Verfahren für mikrobiologische Herstellung von 17-Oxosteroiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die mikrobiologische Herstellung von 17-Oxo-steroidverbindungen.
Mit Rücksicht auf die Wichtigkeit der Steroidhormone in der Therapie ist ein jedes Verfahren, das die Überführung von billigen Steroiden pflanzlichen oder tierischen Ursprungs in ein Hormon ermöglicht, von grosser Bedeutung. Die Zersetzungsmöglichkeit der billigsten Steroide (z.B. Cholesterin, Sitosterin) wurde zum erstenmal durch die ungarische Patentschrift Nr. 148 093 erörtert, wo es bewiesen wurde, dass mit Hilfe von einfachen Zweiringverbindungen die volle Oxydation des Steroidmoleküls gehemmt werden kann.
Diese Beobachtung ist u.a durch das Verfahren verwertet, nach dem Androsta-1,4-dien-3,17-dion mit Hilfe von Mycobacterium smegmatis aus Cholest-4-en-3-on hergestellt wird.
Es wurde neuerdings bekannt, dass es amerikanischen Autoren [C. J. Sih und Mitarbeiter, J. Am. Chem. Soc.
87, 2765 (1965)] ebenso gelungen ist, mit vorteilhafter Ausbeute die Seitenkette der Cholesterin-Derivate abzubauen. Dieses Verfahren ist aber zur Herstellung der in der Industrie ausserordentlich wichtigen Steroide mit 1,4 -Dien-3,17-dion-Struktur nicht geeignet.
Während unserer Versuche über die Oxydationsfähigkeit verschiedener Mycobacterien wurde es überraschenderweise festgestellt, dass das Mycobacterium phlei die Steroide mit 1,4-Dien-3,17-dion-Struktur aus viel mehreren Steroiden verschiedener Struktur ausbilden kann.
So wurde z.B. Androsta-1,4-dien-3,17-dion aus Chole- sterin in Gegenwart von 8-Hydroxy-chinolin mit günstiger Ausbeute gewonnen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 17-Oxo-steroidverbindungen, in dem Steroidverbindungen mit einer 17,8-Seitenkette mit Kulturen eines Mycobacterium-phlei-Stammes (deponiert unter Nr. 29 am 22. September 1965 in der Stammsammlung des Institutes für Gesundheitswesen in Budapest) unter aeroben Fermentationsbedingungen, in Gegenwart von 8-Hydroxy-chinolin behandelt werden.
Von chemischem Gesichtspunkt aus ist z.B. die Umsetzung von Cholesterin zu Androsta-l,4-dien-3,l7-dion sehr kompliziert und kann auf die folgenden Reaktionsstufen zurückgeführt werden: a) Abbau der 17p-Seitenkette, Ausbildung der 17-Keto gruppe, b) Oxydation der 3B-Hydroxylgruppe zu 3-Ketogruppe, c) Isomerisation der 5,6-Doppelbindung zu 4,5-Doppel bindung, d) Ausbau der 1,2-Doppelbindung.
Nach unseren Umsetzungsversuchen erfolgen diese Reaktionen beiläufig. Zur Unterstützung dieser Feststellung wurden Cholesta-1,4-dien-3-on, Cholest-4en-3- -on, Cholest-5-en-3-on und Cholesterin mit den Kulturen des Mikroorganismus behandelt. Von allen diesen Verbindungen ist es uns gelungen, mit guter Ausbeute Andro sta-1,4-dien-3,17-dion zu gewinnen.
Es wurde ausserdem festgestellt, dass der aktive Mikroorganismus einesteils über eine bedeutende Esterase-Aktivität verfügt, z.B. stellt er aus Cholesterylacetat Androsta-1,4-dien-3,17-dion mit derselben Ausbeute her, wie aus Cholesterin; anderenteils bildet er auch im Falle von einem gesättigten A-Ring die 1,4-dien-3,17-diketo- -Struktur aus. Z.B. bildet er aus 5d-Cholestan-3,8-ol, 5a -Cholestan-3-on. bzw. 5a-Pregnan-3,20-dion mit guter Ausbeute Androsta- l,4dien-3,17-dion aus.
Diese Grundreaktionen wurden auch an anderen Steroiden mit einer Seiten kette in Stellung 17 sowie an Steroiden mit abgeänderter Grundstruktur durchgeführt.
