CH497385A - Verfahren zur Herstellung eines Dekapeptides - Google Patents

Description

  
 



  Verfahren zur Herstellung eines Dekapeptides
Im Hauptpatent Nr. 408 948 ist die Herstellung neuer Dekapeptide der Formel   L-Seryl-ktyrosyl-L-      seryl-l-a-merkapto-niederalkyl -a-    amino-acetyl-L-glut   aminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-(X-amino-niederalkyl-      a-amino-acetyl-L-tryptophyl-g,lycin,    deren Merkaptogruppe durch einen Niederalkylrest, wie Athyl, Propyl, insbesondere aber Methyl, substituiert oder unsubstituiert ist, sowie entsprechender Verbindungen, die statt des Glutaminrestes den Rest der Glutaminsäure aufweisen, und ihrer Derivate beschrieben.

  Diese Verbindungen, insbesondere das L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-Lmethionyl- L-glutaminyl - L - histidyl-L-phenylalanyl-Larginyl-L-tryptophyl-glycin, und die entsprechende Glutaminsäureverbindung weisen eine die Abscheidung des adrenocorticotropen Hormons (ACTH) aus der Antehypophyse stimulierende Wirkung (CRF-Wirkung) auf.



  Die Verbindungen und vor allem ihre Derivate mit geschützten Amino- oder Carboxylgruppen können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln, die eine längere Kette von   Arninosäuren    aufweisen, z. B. des ACTH oder des Peptids, das die ersten 24 Aminosäuren des ACTH umfasst und wie dieses eine adrenocorticotrope Wirkung aufweist, verwendet werden.



   Es wurde nun gefunden, dass das Verfahren des Hauptpatents zur Herstellung des genannten Dekapeptids   L-Seryl - L -      tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glut-    amyl-   L-.histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-    glycins und seiner Derivate durch Kondensation von tert.-Butyloxycarbonyl   - L - seryl - L -      tyrosyl-Lseryl-L-    methionin-azid mit y-tert.-Butyl-L-gluamyl-L-histidyl   Lphenylalanyl - L -      arginyl-L-tryptophyl-glycin    verbessert werden kann.

  Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man das Hexapeptidderivat y - tert.   - Butyl - L - glutamyl -    L - histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin dadurch herstellt, dass man   Carbobenzoxy- L-    arginin mit   L-Tryptophyl-glycin-methylester    kondensiert, aus dem erhaltenen Tripeptidderivat die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den freien Tripeptidester mit Carbobenzoxy-L-phenylanilin kondensiert, aus dem erhaltenen Tetrapeptidester die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den freien Tetrapeptidester mit Carbobenzoxy   (r-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidin-azid    kondensiert, in dem erhaltenen   Carbobenzoxy-(;

  ;tert.-butyl)-L-glut-    amyl - L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycin-methylester die Methylestergruppe verseift und die Carbobenzoxygruppe durch Hydrierung entfernt, vgl. Fig. 1. Z bedeutet die Carbobenzoxygruppe.



   Das beschriebene Hexapeptidderivat kann, wie im   HauptpatentNr.      408948    gezeigt,   mitdemTetrapeptidderi-    vat tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-Lmethionin-azid zum Dekapeptidderivat tert.-Butyloxycar   bonyl - L - seryl - L - tyrosyl-Lseryl-l-methionyl-1-tert .- butyl-Dglutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L -    tryptophyl-glycin kondensiert werden. Aus diesem kann das freie Dekapeptid, wie im Hauptpatent beschrieben, hergestellt werden, oder das Derivat kann als Ausgangsmaterial für die Herstellung des oben erwähnten Tetrakosapeptids verwendet werden.  
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<tb>  Fig. 1
Die Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.



   Für die Papierchromatographie wurden die folgenden Systeme benützt:    System 52: n-Butanol-Essigsäure-Wasser
100:10:30   
System 54: sek.-Butanol-Isopropanol-Monochlor essigsäure-Wasser 70:10 3 g: 40
System 56:   S-Butanol-lsopropanol-5      R;    Veronal    Natrium-Wasser 100:15 10: 60     -System 87: Isopropanol-Ameisensäure-Wasser    400 : 20:100   
System 100: Essigester-Pyridin-Essigsäure-Wasser    60: 20: 6: 1   
System 101:   n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser   
30:20:6:24.



   Beispiel
1)   Carbobenzo:ry-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-    methylester-hydrochlorid
40 g (0,128 Mol) L-Tryptophyl-glycin-methylesterhydrochlorid und 41,5 g (0,135 Mol) Carbobenzoxy-L   arginin    werden in 650 ml abs, Pyridin bei 400 gerührt, bis eine schwach getrübte Lösung erhalten wird. Diese wird auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 39,6 g Dicyclohexylcarbodiimid (0,192 Mol) versetzt Nach   lstündigem    Rühren wird über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt. Am nächsten Tag wird auf   0     gekühlt und der Dicyclohexylharnstoff abgesogen. Man engt das Filtrat im Vakuum stark ein, löst das dicke Öl in Chloroform und tropft die Lösung unter Rühren in viel Äther ein. Dabei erhält man einen amorphen Niederschlag.

