser    Hepatitis infizierten Personen ausgeführt werden. Kulturflüssigkeiten von Gewebekulturen des Virus sind ebenfalls geeignet. Zum Zweck der Impfung wird das Nährmedium dekantiert und jedes Proberöhrchen oder Flasche mit Virusmaterial geimpft.



  Nach 1-4 Stunden wird frisches Nährmedium zugefügt, die Ansteckungslösung entweder im   Kulturgefäss    belassen oder entfernt, bevor das Nährmedium zugefügt wird.



  Das Nährmedium wird jede Woche 2 bis 3 mal   gewech-    selt. Um maximale Zell-oder Virusmultiplikation zu erhalten, wird das Kulturmedium schätzungsweise bei neutralem pH gehalten. Die geimpften Gewebekulturen werden weiter bebrütet in einem Temperaturbereich von   34'bis 42'C,    bis ein cytopathogener Effekt beobachtet wird. Am Ende der   Brutperiode    werden die flüssigen Kultursubstrate von den Gewebekulturzellen getrennt.



  Die Zellen werden mit einer 0,25     ! oigen Lösung    von Trypsin in mit Phosphat gepufferter Salzlösung bei 37  C von den Wänden des Kulturgefässes durch   häufi-    ges Schütteln getrennt und für weitere 3 bis 20 Stunden bei 37  C der Einwirkung von Trypsinlösung ausgesetzt, oder mechanisch gemahlen mit einer Zellmühle. Jeglicher Virus, der noch in den Zellen gebunden war, wird dadurch frei.



   Das in dieser Weise behandelte Zellsubstrat wird von grösseren, ungelösten Partikeln durch Zentrifugieren bei geringer Tourenzahl gereinigt. Die Virus kann aus der überschüssigen Flüssigkeit und Nährlösung bei hoher Tourenzahl herauszentrifugiert werden, dazu ist im Allgemeinen zentrifugieren bei 26 000 bis 30 000-facher Schwerkraft während 60 bis 120 Minuten geeignet.



   Selbstverständlich kann der oben beschriebene Prozess auch vorteilhaft mit Gewebekulturen von Nieren anderer Tiere ausgeführt werden. Schweinenieren oder eine permanente Zellreihe, hergestellt aus Schweinenieren, werden bevorzugt für diesen Zweck, obgleich   Kaninchennieren,    Meerschweinchennieren etc. mit gleich befriedigenden Resultaten angewandt werden können, wie weiter unten   exemplifiziert    werden wird. Zusätzlich sind He-La   Zellgewebekulturen geeignet    und vorteilhaft für die Züchtung des Hepatitisvirus.



   Es ist daher klar, dass entweder aus Kaninchen-oder Meerschweinchennierenzellen oder auch aus He-La Zellen hergestellte Gewebekulturen geeignete Substrate für die Züchtung des Hepatitisvirus darstellen. Bei elektronenmikroskopischer Prüfung des gesamten experimentellen Materials werden Elementarkörper gefunden, welche gleiches Aussehen und Grosse zeigen wie solche, die beobachtet werden in   Fäkalproben    von Hepatitispatienten, in geimpften, bebrüteten   Hünereiern    und in geimpften, aus Schweinenierenzellen hergestellten Gewebekulturen.

   Bezüglich Temperaturvariationen zur Kultivierung von   Schweinenieren-gewebekulturen    kann   Bebrü-    tung bei   34  C über    eine längere Zeitperiode mit einigen Einschränkungen ausgefuhrt werden, während 40  C für alle Zwecke mit   37  C gleichwertig    zu setzen ist.



  Gewebekulturen von Schweinenieren können über 32 Tage lang befriedigend bei   34  gehalten    werden. Die Zellkultur, an der der Hepatitisvirus gezüchtet wird, wird vorteilhaft von einem Tier, von dem bekannt ist, dass es nicht von menschlicher Hepatitis befallen wird, hergestellt. Diese Massnahme ist nötig, um die   Möglich-    keit auszuschliessen, dass in dem kultivierten   Zellgewebe    latente Hepatitisviren enthalten sind und um die Gegenwart von Antikörpern zu vermeiden, welche mit den Hepatitisviren Kreuzreaktionen geben und deren Wachstum verhindern würden.