Es wurden für diesen Zweck Experimente mit Ergosterin, Ergosta-4,22-dien-3-on, ss-Sitosterin, Stigmasterin, Cholesta-4,6-dien-3-on, Pregn-5-en-3ss-ol-20-on, Pregna-5,16 - dien - 3S - ol -20-on-3-acetat, Progesteron, 5a-Pregnan- -3,20-dion und Androsta-4,6-dien-3,17-dion durchgeführt, und es wurde festgestellt, dass mit dem Abbau der Seitenkette die 1,4-Dien-3,17-dion-Struktur in jedem Falle ausgebildet wird,
neben gleichzeitiger Sättigung der 196- -Doppelbindung im Falle von Androsta-4,6-dien, der A- -Doppelbindung im Falle von Ergosterin und der A16- -Doppelbindung im Falle von Pregna-5,16-dien-30-ol-20- -on-3-acetat.
Die erfindungsgemässe mikrobiologische Umsetzung wird mit einem Bakterienstamm durchgeführt, welcher laut Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7.
Ausgabe, 1957) als Mycobacteruim phlei identifiziert wurde. Die Bakterien bilden in der verwendeten Nährlösung sichtbare, nach dem Stehen sich ausscheidende, winzige Körnchen. Zum Wachstum ist Emulgatorsubstanz (Tween) nicht unbedingt notwendig. Die Bakterien beanspruchen reichlich Stickstoff und verhältnismässig wenig Zucker. Die Kulturen erreichen bei 37-450C den maximalen Trockensubstanzinhalt nach etwa 48 Stunden.
Es wurden die folgenden Nährlösungen für Züchtung als sehr gut geeignet gefunden: T. Maisquellwasser 12-20 g
Glukose 10 g
Leitungswasser ad 1000 ml
Die Zubereitung der Nährlösung geschieht wie folgt:
Eine 2,4-4%ige Maisquellwasserlösung wird neutralisiert und filtriert oder zentrifugiert. Die übrigen Bestandteile der Nährlösung (Glukose. fehlende Wassermenge) werden danach zugegeben. Der jeweilige Prozentgehalt des Maisquellwassers hängt von der Qualität, bzw. dem Stickstoffgehalt desselben ab.
II. Maisquellwasser 12 g
Hefeautolysatum 50 ml
Leitungswasser ad 1000 ml
Der pH-Wert wurde vor der Sterilisation auf 6,8-7,2 eingestellt. Der Hefeautolysatum wurde laut Vorschriften des Fachbuches Mikroorganismen -der Gärungsindustrie) > (7. Auflage, Hans Karl, Nürnberg 1956), Seite 527, zubereitet.
III. Maisquellwasser 5 g
Glukose 10 g
Asparagin 4g
Glutaminsäure 3 g
Leitungswasser ad 1000 ml
Der pH-Wert wurde vor der Sterilisation auf 6,8-7,2 eingestellt.
Die Nährlösungen wurden laut einer früheren ungarischen Patentschrift sterilisiert.
Die Kolbennährlösungen wurden mit von Schrägagar gewaschener Zellensuspension, der Laborfermentor hingegen mit einer eintägigen Schüttelkolben-Kultur geimpft.
Die geimpften Kolben wurden bei 370C auf einem Kreisschüttelapparat mit einer Drehzahl von 300 Umdrehungen pro Min. und einem Ausschlag von 2 cm zwei Tage lang geschüttelt. Es wurde im Fermentor bei 37-450C mit einer Drehzahl von 250 Umdrehungen pro Minute gearbeitet und ein Volumen Luft pro Liter Nährlösung und pro Minute wurde auf die Oberfläche der Kultur geblasen.
Nach zwei Tagen wurde eine entsprechende Kultur gewonnen. Es wurde kein Schaumhemmungsmittel verwendet. Die ausgewachsene Kultur wurde danach sedimentiert. Nach- der Sedimentation wurde die Nährlösung von den Zellen abgegossen, mit sterilem Wasser oder vorzugsweise mit einer 0,4%igen Natriumchloridlösung von gleicher Menge vertauscht. Erfahrungsgemäss vermindem nämlich der verbleibende Zuckergehalt und eventuell andere Komponenten der Nährlösung die Steroid-Umset zungsfähigkeft der Bakterien. Danach wurden die umzusetzenden Substanzen und 8-Hydroxy-chinolin in Alkohol, Aceton oder Dioxan gelöst und der -Kultur zugefügt. Die Steroid-Umsetzung wurde unter den bereits angegebenen Wachstumbedingungen der Bakterien nach zwei Tagen abgebrochen.
Die Fermentlösung wurde danach filtriert oder zentrifugiert, weil das entstandene 1,4-Dien-3,17- -dion im Fermentat oder in dem Oberschwimmenden zu finden ist. Die abfiltrierten Zellen sind in neuer Salzlösung zur Umsetzung nach Zugabe von Steroid und Hemmungsmittel wieder fähig.
