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Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern infektiöser Hepatitis
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Zellen können verschiedene Organe, z. B. Testikel, Ovarien, Lunge, Leber, Milz, Niere, die Haut, die
Eingeweide oder der ganze embryonale Körper verwendet werden. Ein besonderes Beispiel ist ein aus Te- stikelgewebe erhaltener Zellstamm, die sogenannten PD39T-Zellen,'deren Isolierung und Kultivierung im folgenden genauer beschrieben wird.
Verfahren zur Isolierung und Kultivierung :
Testikel, die bei einer Autopsie von einem elf Tage alten Individuum erhalten waren, wurden in eine
Hank'sche Lösung für 2-4 h eingelegt, in Stücke von ungefähr 1 bis 3 mm3 geschnitten und Wälzröhrchen nach der Plasmagerinnungsmethode vorbereitet. Jedes Röhrchen enthielt etwa 8-10 Explantationen mit
2 ml eines Mediums, welches aus 75% Hank'scher Lösung, 20% flüssigem menschlichem Serum und 5% Hühnerembryonenextrakt bestand. Die Medien wurden zwei-bis dreimal pro Woche durch Entfernung der Hälfte des ursprünglichen Mediums aus jedem Röhrchen und Ersetzung mit einem gleichen Volumen an frischem Medium gewechselt. Die Ernte aus den ursprünglichen Explantationen bestand hauptsächlich aus Spindelzellen, die nach 4-8 Inkubationstagen rasch zunahmen.
Übertragung der Kultur :
Nach 13 Tagen wurde das Medium von den Kulturen entfernt, die Zellen mit 2 ml Hank'scher Lösung gewaschen und etwa 2, 5 ml einer 0, 2eigen Trypsinlösung bei einem PH-Wert von 7, 4 und einer Tem- peratur von 370C zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Röhrchen wurden bei 37 C während etwa 45-60 min gedreht und der Inhalt der Röhrchen gesammelt und in einem Eisbad gekühlt. Die Suspension wurde bei 4-8 C mit 1500 - 1800 Umdr/min während 10-12 min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit ver- worfen. Die zurückbleibenden Zellen wurden in einem gleichen Volumen Nährmedium (das gleiche wie das vorher verwendete) wieder suspendiert und nochmals zentrifugiert.
Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt und das dritte Mal nur ein halbes Volumen an Nährmedium für die Resuspension verwendet.
Die Suspension wurde auf eine Konzentration von 120000 Zellen/ml verdünnt und diese Zellensuspension wurde zur Herstellung stationärer Kulturen verwendet. 1 ml der Suspension wurde in jedes Röhrchen ge- geben und nach zwei Tagen Inkubation bei 37 C wurde 1 ml frisches Nährmedium zu jedem Röhrchen zu- gegeben. Nach 8 Tagen enthielten die Röhrchen eine Monoschicht von Spindelzellen und waren nun zur
Verwendung für die Zwecke der Erfindung geeignet.
Virusspektrum der Zellen.
Die entwickelten Medien wurden von den in der oben beschriebenen Weise vorbereiteten stationären
Röhrchen entfernt und die Zellschicht mit einer Mischung Nr. 635, die 5% Pferdeserum enthielt, gewa- schen. Nach drei Waschungen wurde 1, 5 ml "Maintenance-Medium" {Medium Nr. 635 (Healy u. a., canad. J. Biochem. & Physiol., Bd. 32 [1954], S. 327, 337) plus 10% Pferdeserum} jedem Röhrchen zuge- fügt. Danach wurden 0, 5 ml einer Lösung, welche jeden der zu testenden Viren enthielt, den verschie- denen Röhrchen zugefügt und die Röhrchen bei 37 C bebrütet. Von Zeit zu Zeit wurden die Röhrchen ge- prüft, um festzustellen, ob die Zellen für die zu testenden Viren empfänglich waren.
