Verfahren zur Herstellung von Hexose 1,6 bzw. Pentose-1,5-diphospbaten
Die Erfindung betrifft die chemische Synthese von Hexose-1 6- bzw. Pentose-1,5-diphosphaten, insbesondere ein einfaches Eintopfverfahren zur Herstellung dieser Diphosphiate, ausgehend von den entsprechenden Hexose-6- bzw. Pentose-5-phosphaten.
Monosaccharide, die an beiden Estern der Kohlenstoffkette mit Phosphonsäure verestert sind, spielen eine wichtige Rolle als Coenzyme bei physiologischen Phosphatübertagungen. Mit diese° Funktion sind sie heute wichtige Reagentien in biochemischen und kli nisch-chemis chen Laboratorien.
So ist das Glucose-1,6-diphosphat das Coenzym der Phosphaglucomutase, welche die Reaktion Glucose-1 -phosphat
EMI1.1
Glucose 6 phosphat und Ribose 1,5Ziphosphat das Coenzym der Phosphor ribomutase. welche den Uebergang RiboseWl-phosphat
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Ribose-5 -phosiphat katalysiert.
Diese Zuckerdiphosphate waren bisher nur über komplizierte chemische Synthesen oder aufwendige Isolierungsverfahren aus biologischen Materialien zu- gänglich.
So führt die von T. Posternak in J. Biol. Chem. 180, 1269 (1949) beschriebene chemische Synthese von Glucose-1,6 diphosphat in einem komplizierten siebenstufigen Verfahren trotz aufwendiger Methoden nur zu Ausbeuten von höchstens 10 O/o, bezogen auf das Acetylglucose-6-diphenylphosphat, einer dem Ausgangsmaterial des vorliegenden Verfahrens etwa entsprechenden Stufe, bei noch sehr viel geringeren Gesamtausbeuten. Die von L. S. Leloir und A. C. Paladini in S. P. Colowick und N. C. Kaplan: Methods in Enzymology, Academic Press Inc., New York, Bd.
III (1957) unter Seite 143ff. beschriebene Isolierung von Glucose-1,6-diphosphat aus Hefeextrakt führt ebenfalls nun zu sehr geringen Ausbeuten an einem ausserdem sehr unreinen Produkt, so dass eine technische Herstellung nach diesem Verfahren nicht in Betracht kommt.
Es besteht daher Bedarf an einem einfachen Verfahren, das rasch und in guter Ausbeute zu den ge wünschten Zuckerdiphosphaten führt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diesen Bedarf zu befriedigen, die Nachteile der bekannten Verfahren zu beseitigen und ein Verfahren zur Herstellung von Hcxose-1,6- bzw. Pentose-1,5-diphosphaten zu schaffen, welches sich zur Durchführung in technischem Masstab gut eignet.
Die Lösung dieser Aufgabe gelang nun durch ein Verfahren zur Herstellung von Hexose-1,6- bzw. Pentose-1,5-diphosphaten, welches darin besteht, dass man das 6- bzw. 5-Monophosphat des Zuckers gegebenenfalls in Form eines Salzes mit einem Acylierungsmittel, vorzugsweise mit Essigsäureanhydrid, behandelt, überschüssiges Acylierungsmittel entfernt, den Rückstand unmittelbar mit überschüssiger wasserfreier Pyro- und/ oder Orthophosphorsäure unter mässigem Erwärmen schmilzt, dann das Reaktionsgemisch mit Lauge versetzt und das Zuckerdiphosphat in Form eines Salzes abtrennt.
Dieses einfache Verfahren führt in Ausbeuten bis zu 50 O/o und darüber zu den gewünschten Diphosphaten.
Es war zwar schon bekannt, dass nicht phosphoryllierte peracetylierte Glucose durch Schmelzkondensation mit Phosphorsäure in das Monophosphat überführt werden kann [s. D. L. McDonald, J. Org. chem. 27, 1107 (1962)]. Es ist jedoch überraschend, dass auch bereits in Stellung 6 bzw. 5 phosphoryllierte Zucker nach Acylierung durch Kondensation mit wasserfreier Pyro- oder Orthophosphorsäure zu den gewünschten 1,6- ;bzw. 1,5-Diphosphaten führen, da sich bekanntlich die phosphoryllierten und die nicht phosphoryllierten Zucker in ihrer Reaktivität erheblich unterscheiden. Vielmehr war nach der Arbeit von Ukita und Mitarbeitern in J. Biol. Chem. 216, & 867 in.