Die Menge der im Laufe der Fermentation entstandenen, eine 1,4-Dien-3,17-dion-Struktur aufweisenden Steroide wurde wie folgt festgestellt: Die gemessene Menge des Fermentats wurde mit Dichlorethan gründlich extrahiert und nachher durch mehrmaliges Spülen mit Wasser von dem 8-Hydroxy-chinolin befreit. Der Extrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der eingedampfte Rückstand wurde in Aceton gelöst. diese Lösung auf mit Propylenglykol imprägniertem Papier getropft und anschliessend mit einem Gemisch von Tetrachlorkohlenstoff und Methylcyclohexan im Verhältnis von 1 : 1 mit absteigendem System chromatographiert. Die enstandenen Produkte geben im ultravioletten Licht eine starke Absorption.
Deshalb wurde das getrocknete Papier im Kontaktverfahren photographiert, die Flek- ke des Photos wurden auf dem Chromatogramm bezeichnet. Die entsprechenden Papierteile wurden ausgeschnitten, mit 10 ml abs. Alkohol abgelöst, und die Extinktion der Lösung bei 1 = 244 mp, gemessen. So wurde die Menge der entstandenen Produkte festgestellt.
Die Produkte wurden wie folgt gewonnen: Nach der mikrobiologischen Umsetzung wurden die Bakterienzellen durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde dreimal mit einem Chlorkohlenwasserstoff (ie 20 Volumenprozent des Filtrats) oder mit einem anderen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit verdünnter Natriumhydroxydlör sung von dem 8-Hydroxy-chinolin befreit und der Rückstand nach Eintrocknung aus einem geeigneten Lösungsmittel kristallisiert.
Beispiel I
5 Liter Nährlösung Nr. I wurden in einem Glasfermentor von 10 Liter Inhalt sterilisiert und mit 100 ml eintägiger geschüttelter Kultur von gleicher Nährlösung geimpft. Der Fermentor wurde bei 370C mit 250 Umdrehungen pro Minute gerührt und unter 5 Lit./Minute auf die Oberfläche der Kultur geblasener sterilen Luft zwei Tage inkubiert. Nachher wurde die Kultur sedimentiert und die Nährlösung mit einer 0,4%igen Natriumchloridlösung vertauscht. Dann wurden 3 g Cholesterin und 360 mg 8-Hydroxy-chinolin in 60 ml Äthanol gelöst der Kultur zugegeben.
Die Fermentation wurde unter den bereits angegebenen Wachstumbedingungen fortgesetzt und 60 Stunden hindurch wurden je 6 Stunden je 100 ml Proben entnommen. Die Proben wurden mit Dichloräthan extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit einer 1 %gen Natrium hydroxyd-Lösung vom 8 -Hydroxy-chinolin befreit, danach mit Wasser neutralisiert, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml Aceton aufgenommen. Diese Lösung wurde auf mit 40% Äthanol enthaltendem Propylenglykol imprägniertes Papier < (Macherey-Nagel Nr. 214 getropft und in einer mit Propylenglykol gesättigten Mischung von Tetrachlorkohlenstoff u. Methylcyclohexan im Verhältnis von 1:1 in absteigendem System chromatographiert.
Die Papiere wurden nach Trocknung mit Kontaktverfahren im utravioletten;Licht photographiert u. so die Stellen der Flecke bestimmt. Die entstandenen Pro dukte wurden mit 10 ml abs. Alkohol gelöst. Die Extinktion der Alkohol-Lösung wurde bei i = 244 mll bestimmt und die erhaltenen Extinktionswerte wurden unmittelbar auf Androsta- 1 ,4-dien-3 17-dion-Gehalt umgerechnet.
Die erhaltenen Werte sind wie folgt:
Zeitpunkt der Probenahme Gehalt an
Stunden Androsta-l ,4-djen-3,l7-dion
0 O eg/ml
6 42
12 90
18 149
24 162
30 190
36 191
42 202
48 238
60 229
Nach Beendingung der Umsetzung wurde der Rückstand der Fermentationslösung filtriert und das Filtrat dreimal mit je 20 Vol.% Dichloräthan extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und nach Entwässerung zur Trockne eingedampft. Eine Lösung von 1 g-0-Naphtol in 20 ml Dichloräthan wurde dem Rückstand zugegeben und 24 Stunden bei OOC gehalten.