Folgende Resultate wurden erhalten :
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<tb>
<tb> Viren, <SEP> welche <SEP> einen <SEP> cytopatho- <SEP> Zeit, <SEP> bis <SEP> der <SEP> Effekt
<tb> genen <SEP> Effekt <SEP> auf <SEP> Zellen <SEP> ausüben <SEP> sichtbar <SEP> wird
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 4, <SEP> RI-67 <SEP> 6 <SEP> Tage
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 4, <SEP> RN <SEP> 11 <SEP> Tage
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 2, <SEP> Ad-6 <SEP> 11 <SEP> Tage
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 3, <SEP> J. <SEP> F.
<SEP> 5 <SEP> Tage
<tb> Polio <SEP> Typ <SEP> 1, <SEP> Mahoney <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Polio <SEP> Typ <SEP> 2, <SEP> MEF-1 <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Polio <SEP> Typ <SEP> 3, <SEP> Saukett <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Influenza <SEP> 1233 <SEP> 13 <SEP> Tage
<tb> Influenza <SEP> PRg <SEP> 5 <SEP> Tage
<tb> Tollwut <SEP> CVS <SEP> 8 <SEP> Tage
<tb> Gelbes <SEP> Fieber, <SEP> 17 <SEP> D <SEP> 6 <SEP> Tage
<tb> östliche <SEP> Pferde-Encephalomyelitis <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Herpes <SEP> HF <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Vaccinia <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Psittacosis, <SEP> Borg <SEP> 6 <SEP> Tage
<tb>
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Viren, die keinen cytopatho- genen Effekt auf Zellen ausüben
Influenza WS Epidemischer Typhus
APC, Typ 1
Zell-Typ : Der vorherrschende Zelltyp ist eine fibroplastartige Zelle.
Die Gewebekulturen der besonderen Zellen werden in üblicher Weise bereitet. Der Zellstamm wird in Hank'schem BBS-Medium kultiviert, zu welchem flüssiges menschliches Serum oder Pferdeserum und embryonaler Extrakt zugegeben wurde (vgl. Stulberg u. a., Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., Bd. 89 [1955], S. 438-441). Die Flüssigkeit wird von den 3-6 Tage alten Kulturen entfernt, die Zellen in einem Nährmedium, wie dem Medium 199, welches Menschen- oder Pferdeserum enthält, suspendiert und die Suspension in frische Behälter gefüllt. Die Behälter werden verschlossen und bei etwa 37 C während etwa 4-7 Tagen bebrütet. Am Ende dieser Behandlung bedeckt eine annähernd zusammenhängende Zellschicht die Seiten der Kulturenbehälter.
Die Flüssigkeit wird dekantiert und die Zellschicht mit einer sterilen Hank'schen Lösung, die Pferdeserum oder eine ähnliche physiologische Lösung enthält, gewaschen. Die Gewebekulturen sind dann zur Beimpfung fertig. Vorzugsweise wird die Beimpfung durchgeführt, bevor das "Supportive Maintenance-Medium" den Zellen zugegeben wird.
Als Impfmedium kann irgendeine Flüssigkeit verwendet werden, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthält. Man kann z. B. Serum, Plasma oder Blut verwenden, die den Virus in verdünnter oder unverdünnter Form enthalten, oder auch eine den Virus enthaltende Gewebekulturflüssigkeit. Man kann auch einen flüssigen Extrakt des Stuhls, der Milz, der Leber oder des Knochenmarks von an infektiöser Hepatitis leidenden Patienten als Impfflüssigkeit verwenden.
Als supportives wässeriges Medium für die Zellen während der Inkubationsperiode kann man eines oder mehrere der üblicherweise verwendeten Medien heranziehen. Medium Nr. 199 mit einem Zusatz von
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verwendet werden. Im allgemeinen wird bevorzugt, von der Verwendung menschlichen Serums bei Medien abzusehen, besonders wenn die Erfindung für diagnostische Zwecke verwendet werden soll.