   Die Schweineniere ist die bevorzugte Quelle für Zellen zur Kultivierung. Ebenfalls bevorzugt wird noch die Anwendung einer permanenten Zellreihe, hergestellt aus primären Nierenzellen. Die Ausführung einer permanenten Zellreihe mit ungefähr 30 bis 35 Passagen von Subkulturen, ausgehend von der primären Schweinenieren-Zellkultur, liefert Zellen, bei welchen eine mögliche latente Infektion der Schweinenieren nicht mehr   berück-    sichtigt zu werden braucht und es wurde festgestellt, dass der cytopathologische Effekt ungefähr drei Tage nach der Impfung mit dem Virenmaterial beobachtet werden kann, also eher als in zehn bis dreizehn Tagen, die zum Abbau der primären Schweinenieren-Zellkultur benötigt werden.



   Die Erfindung sei anhand der folgenden Beispiele näher erläutert :
Beispiel I    Schweinenieren-Gewebekultur   
Eine Niere von einem etwa 40 kg schweren Schwein wird unter sterilen Bedingungen entfernt. Die Niere wird in phosphat-gepufferte Salzlösung (ppS) verbracht, die 200 I. E. Penicillin und 100 gamma Streptomycin enthält. Die Lösung wird bei   37  C gehalten.    Die ppS wird wie folgt hergestellt : (a) NaCl 8,0 g    KCl    0,2 g    MgCI9 (6H 0, 1 g   
Wasser bis zu 400 ccm (b)   Na > HPO4    1,5 g    KH2PO,    0,2 g
Wasser bis zu   400    ccm (c)   CaCl    0,1 g
Wasser 200 ccm
Die Niere wird in Stücke von 2 bis 3   mm2 Yeschnit-    ten.

   Die Nierenstücke werden viermal mit ppS Lösung bei 37  C gewaschen.   Die gewaschenen Nierenstücke    werden in einen 200 ccm Erlenmeyerkolben gebracht.



  25 cc 0,25  /oige Trypsinlösung werden zu   50 g    Nierenstücken im Kolben gegeben und der Kolben in ein Wasserbad von   37 =C gebracht.    Der Inhalt des Kolbens wird 20 Minuten mit einem Magnetrührer gerührt. Ein Teil der   Trypsiniösung    wird dekantiert und verworfen.



  Frische   Trypsinlösung    wird nachgefüllt, bis das ur  sprüngliche    Volumen wieder erreicht ist. Sechsmal wird in zehnminutigen Intervallen die   Trypsinlösung    in einen Kolben dekantiert und durch frische Trypsinlösung ersetzt. Die gesammelten Fraktionen werden in einem Eisbad aufbewahrt.



   Die   Trypsinlösuno    wird zehn Minuten bei 1000 Touren/Minute   (180fache    Schwerkraft) zentrifugiert, um die Zellen zu sedimentieren. Das   Oberstehende    wird dekantiert und die Zellen dreimal mit ppS bei   37 : C    gewaschen. An den sedimentierten Zellen vorhandene Erythrocyten werden abgetrennt.



   Die Zellen werden zu genügend Gewebekulturmedium gefügt, um eine vorgesehene Dichte von 1,25 x   105      Zellen/cc    zu erreichen. Fünfzehn Milliliter-Portionen dieser Zellsuspension werden in Flaschen mit den Dimensionen 4,5   x 4,    5 x 12 cm gefüllt. Um die Zellen zu suspendieren, wird ein Medium von der folgenden Zusammensetzung verwendet : Wasser (ionenfrei) 800 cc Medium 199 (10 x konzentriert) 100 cc 2,8  lo Natriumbicarbonatlösung 50 cc 1  /oige   Streptomycinlösung      11,    3 cc   1, 33 eloige Penicillinlösung 11, 3 cc    Kälberserum   11,    3 cc
Phenolrot wird als Indikator dem Flascheninhalt zugefügt. Die Flaschen werden fünf Tage bei   37  C    bebrütet.