Die kristalline Mole külverbindung Androsta-1,4-dien-3,17-dion- 0 - Naphtol wurde filtriert (F.p.: 168-1700C), in 200 ml Dichloräthan gelöst, mit 1Cr,iger wässriger Natriumhydroxydlösung von dem ass-Naphtol befreit, dann nach Spülen mit Wasser und Entwässerung zur Trockne eingedampft und aus wenig Äther kristallisiert. Die Kristalle wurden filtriert und getrocknet. Es wurden 850 mg Androsta-1 ,4-dien-3,17- -dion gewonnen (F.p.: 141-1420C; [X]D = 1150(c = 1, Chloroform): ReHa30H = 244 mjl. Aus der Mutterlauge konnten noch weitere 60 mg Androsta-l,4-dien-3,17-dion gewonnen werden. Ausbeute: 38 Gewichtsprozent.
Beispiel 2
Es wurde nach Beispiel 1 vorgegangen, mit dem
Unterschied, dass statt Cholesterin 5 g Cholest-4-en-3-on der Kultur zugefügt wurden. Die Kontrolle der Umset zung und die Aufarbeitung geschahen ebenfalls auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise. Ausbeute 40 Gewichts prozent.
Beispiel 3
Es wurde nach Beispiel 1 vorgegangen, mit dem
Unterschied, dass statt Cholesterin 3 g Sx-Cholestan-39- -ol der Kultur zugefügt wurden. Die Kontrolle der Umset zung und die Aufarbeitung geschahen ebenfalls auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise. Ausbeute: 34 Gewichts prozent.
Beispiel 4
Es wurde nach Beispiel 1 vorgegangen, mit dem
Unterschied, dass statt Cholesterin 3 g rp-sitosterin der
Kultur zugefügt wurden. Die Kontrolle der Umsetzung und die Aufarbeitung geschahen ebenfalls auf die im
Beispiel 1 beschriebene Weise. Aubeute: 18 Gewichts prozent.
Beispiel 5
Es wurde nach Beispiel 1 vorgegangen, mit dem Unterschied, dass statt Cholesterin 1 g Pregn-5-en-3,8-ol- -20-on-3-acetat der Kultur zugefügt wurde. Die Kontrolle der Umsetzung und die Aufarbeitung geschahen ebenfalls auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise. Ausbeute: 63,5 Gewichtsprozent.
Beispiel 6
Es wurde nach Beispiel 1 vorgegangen, mit dem Unterschied, dass statt Cholesterin 1 g Androst-5-en-3ss- -ol-17-on-acetat der Kultur zugfügt wurde. Die Kontrolle der Umsetzung und die Aufarbeitung geschahen ebenfalls auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise. Ausbeute: 70 Gewichtsprozent.
Beispiel 7
100 ml sterile Nährlösung III wurden mit 1 ml einer von einer fünftägigen Schrägagar-Kultur mit 10 ml Bouillon zubereiteten Zellensuspension geimpft. Das Wachsen dauerte 2 Tage bei 280C auf dem Schütteltisch. Die Kultur wurde sedimentiert und die Nährlösung mit einer 0,4%igen sterilen Natriumchloridlösung von gleicher Menge vertauscht. Der Kultur wurden 20 mg Cholesta -1,4-dien-3-on in 1 ml Äthanol und 7,2 mg 8-Hydroxy -chinolin in 0,5 ml Aceton zugefügt. Der Kolben wurde 2 Tage bei 370C geschüttelt. Die Aufarbeitung und die Steroidgehalt-Bestimmung geschahen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise. Bei einer Versuchsreihe von 10 Kolben wurden durchschnittlich 41 Gewichtsprozent Andro statt ,4-dien-3 17-dion nachgewiesen.
Beispiel 8
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-l,4-dien-3-on 5v- -Cholestan-3-on der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 38 Gewichtsprozent Androsta-1,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.
Beispiel 9
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-l,4-dien-3-on Cholest-5-en-3-on der Kultur zugfügt wurde. Es wurden 38 Gewichtsprozent Androsta-1 ,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.
Beispiel 10
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Cholest-4,6-dien-3-on der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 36 Gewichtsprozent Androsta- 1 ,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.
Beispiel 11
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Ergosterin der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 28 Gewichtsprozent Androsta-1 ,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.
Beispiel 12
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Ergo sta-4,22-dien-3-on der Kultur zugfügt wurde. Es wurden
30 Gewichtsprozent Androsta-1,4-dien-3,17-dion als Pro dukt nachgewiesen.
Beispiel 13
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Stigmasterin der Kultur zugefüht wurde. Es wurden 27 Gewichtsprozent Androsta-1,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.
Beispiel 14
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Untedschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Preg na-5,16-dien-30-ol-20-on-3-acetat der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 64 Gewichtsprozent Androsta-1,4-dien -3,17-dion als Produkt nachgewiesen.