Nach der Beimpfung wird die beimpfte Kultur bei einer für das Zellwachstum günstigen Temperatur bebrütet. Im allgemeinen ist dies eine Temperatur zwischen 30 und 42 C, vorzugsweise zwischen 35 und 39 C. Die Inkubationszeit ist nicht besonders kritisch, aber sie soll so lange erfolgen, bis die zellulare Monoschicht aufreisst und eine Anzahl von kleinen dunklen körnigen Zellen, unregelmässig in Grösse und Aussehen, sichtbar werden, die sich zu Klumpen ballen, wobei das Chromatin eine Randstellung einnimmt. Dies erfordert im allgemeinen einige Tage. In den meisten Fällen wird die Inkubation während einer Periode von 6 bis 14 Tagen durchgeführt.
Nach Beendigung der Inkubation wird die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthaltende Flüssigkeit von dem in der Kultur vorhandenen festen Material getrennt. Dies kann durch Filtration durch ein Seitzfilter, ein Bakterienporzellanfilter oder ein Bakterienfilter aus gefrittetem Glas oder durch Dekantieren oder durch Zentrifugieren erfolgen. Die erhaltene Gewebekulturflüssigkeit enthält eine hohe Konzentration an dem lebenden infektiösen Hepatitisvirus. Diese, den lebenden Virus enthaltenden Flüssigkeiten sind nützlich für die Beimpfung anderer Gewebekulturen, für die Prüfung von Gammaglobulin und für die Feststellung, ob eine gegebene Person in der Vergangenheit infektiöse Hepatitis hatte.
Wenn man die vorerwähnten Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden infektiöser Hepatitisvirus enthalten, zur Untersuchung der Eignung einer gegebenen Gammaglobulinzubereitung für die Behandlung von infektiöser Hepatitis verwendet, nimmt man zuerst eine bekannte Menge der zu prüfenden Gammaglobulinzubereitung und löst sie in einer bekannten Menge Wasser. Von dieser Lösung wird eine Reihe geeigneter Verdünnungen (gewöhnlich zweifach von 1 : 5 bis 1 : 1280) hergestellt. Gleiche Volumina dieser Verdünnungen und eine geeignete Verdünnung des Virus (gewöhnlich 1 : 5) werden in gleichen Volumtei-
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brütet. Jede Gewebekultur wird dann täglich untersucht, um festzustellen, ob der infektiöse Hepatitisvirus einen cytopathogenen Effekt auf die Detroit-6-Zellen der Kultur ausgeübt hat.
Wenn das der Fall ist, wird damit angezeigt, dass bei einer bestimmten Konzentration in der Kultur das Gammaglobulin gegenüber dem infektiösen Hepatitisvirus keine Wirkung hat. Wenn am Ende der Inkubationsperiode kein cytopathogener Effekt an den Detroit-6-Zellen festgestellt wird, zeigt dies an, dass bei einer besonderen
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Konzentration in der Kultur das Gammaglobulin fähig ist, den infektiösen Hepatitisvirus zu neutralisieren.
Auf diese Weise zeigt die vorerwähnte Prozedur nicht nur an, ob eine besondere Gammaglobulinzubereitung fähig ist, den infektiösen Hepatitisvirus zu neutralisieren, sondern gibt auch einen Hinweis auf ihre Potenz bzw. Wirksamkeit in dieser Hinsicht.
In ähnlicher Weise können die vorerwähnten Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthalten, verwendet werden, um festzustellen, ob eine gegebene Person früher infektiöse Hepatitis hatte. Dies wird durchgeführt, indem man eine Gewebekultur von Detroit-6-Zellen herstellt und die Kultur mit einer bekannten Menge, gewöhnlich mit etwa 0, 5 ml einer Mischung beimpft, die
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lich einer etwa 1 : 5-Verdünnung, verdünnt. Eine bekannte Menge des Serums oder der Verdünnung des- selben wird zu einem vorbestimmten, gewöhnlich gleichen Volumen der Standardvirus-Verdünnung (ge- wöhnlich etwa 1 : 5) zugefügt und die Mischung zur Beimpfung der Gewebekulturen verwendet, die dann bei 35-40oc während 9-14 Tagen bebrütet werden.