   Das Kulturmedium wird dekantiert, durch frisches ersetzt und die Flaschen erneut bei 37  C bebrütet. Am Ende einer weiteren dreitägigen Periode wird das Kulturmedium wieder dekantiert und durch frisches Medium ersetzt und die Flaschen wieder bei 37  C drei Tage lang bebrütet. Das Kulturmedium wird wieder dekantiert und eine Monoschicht von Epithelzellen wird in den Flaschen beobachtet.



      Beispiel 11   
Permanente   Schweineniereiz-Zellreihe   
Flaschen mit neun Tage alten primären Schweinenieren-Kulturen, nach dem Verfahren von Beispiel I erhalten, werden mit Calcium-und   Magnesiumfreier    Moscanalösung bei 37  C gewaschen. Die Moscanalösung wird auf folgende Weise hergestellt :   NaCI    8,00 g   KCI    0,20 g   NaH3PO4      P04-HO 0, 005    g   NaHCO3 1 !    00 g Glucose   2*00 g    Wasser (ionenfrei) bis zu 1000 cc
Die   Moscanalösung    wird durch Filtration durch ein Seitz-Filter sterilisiert.



   Je 10 cc 0,25   0/oioe      Trypsinlösung    wird jeder Flasche zugefügt und 20 Minuten bei   37  C bebrütet.    Die mit Trypsin versetzte Zellsuspension wird fünf Minuten bei 150facher Schwerkraft zentrifugiert und die überstehende Trypsinlösung verworfen. Die sedimentierten Zellen werden durch dreimaliges Zentrifugieren mit Moscanalösung gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden zu Difco Medium 199 gefügt, welches 20    /o Kälberserum    enthält und während 30 Minuten bei 56  C inaktiviert wurde. Die Kultur in jeder   Ausgangsflasche    wird für das Wachstum von Subkulturen auf drei Flaschen aufgeteilt.



  Das Kulturmedium hat die folgende Zusammensetzung : Wasser (ionenfrei) 800 cc Medium 199 (10 x konzentriert) 100 cc 2,8  /o Natriumbicarbonatlösung 50 cc   l''/c Streptomycinlösung    12,8 cc 1,33   zozo    Penicillinlösung 12,8 cc Kälberserum   256    cc
15 cc Kulturmedium werden jeder Flasche zugefügt und die Flaschen in stillstehender Lage bei 37  C bebrütet. Alle drei Tage wird das Kulturmedium dekantiert und frisches Medium hinzugefügt. Nach neun Tagen wird durch Transferieren eines Teils der Zellen in eine frische Flasche eine Subkultur bereitet und 15 cc frisches Kulturmedium zugefügt. Die Subkultur wird wachsen gelassen mittels der gleichen Behandlung wie oben beschrieben. Im Ganzen werden   fünfunddreissig    Passagen von Subkulturen hergestellt.   



   Beispiel 111
Virenwachstum an SchHeinenieren-zellen   
Eine Flasche mit primären Schweinenieren-zellen, hergestellt entsprechend Beispiel   I,    wird mit 2 cc Impfstoff geimpft. Der Impfstoff wird hergestellt wie folgt : 3   FäzesrinGFe (3 mm)    eines Patienten, der an   viröser    Hepatitis leidet, werden in 10 cc   Brunnenwasser    gerührt.