Beispiel 15
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Progesteron der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 66 Gewichtsprozent Androsta- 1 ,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.
Beispiel 16
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Androst-4-en-3,17-dion der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 85 Gewichtsprozent Androsta-l ,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.
Beispiel 17
Es wurde unter den Fermentationsbedingungen des Beispiels 1 statt Cholesterin 1 g 11-Keto-progesteron der Kultur zugegeben. Die Menge des- entstandenen Andro sta-l,4-dien-3,l 1,17-tions wurde im wesentlichen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durch Messung der Extinktion bei 1 = 238 mq, ermittelt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Fermentlösung filtriert und das Filtrat dreimal mit je 20 Vol. % Dichloräthan extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, mit 140iger Natriumhydroxydlösung bis 8-Oxy-chinolin-frei, ferner mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen und nach Entwässerung zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wurde aus Diäthyläther kristallisiert (0,550 g), ferner nach Behandlung mit Aktivkohle aus einer Mischung von Aceton-Petroläther umkristallisiert. Es wurden 0,37 g Androsta- 1,4-dien-3,11,17-trion (37 Gewichtsprozent) erhalten; F.p.: 195 - 1960C; [u : 2350 (c = 1, Ace ton); AmBXOH = 238 m
Beispiel 18
Unter den Fermentationsbedingungen des Beispiels 1 wurde statt Cholesterin 1 g l la-Hydroxy-progesteron der Kultur zugegeben. Die Menge des entstandenen Andro sta-1,4-dien-11a-hydroxy-3,17-dions wurde im wesentlichen auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mittels bei 1 = 247 mi gemessener Extinktion bestimmt.
Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Fermentlösung filtriert und das Filtrat dreimal mit je 20 Vol.-prozent Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit einer 1%igen Natriumhydroxydlösung bis 8-Oxy -chinolin-frei und danach mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand (0,400 g) wurde aus einem Gemisch von Aceton-Äther kristallisiert. So hat man 0,180 g Androsta-1,4 dien-l la-hydroxy-3,17-dion gewonnen (18 Gewichtsprozent); F.p.: 209 - 2120C; [ ]D : 87,50 (c = 1, Chloroform); Amea,OH = 247 m,.
Process for the microbiological production of 17-oxosteroids
The invention relates to a process for the microbiological production of 17-oxo-steroid compounds.
In view of the importance of steroid hormones in therapy, any method that enables cheap steroids of vegetable or animal origin to be converted into hormones is of great importance. The possibility of decomposition of the cheapest steroids (e.g. cholesterol, sitosterol) was first discussed by the Hungarian patent specification No. 148 093, where it was proven that with the help of simple two-ring compounds the full oxidation of the steroid molecule can be inhibited.
This observation is used, among other things, by the process according to which Androsta-1,4-diene-3,17-dione is produced from Cholest-4-en-3-one with the help of Mycobacterium smegmatis.
It has recently become known that American authors [C. J. Sih et al., J. Am. Chem. Soc.
87, 2765 (1965)] has also succeeded in breaking down the side chain of the cholesterol derivatives with advantageous yield. However, this process is not suitable for the production of steroids with a 1,4-diene-3,17-dione structure, which are extremely important in industry.
During our experiments on the oxidative capacity of various mycobacteria it was surprisingly found that the Mycobacterium phlei can form the steroids with 1,4-diene-3,17-dione structure from many different steroids of different structures.
E.g. Androsta-1,4-diene-3,17-dione obtained from cholesterol in the presence of 8-hydroxyquinoline with favorable yield.
The invention relates to a process for the microbiological production of 17-oxo-steroid compounds, in which steroid compounds with a 17.8 side chain with cultures of a Mycobacterium phlei strain (deposited under no. 29 on September 22, 1965 in the collection of strains of the Institute for Health care in Budapest) under aerobic fermentation conditions, in the presence of 8-hydroxy-quinoline.
From a chemical point of view e.g. the conversion of cholesterol to androsta-l, 4-diene-3, l7-dione is very complicated and can be attributed to the following reaction stages: a) breakdown of the 17p side chain, formation of the 17-keto group, b) oxidation of the 3B- Hydroxyl group to 3-keto group, c) isomerization of the 5,6 double bond to 4,5 double bond, d) expansion of the 1,2 double bond.
According to our implementation attempts, these reactions are incidental. In support of this finding, Cholesta-1,4-dien-3-one, Cholest-4en-3-one, Cholest-5-en-3-one and cholesterol were treated with the cultures of the microorganism. From all these compounds we have succeeded in obtaining andro sta-1,4-diene-3,17-dione with good yield.