Wenn am Ende derinkubationsperiode die Prüfung der
Gewebekulturen anzeigt, dass der Virus einen cytopathogenen Effekt auf die Zellen ausgeübt hat, bedeu- tet dieser Test, dass der Patient in der Vergangenheit keine infektiöse Hepatitis hatte. Wenn jedoch der
Virus keinen cytopathogenen Effekt auf die Zellen ausgeübt hat, hatte der Patient eine Vergangenheit in bezug auf infektiöse Hepatitis.
Bei einer andern Anwendung der Erfindung kann man feststellen, ob ein Patient gegenwärtig von in- fektiöser Hepatitis befallen ist oder ob sein Blut ohne Bedenken für Transfusionszwecke verwendet werden kann. Diese Untersuchung wird durchgeführt, indem man eine Kultur von Detroit-6-Zellen herstellt und die Kultur mit einem Serum oder einer Serumverdünnung aus dem Blut des zu prüfenden Patienten beimpft.
DiebeimpfteKultur wird dann täglich untersucht und während 9-14 Tagen reifen gelassen. Wenn ein cytopathogener Effekt an den Detroit-A-Zellen festgestellt wird, zeigt der Test an, dass der Patient von infektiöser Hepatitis befallen ist und/oder dass sein Blut für Transfusionszwecke nicht geeignet ist. Wenn kein cytopathogener Effekt an den Zellen festgestellt wird, leidet der Patient nicht an infektiöser Hepatitis.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert : Beispiel l : Herstellung einer Gewebekulturflüssigkeit, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthält.
Eine Zellkultur des Detroit-6-Stammes wird in Hank's BBS-Medium mit einem Zusatz von menschlichem Serum und embryonalem Extrakt kultiviert, wie es in Proc. Soc. Exper. Biol. and Med. 89 [1955L S. 438-441 beschrieben ist. Die zwei oder drei Tage alte Kultur wird dreimal mit Medium Nr. 199 (Morgan u. a. Proc. Soc. Exper. Biol. andMed. 73 [1950], S. 1-8), das 10% Pferdeserum enthält, gewaschen.
Ein Serum wird aus dem Blut eines Patienten (MR 1), der von infektiöser Hepatitis befallen ist, bereitet und das Serum bis zum fünffachen Volumen mit sterilem Medium Nr. 199, das lolo Pferdeserum enthält, verdünnt. 0, 5 ml des verdünnten Serums werden der Gewebekultur zugefügt und die Zellschicht mit der Beimpfungsflüssigkeit benetzt. 1, 5 ml des Mediums Nr. 199 plus 100/0 Pferdeserum wird zugefügt und die Kultur bei 37 C während etwa 7 Tagen bebrütet. Am Ende der Inkubationsperiode zerriss die Monoschicht der Zellen und eine Anzahl von kleinen dunklen körnigen Zellen ballten sich, wobei das Chromatin eine Randzone einnahm. Diese körnigen Zellen waren unregelmässig in Aussehen und Gestalt.
Die Flüssigkeit wird von der Kultur abdekantiert und durch ein Seitzfilter oder ein ultrafeines Bakterienfilter aus gefrittetem Glas filtriert. Das Filtrat enthält lebenden infektiösen Hepatitisvirus und kann für bestimmte diagnostische Prüfungen und Untersuchungen verwendet werden, wie zur Feststellung des Vorhandenseins von infektiöser Hepatitis in der Vergangenheit oder für die Prüfung von Gammaglobulinzubereitungen.
In ähnlicher Weise wurden lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthaltende Gewebekulturflüssigkeiten aus dem Serum von vier andern Patienten (SAL, G. Pas, D. Keb und H. Pom), die von infektiöser Hepatitis befallen waren, hergestellt.