(1955), in der gezeigt wurde, dass am Phosphat acylierte Phosphatesten von Zuckern (Glycerophosphat) bei der alkalischen Hydrolyse cyclische Phosphatester bilden, zu erwarten, dass Cyclophosphate oder Spaltprodukte davon mit einer an das Nachbarkohlenstoff- atom gewanderten Phosphatgruppe gebildet werden, da beim erfindungsgemässen Verfahren am Phosphat acylierte Ester als Zwischenprodukte entstehen, die anschliessend alkalisch hydrolysiert werden.
Hinzu kommt noch, dass bekanntlich die Stabilität von Substituenten am C-Atom 1 von Zuckern durch eine Phosphatgruppe an der primären endständigen Alkoholgruppe wesentlich erhöht wird, so dass eine negative Beeinflussung des Austausches einer Acylgruppe gegen einen Phosphatrest am Kohlenstoffatom 1 des Zuckers durch den Phosphatester in Stellung 6 bzw. 5 angenommen werden musste.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäss en Verfahrens ist darin zu sehen, diass ohne Isolierung von Zwischenprodukten in einer Eintopfreaktion, ausgehend von einem Hexose-6- bzw. lPentose-5-mono- phosphat, die entsprechenden Diphosphate hergestellt werden können.
Als Ausgangsprodukte eignen sich z.B. folgende Zuckermonophosphate: Glucose-6-phosphat, Arabinose-5-phosphat, Oalaktose-6-phosphat, Mannose-6-phosphat, Ribose-5-phosphat und Xylose-5-phosphat.
Besonders gute Ergebnisse werden mit Glucose6-phosphat erhalten.
In der ersten Stufe des erfindungsgemässen Eintopfverfahrens wird das Zuckermonophosphat mit einem Acylierungsmittel umgesetzt. Als Acylierungsmittel eignen sich die für derartige Reaktionen üblichen Derivate der niedrigen Fettsäuren mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise wird Essigsäureanhy- drid oder Acetylchlorid verwendet. Die Acylierung kann ohne ein besonderes Lösungsmittel allein mit einem Überschuss des flüssigen Acylierungsmittels erz folgen, es ist jedoch auch möglich, ein gegenüber der Reaktion inertes Lösungsmittel zu verwenden. Vorzugsweise wird ein KonÅaensationskatalysator zugesetzt, beispielsweise ZnCl2, Perchlorsäure, Pyridin oder Natriumacetat.
Besonders gute Ergebnisse werden mit wasserfreiem Natriumacetat erzielt, wenn als Acylierungsmittel Essigsäureanhydrid verwendet wird.
Die Acylierung erfolgt zweckmässig bei Temperaturen zwischen etwa 0 und 1200 C in Abhängigkeit von der Anwesenheit und der Art des Kondensations katalysators.
Bei Anwendung eines Kondensafionskatalysators werden im allgemeinen bessere Ausbeuten erzielt, als ohne einen solchen. Andererseits entfällt ohne Zusatz eines Katalysators dessen Entfernung vor dem Zusatz der Phosphorsäure.
Nach Beendigung der Acylierung werden überschüssiges Acylierungsmittel und gegebenenfalls Lösungsmittel oder Katalysator und Reaktionsneben- produkte entfernt, vorzugsweise durch Vakuumdestillation bei Temperaturen unter 1000 C, günstig bei etwa 40 bis 80 C.
Es wird angenommen, dass bei der Behandlung mit dem Acylierungsmittel eine Acylierung sämtlicher freier Hydroxylgruppen erfolgt.