It was also found that the active microorganism, on the one hand, has significant esterase activity, e.g. he produces androsta-1,4-diene-3,17-dione from cholesteryl acetate with the same yield as from cholesterol; on the other hand, it also forms the 1,4-diene-3,17-diketo structure in the case of a saturated A-ring. E.g. it forms from 5d-cholestan-3,8-ol, 5a-cholestan-3-one. or 5a-pregnane-3,20-dione with good yields from androstal, 4diene-3,17-dione.
These basic reactions were also carried out on other steroids with a side chain in position 17 and on steroids with a modified basic structure.
For this purpose, experiments were carried out with ergosterol, ergosta-4,22-dien-3-one, ss-sitosterol, stigmasterin, Cholesta-4,6-dien-3-one, pregnant-5-en-3ss-ol-20 -on, pregna-5,16-diene-3S-ol -20-on-3-acetate, progesterone, 5a-pregnan-3,20-dione and androsta-4,6-diene-3,17-dione , and it was found that the 1,4-diene-3,17-dione structure is formed in each case with the degradation of the side chain,
in addition to simultaneous saturation of the 196- double bond in the case of androsta-4,6-diene, the A- double bond in the case of ergosterol and the A16- double bond in the case of pregna-5,16-dien-30-ol-20 - -one-3-acetate.
The microbiological conversion according to the invention is carried out with a bacterial strain which, according to Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7.
Edition, 1957) was identified as Mycobacteruim phlei. The bacteria form visible, tiny granules in the nutrient solution used, which are excreted after standing. Emulsifier substance (Tween) is not absolutely necessary for growth. The bacteria require plenty of nitrogen and relatively little sugar. At 37-450C the cultures reach their maximum dry matter content after about 48 hours.
The following nutrient solutions have been found to be very suitable for breeding: T. corn steep water 12-20 g
Glucose 10 g
Tap water to 1000 ml
The nutrient solution is prepared as follows:
A 2.4-4% corn steep liquor solution is neutralized and filtered or centrifuged. The remaining components of the nutrient solution (glucose, missing amount of water) are then added. The respective percentage of the corn steep water depends on the quality or the nitrogen content of the same.
II. Corn steep water 12 g
Yeast autolysate 50 ml
Tap water to 1000 ml
The pH was adjusted to 6.8-7.2 before sterilization. The yeast autolysate was prepared according to the instructions in the textbook Microorganisms - the fermentation industry)> (7th edition, Hans Karl, Nuremberg 1956), page 527.
III. Corn steep water 5 g
Glucose 10 g
Asparagine 4g
Glutamic acid 3 g
Tap water to 1000 ml
The pH was adjusted to 6.8-7.2 before sterilization.
The nutrient solutions were sterilized according to an earlier Hungarian patent specification.
The flask nutrient solutions were inoculated with cell suspension washed from slant agar, whereas the laboratory fermentor was inoculated with a one-day shake flask culture.
The inoculated flasks were shaken at 37 ° C. on a rotary shaker at a speed of 300 revolutions per minute and a deflection of 2 cm for two days. It was worked in the fermentor at 37-450C at a speed of 250 revolutions per minute and a volume of air per liter of nutrient solution and per minute was blown onto the surface of the culture.
A corresponding culture was obtained after two days. No foam inhibitor was used. The adult culture was then sedimented. After sedimentation, the nutrient solution was poured off the cells, exchanged with sterile water or preferably with a 0.4% sodium chloride solution of the same amount. Experience has shown that the remaining sugar content and possibly other components of the nutrient solution reduce the steroid conversion capacity of the bacteria. The substances to be reacted and 8-hydroxy-quinoline were then dissolved in alcohol, acetone or dioxane and added to the culture. The steroid conversion was terminated after two days under the growth conditions of the bacteria already specified.
The fermentation solution was then filtered or centrifuged because the 1,4-diene-3,17- dione formed can be found in the fermentate or in the upper swimming pool. The filtered cells are able to react again in new saline solution after the addition of steroid and inhibitors.
The amount of steroids with a 1,4-diene-3,17-dione structure formed in the course of the fermentation was determined as follows: The measured amount of the fermentate was extracted thoroughly with dichloroethane and then removed from the 8th by rinsing several times with water -Hydroxy-quinoline exempt. The extract was dried with anhydrous sodium sulfate and evaporated. The evaporated residue was dissolved in acetone. this solution was dripped onto paper impregnated with propylene glycol and then chromatographed with a mixture of carbon tetrachloride and methylcyclohexane in a ratio of 1: 1 with a descending system. The resulting products give strong absorption in ultraviolet light.