Anstatt der Verwendung eines lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthaltenden Serums als Beimpfungsflüssigkeit kann man auch eine Stuhlsuspension verwenden. Dies erfolgt dadurch, dass man eine Stuhlprobe eines an infektiöser Hepatitis erkrankten Patienten auf dans 100-fach Volumen mit steriler physiologischer Salzlösung oder Medium Nr. 199 verdünnt, zentrifugiert und 0,5 ml der klaren überstehenden Flüssigkeit als Beimpfung verwendet. Auf diese Weise wurden Gewebekulturflüssigkeiten mit einem Gehalt an lebendem infektiösem Hepatitisvirus aus den Stühlen von drei Patienten (New, Gar und USA), die an infektiöser Hepatitis litten, hergestellt.
Beispiel 2 : Prüfung von Gammaglobulin unter Verwendung von Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthalten.
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Eine Serie von Detroit-6 -Zellkulturen wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt und jede Kultur mit 0, 5 ml einer der nach Beispiel 1 hergestellten Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthalten, beimpft. Eine bekannte Menge des zu prüfenden Gammaglobulins wird in einer bekannten Menge von sterilem Wasser gelöst und verschiedene Verdünnungen der Lösung bereitet.
0,5 ml von jeder Verdünnung wird zu einer verschiedenen beimpften Detroit-6-Zellkultur zugefügt und die erhaltenenKulturen werden'während 9-14 Tagen bei 37 C reifen gelassen. Die Kulturen wurden dann geprüft, um festzustellen, ob der Virus einen cytopathogenen Effekt an den Detroit-6-Zellen hervorgebracht hat. Die Ergebnisse dieser Versuche bei dieser Probe Gammaglobulin sind in Tabelle 1 angeführt.
Die Tabelle 1 zeigt auch die Ergebnisse einer ähnlichen Versuchsreihe an einer andern Probe Gammaglobulin.
Tabelle 1
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<tb>
<tb> Verdünnung <SEP> des <SEP> Gammaglobulin <SEP> Gammaglobulin
<tb> Gammaglobulins <SEP> Probe <SEP> A <SEP> Probe <SEP> B
<tb> cytopathogener <SEP> Effekt <SEP> cytopathogener <SEP> Effekt
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 50 <SEP> toxisch <SEP> +
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 100 <SEP> 0 <SEP> + <SEP>
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 320 <SEP> 0 <SEP> +
<tb> 1 <SEP> 1000 <SEP> +
<tb> 1 <SEP> 3200 <SEP> + <SEP>
<tb> 1 <SEP> 10000 <SEP> + <SEP> +
<tb> 0 <SEP> Kontroll <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
0 = kein cytopathogener Effekt + = cytopathogener Effekt :
I : = teilweiser cytopathogener Effekt
Es ist festzustellen, dass das Gammaglobulin der Probe B keine Fähigkeit zeigte, die Wirkung des infektiösen Hepatitisvirus auf Detroit-6-Zellen zu unterdrücken und dass dieses Gammaglobulin daher zur Behandlung von an infektiöser Hepatitis leidenden Patienten ungeeignet ist. Das Gammaglobulin der Probe A zeigte anderseits eine ausgeprägte Fähigkeit, das Wachstum des infektiösen Hepatitisvirus zu unterbinden und ist daher zur Behandlung von an infektiöser Hepatitis leidenden Patienten geeignet.
Beispiel 3: Verwendung von Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthalten, zur Feststellung eines früheren Befalles durch die Krankheit.
Aus dem Blut des zu untersuchenden Patienten (FT) wurde Serum hergestellt und das Serum mit Medium Nr. 199 auf 5 Volumina verdünnt. Eine Detroit-6-Zellkultur wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, bereitet und mit 0,5 ml einer der nach Beispiel 1 hergestellten Gewebekulturflüssigkeiten (GAR), die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthalten, beimpft. 0, 5 ml des verdünnten Serums wird der Kultur zugefügt, die Kultur mit 1,0 ml Medium Nr. 199, enthaltend lolo Pferdeserum, verdünnt und die Kultur bei 37 C während 9-14 Tagen bebrütet. In täglichen Intervallen wird die Kultur während der Inkubationsperiode geprüft, um festzustellen, ob der Virus einen cytopathogenen Effekt auf die Zellen der Kultur ausgeübt hat. Wenn nicht, hat der Patient in der Vergangenheit eine infektiöse Hepatitis durchgemacht.