In der zweiten Stufe des erfindungsgemässen Verfahrens wind der nach dem Abziehen des Acylierungsmittels erhaltene Rückstand mit überschüssiger wasser freier Orthophosphorsäure oder Pyrophosphorsäure oder Gemischen von beiden versetzt, vorzugsweise im Vakuum. Das molare Verhältnis von acylierten Zukkermonophosphat zu Ortho- oder Pyrophosphorsäure kann zwischen etwa 1,5 und 10 liegen, günstig werden etwa 3 bis 5 Mol verwendet. Wenn der molare Phos phorsäureüberschuss zu gering wird, sinkt die Ausbeute, ein zu grosser Überschuss erschwert die Reinigung der Diphosphate und stört bei der späteren Verseifung.
Die Reaktion mit der Phosphorsäure wird durch Erhitzen auf z.B. über 500 C eingeleitet, wobei die Phosphorsäure schmilzt und die Mischung homogen wird. Der für die Weiterreaktion der homogenen Mischung geeignete Temperaturbereich liegt zwischen etwa 20 und 100" C, wobei Temperaturen von etwa 50 bis 80" C besonders bevorzugt werden.
Die Reaktionsdauer liegt im allgemeinen zwischen einigen Minuten und mehreren Stunden, in Abhängigkeit von der gewählten Reaktionstemperatur. Bei Temperaturen im bevorzugten Bereich dauert die Umset- zung etwa 1 bis 2 Stunden.
Das Reaktionsgemisch wird nach Beendigung der Umsetzung mit Lauge, vorzugsweise wässriger oder alkoholischer, Lauge, alkalisch gestellt und stehen gelassen. Besonders gut geeignet sind alkoholische Natronlauge oder Kalilauge, doch können auch andere Lösungsmittel, beispielsweise Tetrahydrofuran und andere Alkalien, beispielsweise Ammoniak oder Lithiumhydroxyd, verwendet werden. Bevorzugt wird die Verwendung methanolischer Natronlauge.
Ein Vorteil der Verwendung alkoholischer Lauge liegt darin, dass dabei die entsprechenden Salze der Zuckerdiphosphorsäure und der Ortho- bzw. Pyrophosphorsäure ausfallen. Sie las;sen sich dann leicht in üblicher Weise, z. B. durch Abfiltrieren oder Abzentri fugieren abtrennen und weiter reinigen.
Gemäss einer besonderen Ausführungsform des er findungsgemässen Verfahrens kann die Reinigung auf besonders einfache Weise durch Auflösen der ausgefallenen Salze in heissem Wasser und Einstellung der Lösung auf einen pH-Wert von genau 9,0 erfolgen.
Beim Abkühlen auf etwa 0 C kristallisiert dann die Hauptmenge des Orthophosphats als NaOHPO412H20 aus. Der Rest lässt sich z. B. als Magnesiumammoniumphosphat entfernen. Das Zuckerdiphosphat kann dann von restlichen Verunreinigungen, z. B. als Cyclohexylammoniumsalz abgetrennt und kristallisiert werden.
Nach einer besonders bevorzugten Arbeitsweise wird im Falle der Olucosephosphate die Trennung des Diphosphats vom Monophosphat - dadurch bewirkt, das eine Lösung der Salze bei etwa neutralem pH-Wert, vorzugsweise bei pH7,5 zum Sieden erhitzt und mit einer Bariumlösung versetzt wird.
Hierbei fällt Glucose-1,6-diphosphat vollständig in Form des Dibariumsalzes aus, während nicht umgesetztes Glucose-6-phosphat unter diesen Bedingungen überraschenderweise fast vollständig in Lösung bleibt.
Dieses Verhalten ist überraschend, da Bariumglucose6-phosphat in der Kälte unlöslich und im allgemeinen die Erdalkalisalze von Zuckerphosphaten in der Hitze unlöslich sind.