For this reason, the dried paper was photographed using the contact method, and the spots on the photo were marked on the chromatogram. The corresponding pieces of paper were cut out, with 10 ml abs. Alcohol removed, and the extinction of the solution at 1 = 244 mp, measured. In this way, the amount of the resulting products was determined.
The products were obtained as follows: After the microbiological conversion, the bacterial cells were removed by filtration. The filtrate was extracted three times with a chlorinated hydrocarbon (ie 20 percent by volume of the filtrate) or with another water-immiscible solvent. The combined extracts were freed from the 8-hydroxyquinoline with dilute sodium hydroxide solution and the residue was crystallized from a suitable solvent after drying.
Example I.
5 liters of nutrient solution No. I were sterilized in a 10 liter glass fermentor and inoculated with 100 ml of culture shaken for one day of the same nutrient solution. The fermentor was stirred at 370C at 250 revolutions per minute and incubated for two days at 5 liters / minute on the surface of the culture with blown sterile air. The culture was then sedimented and the nutrient solution was exchanged for a 0.4% sodium chloride solution. Then 3 g of cholesterol and 360 mg of 8-hydroxy-quinoline dissolved in 60 ml of ethanol were added to the culture.
The fermentation was continued under the growth conditions already given, and 100 ml samples were taken for 60 hours every 6 hours. The samples were extracted with dichloroethane. The combined extracts were freed from 8-hydroxyquinoline with a 1% sodium hydroxide solution, then neutralized with water, dried with anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness. The residue was taken up in 5 ml of acetone. This solution was dropped onto paper impregnated with 40% ethanol containing propylene glycol (Macherey-Nagel No. 214 and chromatographed in a descending system in a mixture of carbon tetrachloride and methylcyclohexane saturated with propylene glycol in a ratio of 1: 1.
After drying, the papers were photographed using ultraviolet light contact methods and the like. thus determined the places of the spots. The resulting pro products were abs with 10 ml. Alcohol dissolved. The extinction of the alcohol solution was determined at i = 244 ml and the extinction values obtained were immediately converted to the androsta-1,4-diene-3, 17-dione content.
The values obtained are as follows:
Time of sampling content
Hours of Androsta-1, 4-djen-3, l7-dione
0 O eg / ml
6 42
12 90
18 149
24 162
30 190
36 191
42 202
48 238
60 229
When the reaction had ended, the residue from the fermentation solution was filtered and the filtrate was extracted three times with 20% by volume of dichloroethane each time. The extracts were combined and, after dehydration, evaporated to dryness. A solution of 1 g of 0-naphthol in 20 ml of dichloroethane was added to the residue and kept at OOC for 24 hours.
The crystalline Molecular compound Androsta-1,4-diene-3,17-dione-0 - naphthol was filtered (melting point: 168-1700C), dissolved in 200 ml of dichloroethane, freed from the ass-naphthol with 1Cr, aqueous sodium hydroxide solution, then after rinsing with water and dehydration, evaporated to dryness and crystallized from a little ether. The crystals were filtered and dried. 850 mg of androsta-1,4-diene-3,17- dione were obtained (mp: 141-1420C; [X] D = 1150 (c = 1, chloroform): ReHa30H = 244 ml. From the mother liquor a further 60 mg of androsta-1,4-diene-3,17-dione are obtained, yield: 38 percent by weight.
Example 2
The procedure was as in Example 1, with the
The difference is that instead of cholesterol, 5 g of Cholest-4-en-3-one were added to the culture. The control of the implementation and the work-up were also carried out in the manner described in Example 1. Yield 40 weight percent.
Example 3
The procedure was as in Example 1, with the
The difference is that instead of cholesterol, 3 g of Sx-Cholestan-39- -ol were added to the culture. The control of the implementation and the work-up were also carried out in the manner described in Example 1. Yield: 34 weight percent.
Example 4
The procedure was as in Example 1, with the
Difference that instead of cholesterol 3 g rp-sitosterol the
Culture were added. The control of the implementation and the processing were also carried out on the im
Example 1 described manner. Yield: 18 percent by weight.
Example 5
The procedure was as in Example 1, with the difference that, instead of cholesterol, 1 g of pregn-5-en-3,8-ol-20-one-3-acetate was added to the culture. The control of the reaction and the work-up were also carried out in the manner described in Example 1. Yield: 63.5 percent by weight.
Example 6
The procedure was as in Example 1, with the difference that, instead of cholesterol, 1 g of androst-5-en-3ss-ol-17-one acetate was added to the culture. The control of the reaction and the work-up were also carried out in the manner described in Example 1. Yield: 70 percent by weight.