Wenn aber ein cytopathogener Effekt festgestellt wird, hat der Patient diese Krankheit nicht gehabt. Die Ergebnisse dieses Versuches sind in Tabelle 2 angeführt. Tabelle 2 zeigt auch ähnliche Versuche an andern Patienten und mit andern Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden Hepatitisvirus enthalten.
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Tabelle 2
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<tb>
<tb> Cytopathogener <SEP> Effekt <SEP> auf <SEP> Zellen
<tb> Bezeichnung <SEP> Gewebekultur-Gewebekultur-Gewebekultur-Gewebekultur
<tb> des <SEP> Serums <SEP> Flüssigkeit <SEP> Flüssigkeit <SEP> Flüssigkeit <SEP> Flüssigkeit
<tb> Verdünnung <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> PAS <SEP> GAR <SEP> Keb <SEP> MR <SEP> l <SEP>
<tb> FT <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> RK <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> RK <SEP> + <SEP> 0. <SEP> 0 <SEP> +
<tb> PS <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> HJ <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
+ zeigt einen cytopathogenen Effekt auf den Zellen an
0 zeigt keinen cytopathogenen Effekt auf den Zellen an
Serum FT wurde von einer Person erhalten, von der es bekannt war, dass sie vor sieben Jahren an infektiöser Hepatitis gelitten hatte.
Die Sera PS und HJ wurden von Personen erhalten, die bisher keine infektiöse Hepatitis hatten. Serum RK. wurde von einer Person erhalten, die keine infektiöse Hepatitis vor der Entnahme der Blutprobe durchgemacht hatte. Serum RK2 ist das Serum, welches vom Patienten. RKl erhalten wurde nach der Genesung von einer Krankheit, die während des Verlaufes der Arbeit auftrat. Die positiven Versuchsergebnisse, die mit den Flüssigkeiten PAS und MR 1 im Falle des Serums RK2 erhalten wurden, bedeuten nicht notwendigerweise, dass der Virus in diesen zwei Flüssigkeiten von einem andern Typ ist, als in den Flüssigkeiten GAR und Keb.
Wahrscheinlicher zeigen diese Ergebnisse nur an, dass die als Beimpfung verwendeten Flüssigkeiten PAS und MR 1 eine höhere Konzentration an dem Virus enthielten, als die als Beimpfung verwendeten Flüssigkeiten GAR und Keb.
Beispiel 4 : Herstellung von Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthalten.
Fünf Röhrchen einer Gewebekultur von PD39T-Zellen werden vorbereitet und mit 0, 5 ml einer 1 : 5-Verdünnung des Serums eines von infektiöser Hepatitis befallenen Patienten beimpft.
1, 5 ml"Maintenance-Lösung" (Medium Nr. 199 plus 50/0 Pferdeserum) wird zu jedem Röhrchen zugefügt und die Kulturen 10 Tage bei 37, 50c bebrütet. Die Kulturflüssigkeiten werden durch ein Bakterienfilter mit einer mittleren Porosität von 0,3 Mikron geleitet, wobei ein Filtrat erhalten wird, das lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthält.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern infektiöser Hepatitis in menschlichem Blut oder Gewebe, dadurch gekennzeichnet, dass Blut, eine Blutfraktion oder ein Gewebeextrakt in einer Mehrzahl vonserienverdünnungen mit epithelartigen Zellen des Detroit-6-Stammes oder mit aus embryonalem Gewebe gewonnenen Spindelzellen, wie PD39T-Zellen, und mit lebendem infektiösem Hepatitisvirus vereinigt, die erhaltenen Kulturen bei einer Temperatur zwischen 35 und 40 C während 9-14 Tagen bebrütet werden und in jeder der Kulturen die Zellenmonoschicht auf das Vorhandensein eines cytopathogenen Effektes geprüft wird, dessen Vorhandensein die Abwesenheit der erwähnten Antikörper anzeigt.