Eine Trennung von Glucose-1,6-diphosphat von anderen begleitenden Verunreingungen kann erfindungsgemäss; durch vorsichtiges Ansäuern mit Salzsäure auf pH 4 erfolgen, wobei das Diphosphat in Lösung geht und von den unlöslich gebliebenen Verunreinigungen abgetrennt werden kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren verläuft stereospezifisch mit guter Ausbeute und gestattet erstmals, die Hexose-1,6- bzw. Pentose-1 ,5-diphosphate zu angemessenen Bedingungen zur Verfügung zu stellen. Besonders wichtig ist die Tatsache, dass bei dem erfin dungsgemässen Verfahren stets die biologisch wirksame a-Konfiguration gebildet wird. Dies ist besonders überraschend, da dieser Effekt unabhängig vom verwendeten Kondensationskatalysator auftritt und bekanntlich die verschiedenen Kon,densation,skatalysato- ren entweder die CL- oder die ss-Form bilden.
Die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1 Hersteilung von Glucose-1,6-ldiphosphat
522 g a-D( + )-Glucopyranose-6-phosphat, kristall.
Bariumsalz. 7 H2O (= 1 Mol) werden in 2 1 dest. Wasser suspendiert und mit 55,5 ml kone. Schwefelsäure (= 1 Mol, mit Wasser vorher verdünnen) 20 Minuten im Eisbad gerührt und vom Bariumsulfat abfiltriert. Der Niederschlag wird einmal mit Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate enthalten ca. 95 O/o des eingesetzten Glucose-6-phosphats als freie Säure. Es wird mit Pyridin auf pH 4 gebracht und die Lösung in einem 2-l-Rundkolben bis zur Trockne im Vakuum eingedampft. Zur Entfernung von restlichem Wasser wird noch zweimal in Pyridin aufgenommen und zur Trockne eingedampft.
Das als glasiger halbfester Rückstand vorliegende Pyridiniumsalz wird in 1500 ml Pyridin suspendiert, 1500 ml Essigsäureanhydrid werden zugesetzt und die Mischung wird ca. 15 Stunden ge schüttelt. Der Rückstand geht hierbei unter mässiger Wärme entwicklung in Lösung. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum (p ca. 5 mm) wieder zur Trockne eingeengt, in ca. 200 ml Essigsäureanhydrid aufgenommen und nochmals eingeengt. Gegen Ende der Destillation wird die Badetemperatur bis auf 75 C gesteigert.
Hiendurch werden Pyridin, Essigsäure und Essigsäureanhydrid entfernt.
Der glasige, braune Rückstand wird mit 392 g kristallisierter Orthophosphorsäure (= 4 Mol, wasserfrei durch Trocknen über Magnesiumperchlorat) versetzt.
Das Reaktionsgefäss (24-Rundkolben) wird an einen Rotationsverdampfer gehängt und über eine entsprechende Kühlfalle ein Vakuum von 1 bis 5 mm angelegt. Die Reaktion wird unter Feuchtigkeitsausschluss und Erwärmen aus 70 bis 75 C durch Drehen des Reaktionsgefässes im Wärmebad eingeleitet. Bei ca.
500 C schmilzt die Phosphorsäure und die Mischung wird homogen. Nach ca. 90 Minuten hört die Gasentwicklung auf undfdie Reaktion ist beendet. Nach Abkühlen wird das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur in ca. 5 1 Methanol aufgenommen und mit ca.
700 ml 300/obiger Natronlauge auf pH 9 bis 10 gebracht.
Nach etwa 5 Minuten wird der Methanolüberstand vom gebildeten Niederschlag abdekantiert und verworfen.
Der Rückstand wird in ca. 1,5 1 heissem Wasser gelöst, mit Essigsäure oder Natronlauge auf pH 9,0 gebracht und auf ca. 0 C abgekühlt. Der kristalline Nie derschiag wird abgesaugt und mit wenig kaltem Wasser gewaschen.
Im Filtrat wird das restliche Orthophosphat stöchniometrisch als Magnesiumammoniumphosphat kristallisiert und abgesaugt.
Das von anorganischem Phosphat freie Filtrat wird mit 750 ml 50 zeiger Bariumacetatlösung bei pH 7,5 in der Siedehitze versetzt. Hierbei bildet sich ein Nieders;chlag, der heiss filtriert und zweimal mit heissem Wasser nachgewaschen wird. Dann wird der Niederschlag in ca. 2 1 Wasser suspendiert, bei Raumtempera- tur durch vorsichtiges Ansäuern mit Salzsäure auf pH 4 gebracht, vom Unlöslichen abgetrennt und durch Zugabe von Kohle und Filtration derselben vollständig entfärbt.