Example 7
100 ml of sterile nutrient solution III were inoculated with 1 ml of a cell suspension prepared from a five-day agar slant culture with 10 ml of broth. Waxing took 2 days at 280C on the shaker table. The culture was sedimented and the nutrient solution was exchanged with a 0.4% sterile sodium chloride solution of the same amount. 20 mg of Cholesta -1,4-dien-3-one in 1 ml of ethanol and 7.2 mg of 8-hydroxyquinoline in 0.5 ml of acetone were added to the culture. The flask was shaken at 37 ° C. for 2 days. The work-up and the determination of the steroid content were carried out in the manner described in Example 1. In a test series of 10 flasks, an average of 41 percent by weight andro instead of 4-diene-3 17-dione was detected.
Example 8
The procedure was as in Example 7, but with the difference that instead of Cholesta-1,4-dien-3-one, 5v-cholestan-3-one was added to the culture. 38 percent by weight androsta-1,4-diene-3,17-dione were detected as the product.
Example 9
The procedure was as in Example 7, but with the difference that instead of Cholesta-1,4-dien-3-one, Cholest-5-en-3-one was added to the culture. 38 percent by weight of Androsta-1,4-diene-3,17-dione were detected as the product.
Example 10
The procedure was as in Example 7, but with the difference that instead of Cholesta-1,4-dien-3-one, Cholest-4,6-dien-3-one was added to the culture. 36 percent by weight androsta-1,4-diene-3,17-dione were detected as the product.
Example 11
The procedure was as in Example 7, but with the difference that instead of Cholesta-1,4-dien-3-one, ergosterol was added to the culture. 28 percent by weight of Androsta-1,4-diene-3,17-dione were detected as the product.
Example 12
The procedure was as in Example 7, but with the difference that instead of Cholesta-1,4-dien-3-one, Ergo sta-4,22-dien-3-one was added to the culture. There were
30 percent by weight androsta-1,4-diene-3,17-dione detected as a product.
Example 13
The procedure was as in Example 7, but with the difference that instead of Cholesta-1,4-dien-3-one, stigmasterin was added to the culture. 27 percent by weight of androsta-1,4-diene-3,17-dione was detected as the product.
Example 14
The procedure was as in Example 7, but with the difference that instead of Cholesta-1,4-dien-3-one, Preg na-5,16-dien-30-ol-20-one-3-acetate was added to the culture. 64 percent by weight of androsta-1,4-diene -3,17-dione was detected as the product.
Example 15
The procedure was as in Example 7, but with the difference that instead of Cholesta-1,4-dien-3-one, progesterone was added to the culture. 66 percent by weight of androsta-1,4-diene-3,17-dione were detected as the product.
Example 16
The procedure was as in Example 7, but with the difference that instead of Cholesta-1,4-dien-3-one androst-4-ene-3,17-dione was added to the culture. 85 percent by weight of androsta-1,4-diene-3,17-dione was detected as the product.
Example 17
Under the fermentation conditions of Example 1, 1 g of 11-keto-progesterone was added to the culture instead of cholesterol. The amount of Andro sta-l, 4-diene-3, l 1,17-ions formed was determined essentially in the manner described in Example 1 by measuring the extinction at 1 = 238 mq. After the reaction had ended, the fermentation solution was filtered and the filtrate was extracted three times with 20% by volume of dichloroethane each time. The extracts were combined, washed to 8-oxy-quinoline-free with 140% sodium hydroxide solution, furthermore with water until neutral and, after dehydration, evaporated to dryness.
The residue was crystallized from diethyl ether (0.550 g), furthermore recrystallized from a mixture of acetone-petroleum ether after treatment with activated charcoal. 0.37 g of androsta-1,4-diene-3,11,17-trione (37 percent by weight) were obtained; M.p .: 195-1960C; [u: 2350 (c = 1, Ace ton); AmBXOH = 238 m
Example 18
Under the fermentation conditions of Example 1, 1 g of 1 la-hydroxy-progesterone was added to the culture instead of cholesterol. The amount of andro sta-1,4-diene-11a-hydroxy-3,17-dione formed was determined essentially in the manner described in Example 1 by means of absorbance measured at 1 = 247 ml.
After the reaction had ended, the fermentation solution was filtered and the filtrate was extracted three times with 20 percent by volume of ethyl acetate each time. The combined extracts were washed to 8-oxyquinoline-free with a 1% sodium hydroxide solution and then washed with water until the reaction was neutral and evaporated to dryness. The residue (0.400 g) was crystallized from a mixture of acetone-ether. So 0.180 g of Androsta-1,4-diene-1 la-hydroxy-3,17-dione was obtained (18 percent by weight); M.p .: 209-2120C; [] D: 87.50 (c = 1, chloroform); Amea, OH = 247 m ,.