  Man dekantiert den   Äther    ab und wäscht den Rückstand gut mit Äther. Nach Trocknen im Vakuum bei   50     erhält man 77,3 g eines schwach rötlich-brau nen Pulvers   (100%    der Theorie = 77,1 g). Das erhaltene Produkt wird ohne weitere Reinigung für di nächste Stufe eingesetzt.



   2) L-Arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester
77,2 g   (0,123    Mol) Carbobenzoxy-L-arginyl-L-tryp   tophyl-glycin-methylester-hydrochlorid    werden in 800 ml ln. Essigsäure gelöst und mit 5   g Norit    gerührt. Nach etwa 10 Min. erstarrt die Mischung gelatineartig. Durch Zugabe von 40 ml Eisessig und Erwärmen auf 400 wird die Substanz wieder in Lösung gebracht und die Aktivkohle über   Celite    abgesaugt. Das Filtrat wird nach Zusatz von 5 g Palladiumkohle   10 oig    hydriert, bis nach etwa 6 Stunden die theoretische Menge Wasserstoff aufgenommen ist (2,9 Liter). Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat mit Amberlite IRA400, Acetatform, versetzt und gerührt, bis sich keine Chloridionen mehr nachweisen lassen. 

  Der Ionenaustauscher wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat im Vakuum zur Trockne verdampft. Es hinterbleiben 74,5 g L-Arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-diacetat in Form eines gelblichen Schaumes.



   Überführung ins Ditosylat:
34,5 g (0,0625 Mol) L-Arginyl-L-tryptophyl-glycinmethylester-diacetat werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 23,8 g p-Toluolsulfonsäure    lHgO    (0,125 Mol) versetzt. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockne verdampft, der Rückstand mit Äthanol vollständig entwässert und im Vakuum getrocknet. Das Ditosylat wird als beiger Schaum (48 g) erhalten.  



  3)   Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-Lárginyl-L-tryptophyl-    glycin-methylester-acetat
45 g (58 mMol)   L-Arginyl-L-tryptophyl-glycin-    methylester-ditosylat, 26 g (87 mMol) Carbobenzoxy-Lphenylanilin und 8,1 g (58 mMol) Triäthylamin werden in 450 ml Acetonitril bei Raumtemperatur gelöst. Darauf gibt man 19,3 g (94 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt noch   all/2    Std. bei Raumtemperatur.



  Nach Stehen über Nacht im Eisschrank wird der Dicyclohexylharnstoff abgesaugt. Das Filtrat wird im Vakuum stark eingeengt, dann die Substanz mit   Ather    als zähes Produkt gefällt. Nach Abgiessen des Lösungsmittels trocknet man den Rückstand im Vakuum bei 500. Das erhaltene Rohprodukt (65 g) wird zur Reinigung in das Acetat übergeführt. Man löst das Rohprodukt bei 500 in 250 ml tert.-Butanol und versetzt mit 200 ml Wasser. Die schwach trübe Lösung wird durch eine lonenaustauschersäule Amberlite IRA-400, Acetatform, die mit   50 S    tert.-Butanol vorgewaschen ist, filtriert. Anschliessend wird mit   50 %    tert.-Butanol nachgewaschen, bis Tupfproben mit Sakaguchi negativ sind.

  Man dampft das Filtrat im Vakuum bei 500 zur Trockne ein und erhält als Rückstand 49,2 g Carbo   benzoxy - L - phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-    methylester-acetat als hellbraunen Schaum. Der Rf-Wert im System 52 ist 0,83, im   Dünnschichtchromatogramm    System 101: 0,7. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung zur Hydrierung eingesetzt.



   4)   L-Phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-    methylester
49 g (63,4 mMol) Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-Larginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-acetat werden in 600 ml 90   Sigem    Methanol gelöst, mit 4,9 g 10   %Liter    Palladiumkohle versetzt und hydriert unter Absorption des Kohlendioxyds mit Kaliumhydroxyd. Nach   1 1:    Stunden sind 1130 ml Wasserstoff aufgenommen und die Hydrierung bleibt stehen. Man filtriert den Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand, 39   g    = 96   m    der Theorie gibt in der Papierchromatographie folgende Werte:
System: 52 54 56 87
Rf: 0,45 0,65 0,78 0,5
Bei der Papierelektrophorese in   ln.    Essigsäure, 7 V/cm, 5 Stunden, ist die Laufstrecke 18 cm.



   5) Carbobenzoxy-(y-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidyl   L-phenylalanyl-Uarginyl-L4ryptophyl.glycin-meffiylester   
17,12 g (34,9 mMol) Carbobenzoxy-(y-tert.-butyl) L-glutamyl-L-histidin-hydrazid (G. Nr. 7536/61 - Case 4587/1-5) in 106 ml Dimethylformamid werden auf   -5     gekühlt, dann mit 16 ml eiskalter 6n Salzsäure versetzt, und bei -5 bis   -100    tropft man 7,7 ml eiskalte 5n Natriumnitritlösung innerhalb 2-3 Minuten dazu.