  Die Suspension wird 20 Minuten bei 2000facher Schwerkraft zentrifugiert, um sie von groben Partikeln zu befreien und durch ein Schott Frittenfilter No. G5 filtriert. Nach Kontakt während zwei Stunden bei   37  C    mit der Zellkultur werden 13.0 cc frisches Kulturmedium der Flasche zugefügt. Der   Serumgehalt    des Mediums beträgt 3    ,      c.    Die Flasche wird bei   37 CC bebrütet    und das Medium jede Woche dreimal durch frisches Medium ersetzt.   \N'ährend    des Virenwachstums wird das Medium bei annähernd neutralem   p    gehalten. Während des Kulturprozesses werden die Zellen auf   cytopathoge-    nen Effekt beobachtet.

   Bei Beobachtung eines cytopathogenen Effekts wird das Nährsubstrat von den Gewebezellen abgetrennt und die Gewebezellen werden während 20 Stunden mit einer   Trypsinlösung    bei 37   OC    verdaut.



  Die Suspension wird 20 Minuten bei 2000facher Schwerkraft zentrifugiert. Das Überstehende wird   abge-    trennt und zentrifugiert bei 27 OOOfacher Schwerkraft.



  Das Sediment dieser Zentrifugierung wird in sterilem Wasser suspendiert und mit dem Elektronenmikroskop auf die Gegenwart von Hepatitisviren untersucht.



   Beispiel I V    Iiruswachstum an Schweinenieren-ellen    von   permantentew-ZellreShe   
Eine Flasche mit Schweinenieren-zellen. hergestellt entsprechend Beispiel   11.    wird geimpft mit 2 ccm des Impfstoffs, bestehend aus gesammeltem Hepatitisserum. hergestellt aus den Sera von vier an Hepatitis leidenden Patienten. Nach Kontakt mit der Zellkultur während 2 Stunden bei   31/OC    werden   13.    0 ccm frisches Kulturmedium, das 3        o Kälberserum enthält. der Flasche   zuge-    fügt. Die Flasche wird bei 37  C in stillstehender Position bebrütet. Ein   cytopathogener    Effekt wird nach zehn Tagen beobachtet.

   Das Verfahren wird für   fünf-    zehn Passagen wiederholt und der cytopathogene Effekt wird endlich nach drei Tagen beobachtet. Das   Nährme-    dium und die Gewebekultur-zellen werden aufgearbeitet wie in Beispiel III.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH I Verfahren zur Herstellung eines menschliches Hepatitisvirus enthaltenden Materials, dadurch gekennzeichnet, dass man das Virus in einer Gewebekultur von tierischen Nierenzellen züchtet.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man tierische Nierengewebe-zellen mit menschlichem Hepatitisvirus impft, die geimpften Zellen mit Nährflüssigkeit. die geeignet ist. das Wachs- tum der tierischen Nierengewebezellen zu unterstützen, versorgt und die geimpfte Kultur bebrütet 2. Verfahren gemäss Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die geimpfte Kultur bei einer Temperatur von 34c¯42 cc bebrütet wird. bis ein cytopathogener Effekt beobachtet wird.

   3. Verfahren gemäss Unteranspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, dass man als tierische Nieren gewebe-zellen Schweinenieren-zellen verwendet.

   4. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man Schweinenieren-zellen mit menschlichem Hepatitisvirus impft, die geimpften Zellen mit dem Wachstum der Schweinenieren-zellen unterstützender Narfliissigkeit versorgt, die Kultur bebrütet. den Virus abtrennt und inaktiviert, ohne seine Antigeneigen- schaften zu zerstören, und reinigt.

   5. Verfahren nach Unteranspruch 4, dadurch ile- kennzeichnet. dass die geimpfte Kultur bei einer Temperatur von 34'-42 =C bebrütet wird. bis ein cytopathogener Effekt beobachtet werden kann. der Virus aus der Kultur isoliert wird, mit Formaldehvd in einer Konzen tration von 1 : 2000 bis 1 : 6000 und bei einer Temperatur von 34 -41 C durch Kontakt während ungefähr 7-15 Tagen behandelt wird und der behandelte Virus vom Formaldehyd befreit wird.

   PATENTANSPRUCH II Nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch I hergestelltes, menschliches Hepatitisvirus enthaltendes Material.