Das klare, wasserhelle Filtrat wird mit Natronlauge auf pH 7,5 zurückgestellt, wobei der Grossteil von Glucose-1 ,6-diphosphat-Bariumsalz bereits ausfällt. Es wird kurz zur Siedehitze gebracht und alles noch einmal heiss filtriert und mit Alkohol und dann mit Aceton nachgewaschen und der Niederschlag im Vakuum über Chlorcalcium, schliesslich über Phosphorpentoxy getrocknet. Die Ausbeute an Dibariumsalz des Gluco- se-1,6-diphosphates beträgt ca. 210 g.
Beispiel 2
Herstellung von Glucose-1,6-diphos,phat
In einen 3-l-Dreihalskolben werden 335 g Natrium glucose-Sphosphat, 125 g wasserfreies Natriumacetat und 1,7 1 Essigsäureanhydrid gegeben. Unter Rückfluss und dauerndem Rühren wird der Kolben auf einem Ölbad von 105 C auf eine Innentemperatur von 950 C gebracht. Bei 95" C tritt ein starker Temperaturanstieg ein, so dass gekühlt werden muss. Nach 1 112 Stunden wird der Kolben auf 0 C abgekühlt und das auskristallisierte Natriumacetat abfiltriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingeengt.
Die weitere Behandlung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben mit dem Unterschied, dass das Erhitzen mit der Phosphorsäure bei 80 bis 85" C durchgeführt wird.
Die Ausbeute beträgt 250 g.
Beispiel 3
Herstellung von Glucose-1,6-diphosphat in Abwesenheit eines Katalysators
Es wird wie in Beispiel 2 beschrieben vorgegangen, jedoch entfällt der Zusatz an Natriumacetat. Nach dem Abkühlen entfällt das Abfiltrieren des Natriumacetats, und der Kolbeninhalt wird direkt zur Trockne eingeengt.
Die Ausbeute beträgt 190 g.
Beispiel 4
Herstellung von Galactose-1 ,6-diphosphat
In einem 3-l IDreihalskolben werden 320 g Natri umgalactose-6-phosiphat (vollkommen wasserfrei getrocknet, ca. 95 /oig) in 1,7 1 Essigsäureanhydrid suspendiert. Unter Rückfluss und dauerndem Rühren wird der Kolben im Ölbad auf eine Innentemperatur von ca. 1100 C gebracht. Bei 100 bis 1100 C tritt ein merklicher Temperaturanstieg ein. Nach ca. 1 Stunde ist die Reaktion beendet; es wird auf Raumtemperatur gekühlt und das ca. 3- bis 4fache Volumen Äther zuge- geben. Beim Abkühlen auf 1O0 C kristallisiert Natrium- acetat aus. Die Kristalle werden abgesaugt und das Filtrat wird bis zur Trockne im Vakuum eingeengt.
Die weitere Behandlung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben, mit dem Unterschied, dass zur Phosphatschmelze etwa 50 O/o mehr Phosphorsäure und nach beendeter Schmelzreaktion entsprechend mehr Natronlauge zugegeben wird.
Die Ausbeute beträgt etwa 180 bis 200 g Galacto se-1,6-diphos,phat-Bariumsalz.
Beispiel 5
Herstellung von Ribose-1,5-diphosphat 365,4 g Ribofuranose-5-phosphat-Bariumsalz (= 1 Mol) werden in 2 1 destilliertem Wasser suspendiert und mit 55,5 ml konzentrierter Schwefelsäure (= 1 Mol, vor dem Zusatz mit Wasser verdünnt) 20 Minuten im Eisbad gerührt und vom Bariumsulfat abfiltriert. Der Niederschlag wird einmal mit Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate enthalten ca. 95 O/o des eingesetzten Ribose-5-phosphats als freie Säure.