  Man lässt 5 Min. bei   -5     reagieren. Hierauf gibt man unter intensivem Rühren die eiskalte frisch zubereitete Lösung von 16,3 g L-Phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-acetat (25,5 mMol) in 140 ml Dimethylformamid, enthaltend 12,03 ml N-Triäthylamin dazu. Man rührt noch 2 Stunden im Kältebad und anschliessend 15 Stunden bei   00      Man    filtriert vom auskristallisierten Salz ab und gibt zur Dimethylformamidlösung 1 Liter Essigester. Dabei scheidet sich 1,9 g mit   Triäthylamin-hydrochlorid    verunreinigte Substanz aus.



  Die filtrierte klare Lösung wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft und dann der rohe noch mit Ausgangsmaterial und Nebenprodukten verunreinigte Hexapeptidester mit viel Essigester ausgefällt.



  Die Fällung ergibt nach dem Trocknen 28 g Rohprodukt. Zur Mischung werden 27 g dieses Produktes im Gemisch Methanol-Chloroform 1: 9 (810 g) auf eine Aluminiumoxydsäule gegeben und mit 20 Liter des gleichen Lösungsmittelgemisches eluiert. Man isoliert 11 g   (41,5/0)    amorphen, im Dünnschichtchromatogramm reinen Carbobenzoxyhexapeptidester. Rf 0,3 im System 100; positive Reaktion auf Pauly, Ehrlich und Reindel-Hoppe.



   In der Niederspannungselektrophorese pH 2,4   (In    Essigsäure) bei 300 Volt zeigt der Carbobenzoxy-hexapeptidester nach einer Stunde eine Wanderungsstrecke von 15,5 cm.



  6)   Carbobe nzoxy-(y-tert.-butyl) -L-glutamyl-L-histidyl-L-       phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin   
9,6 g (8,7 mMol) Carbobenzoxy-hexapeptid-methylester werden in 150 ml 75   ,obigem    Dioxan mit 18 ml ln Natronlauge während 20 Min. bei Zimmertemperatur verseift. Während der Verseifung scheidet sich Substanz aus. Das Verseifungsgemisch wird mit 150 ml eis   kaltem    Wasser versetzt und mit 30 ml 10   Liter    Essigsäure angesäuert. Man lässt noch 30 Min. bei   0     stehen, filtriert das Carbobenzoxy-hexapeptid ab und wäscht gut mit Wasser nach. Nach dem Trocknen im Hochvakuum Ausbeute: 8 g   (90 sO    der Theorie), F. 2040 (Zers.).

  Aus der Mutterlauge lassen sich noch weitere 780 mg weniger reines Carbobenzoxy-hexapeptid erhalten, F. 1800.



   Das Carbobenzoxyhexapeptid kann aus 90 % Methanol umkristallisiert werden, F. 2060.



   Im Dünnschichtchromatogramm auf Silikagel sind die Rf-Werte: 52/0,2 und im System 101/0,75.



  7)   y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L       arginyl-L-tryptophyl-glycin.   



   7,96 g (7,36 mMol) Carbobenzoxy-(y-tert.-butyl)   L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-trypto-    phyl-glycin werden in 300 ml Essigsäure   (90 Fig)    in Gegenwart von 1,5 g   10 S    Palladiumkohlekatalysator während 5 Stunden bei Normaldruck und Zimmertemperatur hydriert. Die vom Katalysator befreite Lösung dampft man im Vakuum bei 400 zur Trockne ein. Der Rückstand wird aus MethanoVÄther umgefällt. Ausbeute: 6,9 g   Hexapeptid-y-tert.-butylester.    Das Produkt ist mit dem im Hauptpatent beschriebenen identisch.

 

   Der Hexapeptid-r-tert.-butylester kann nach dem im Hauptpatent beschriebenen Verfahren mit tert.-Butyl   oxycarbonyl - L -      seryl - L -    tyrosyl-L-seryl-L-methioninhydrazid (-azid) zum   tert . -Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-    tyrosyl - L -   seryl-L-methionyl-(y-tert.-butyl)-glutamyl-L    histidyl - L -   phenylalanyl-L-arginyüL-tryptophyl - glycin    kondensiert werden. 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH

   Verfahren nach Patentanspruch des Hauptpatentes zur Herstellung eines Dekapeptides der Formel L-Seryl L-tyrosyl- L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L- phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin durch Konden sationvontert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl- L-methionin-azid mit r-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl- L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin, dadurch gekennzeichnet, dass man das Hexapeptidderivat y-tert. Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L- tryptophyl-glycin dadurch herstellt, dass man Carbo benzoxy-Uarginin mit L-Tryptophyl-glycin-methylester kondensiert, aus dem erhaltenen Tripeptidderivat die Carbobenzoxygruppe abspaltet,

   den freien Tripeptidester mit Carbobenzoxy-L-phenylalanin kondensiert, aus dem erhaltenen Tetrapeptidester die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den freien Tetrapeptidester mit Carbo benzoxy-(#-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidin-azid kondensiert, in dem erhaltenen Carbobenzoxy-(y-tert. butyl)-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L tryptophyl-glycin-methylester die Methylestergruppe verseift und die Carbobenzoxygruppe durch Hydrierung entfernt.