Mit Natronlauge wird der pH-Wert auf 6 bis 6,5 gebracht und die Lösung in einem 4-l-Rundkolben bis zur Trockne im Vakuum eingedampft. Zur Entfernung von restlichem Wasser wird noch zweimal mit Eisessig zur Trockne eingedampft. Der glasige, halbfeste Rückstand wird mit 25001 Essigsäureanhydrid von ca.
800 C unter Rühren am Rückfluss zur Reaktion gebracht und die Temperatur langsam bis 1050 gesteigert. Der Rückstand geht hierbei unter mässiger Wärmeentwicklung in Lösung. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum (p = ca. 5 mm) bis auf etwa 1500 ml eingeengt, auf Raumtemperatur gekühlt und mit der etwa 3- bis 4fachen Menge Äther unter gutem Rühren versetzt. Beim Abkühlen auf ca. -10 C kristallisiert die Hauptmenge des Natriumacetats aus. Nach Abtrennen des Niederschlags wird die klare Lösung im Vakuum bis zur Trockne eingeengt.
Der glasige, braune Rückstand wird mit 392 g kristallisierter Orthophosphorsäure (= 4 Mol, wasserfrei durch Trocknen über Magnesiumperchlorat) versetzt.
Das Reaktionsgefäss ( l-Rundkolben) wird mit einem Rotationsverdampfer verbunden und über eine entsprechende Kühlfalle wird ein Vakuum von ca.
1 mm angelegt. Die Reaktion wird unter Feuchtigkeitsausschluss und Erwärmen auf ca. 550 C durch Drehen des Reaktionsgefässes im Wärmebad eingeleitet. Die Mischung wird langsam homogen und nach ca. 60 Minuten hört die Gasentwicklung auf und die Reaktion ist beendet. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch unter Kühlung und Rühren in 4200 mg 5 0/oige Natronlauge eingebracht, wobei der pH-Wert am Ende etwa 9 bis 10 betragen soll.
Die Lösung wird dann exakt auf pH 9 eingestellt (gegebenenfalls, durch Zugabe von etwas Phosphorsäure oder Natronlauge) und im Vakuum am Rotationsverdampfer eingeengt. Beim Auftreten des ersten Kristallisats wird die Lösung bei 0 C über Nacht stehen gelassen. Die Hauptnienge des überschüssigen anorganischen Phosphats kristallisiert als Nau;HPiO4 12H2O aus. Nach Abtrennen des kristallinen Niederschlags wird das klare Filtrat weiter bis ZUm erneuten AuftreF ten eines Kristallisats eingeengt und die Kristallisation des Natriumphosphats wie oben wiederholt.
In dem Endvolumen von ca. 700 ml wird das restliche Grthophosphat stöchiometrisch als MaguesIum- ammoniumphosphat kristallisiert und abgesaugt.
Das von anorganischem Phosphat freie Filtrat wird mit ca. 750ml 50 obiger Bariumacetatlösung bei pH 7,5 in der Siedehitze versetzt. Hierbei bildet sich ein Niederschlag, der heiss filtriert und zweimal mit heisc sem Wasser nachgewaschen wird. Dann wird der Niderschlag in ca. 2 1 Wasser suspendiert, bei Raumtemperatur durch vorsichtiges Ansäuern mit Salzsäure auf pH 4 gebracht, die unlöslichen Anteile werden abgetrennt und das Filtrat wird durch Zugabe von Kohle und Abfiltrieren derselben vollständig entfärbt.
Das klare, wasserhelle Filtrat wird mit Natronlauge auf pH 7,5 zurückgestellt, wobei der Grossteil von Ribose- 1 ,5diphosphat-B ariumsalz bereits ausfällt.
Dann wird kurz zum Sieden erhitzt, alles noch einmal filtriert, mit beissem Wasser chloridfrei gewaschen und mit Alkohol und dann mit Aceton nachgewaschen und der Niederschlag im Vakuum über Chlorcalcium und schliesslich über Phosphorpentoxyd getrocknet. Die Ausbeute an Dibariumsalz des Ribose-1 ,5-diphosphats beträgt ca. 120 g.