CH497403A

CH497403A - Verfahren für mikrobiologische Herstellung von 17-Oxosteroiden

Info

Publication number: CH497403A
Application number: CH1327066A
Authority: CH
Inventors: Gyorgy Dr Wix; Kalman Dr Buki; Gabor Dr Ambrus
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1965-09-23
Filing date: 1966-09-13
Publication date: 1970-10-15
Also published as: GB1158866A; AT272540B; DE1593327A1; NL6613208A; DK115177B

Description

Verfahren für mikrobiologische Herstellung von 17-Oxosteroiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die mikrobiologische Herstellung von 17-Oxo-steroidverbindungen.

Mit Rücksicht auf die Wichtigkeit der Steroidhormone in der Therapie ist ein jedes Verfahren, das die Überführung von billigen Steroiden pflanzlichen oder tierischen Ursprungs in ein Hormon ermöglicht, von grosser Bedeutung. Die Zersetzungsmöglichkeit der billigsten Steroide (z.B. Cholesterin, Sitosterin) wurde zum erstenmal durch die ungarische Patentschrift Nr. 148 093 erörtert, wo es bewiesen wurde, dass mit Hilfe von einfachen Zweiringverbindungen die volle Oxydation des Steroidmoleküls gehemmt werden kann.

Diese Beobachtung ist u.a durch das Verfahren verwertet, nach dem Androsta-1,4-dien-3,17-dion mit Hilfe von Mycobacterium smegmatis aus Cholest-4-en-3-on hergestellt wird.

Es wurde neuerdings bekannt, dass es amerikanischen Autoren [C. J. Sih und Mitarbeiter, J. Am. Chem. Soc.

87, 2765 (1965)] ebenso gelungen ist, mit vorteilhafter Ausbeute die Seitenkette der Cholesterin-Derivate abzubauen. Dieses Verfahren ist aber zur Herstellung der in der Industrie ausserordentlich wichtigen Steroide mit 1,4 -Dien-3,17-dion-Struktur nicht geeignet.

Während unserer Versuche über die Oxydationsfähigkeit verschiedener Mycobacterien wurde es überraschenderweise festgestellt, dass das Mycobacterium phlei die Steroide mit 1,4-Dien-3,17-dion-Struktur aus viel mehreren Steroiden verschiedener Struktur ausbilden kann.

So wurde z.B. Androsta-1,4-dien-3,17-dion aus Chole- sterin in Gegenwart von 8-Hydroxy-chinolin mit günstiger Ausbeute gewonnen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 17-Oxo-steroidverbindungen, in dem Steroidverbindungen mit einer 17,8-Seitenkette mit Kulturen eines Mycobacterium-phlei-Stammes (deponiert unter Nr. 29 am 22. September 1965 in der Stammsammlung des Institutes für Gesundheitswesen in Budapest) unter aeroben Fermentationsbedingungen, in Gegenwart von 8-Hydroxy-chinolin behandelt werden.

Von chemischem Gesichtspunkt aus ist z.B. die Umsetzung von Cholesterin zu Androsta-l,4-dien-3,l7-dion sehr kompliziert und kann auf die folgenden Reaktionsstufen zurückgeführt werden: a) Abbau der 17p-Seitenkette, Ausbildung der 17-Keto gruppe, b) Oxydation der 3B-Hydroxylgruppe zu 3-Ketogruppe, c) Isomerisation der 5,6-Doppelbindung zu 4,5-Doppel bindung, d) Ausbau der 1,2-Doppelbindung.

Nach unseren Umsetzungsversuchen erfolgen diese Reaktionen beiläufig. Zur Unterstützung dieser Feststellung wurden Cholesta-1,4-dien-3-on, Cholest-4en-3- -on, Cholest-5-en-3-on und Cholesterin mit den Kulturen des Mikroorganismus behandelt. Von allen diesen Verbindungen ist es uns gelungen, mit guter Ausbeute Andro sta-1,4-dien-3,17-dion zu gewinnen.

Es wurde ausserdem festgestellt, dass der aktive Mikroorganismus einesteils über eine bedeutende Esterase-Aktivität verfügt, z.B. stellt er aus Cholesterylacetat Androsta-1,4-dien-3,17-dion mit derselben Ausbeute her, wie aus Cholesterin; anderenteils bildet er auch im Falle von einem gesättigten A-Ring die 1,4-dien-3,17-diketo- -Struktur aus. Z.B. bildet er aus 5d-Cholestan-3,8-ol, 5a -Cholestan-3-on. bzw. 5a-Pregnan-3,20-dion mit guter Ausbeute Androsta- l,4dien-3,17-dion aus.

Diese Grundreaktionen wurden auch an anderen Steroiden mit einer Seiten kette in Stellung 17 sowie an Steroiden mit abgeänderter Grundstruktur durchgeführt.

Es wurden für diesen Zweck Experimente mit Ergosterin, Ergosta-4,22-dien-3-on, ss-Sitosterin, Stigmasterin, Cholesta-4,6-dien-3-on, Pregn-5-en-3ss-ol-20-on, Pregna-5,16 - dien - 3S - ol -20-on-3-acetat, Progesteron, 5a-Pregnan- -3,20-dion und Androsta-4,6-dien-3,17-dion durchgeführt, und es wurde festgestellt, dass mit dem Abbau der Seitenkette die 1,4-Dien-3,17-dion-Struktur in jedem Falle ausgebildet wird,

neben gleichzeitiger Sättigung der 196- -Doppelbindung im Falle von Androsta-4,6-dien, der A- -Doppelbindung im Falle von Ergosterin und der A16- -Doppelbindung im Falle von Pregna-5,16-dien-30-ol-20- -on-3-acetat.

Die erfindungsgemässe mikrobiologische Umsetzung wird mit einem Bakterienstamm durchgeführt, welcher laut Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7.

Ausgabe, 1957) als Mycobacteruim phlei identifiziert wurde. Die Bakterien bilden in der verwendeten Nährlösung sichtbare, nach dem Stehen sich ausscheidende, winzige Körnchen. Zum Wachstum ist Emulgatorsubstanz (Tween) nicht unbedingt notwendig. Die Bakterien beanspruchen reichlich Stickstoff und verhältnismässig wenig Zucker. Die Kulturen erreichen bei 37-450C den maximalen Trockensubstanzinhalt nach etwa 48 Stunden.

Es wurden die folgenden Nährlösungen für Züchtung als sehr gut geeignet gefunden: T. Maisquellwasser 12-20 g
Glukose 10 g
Leitungswasser ad 1000 ml
Die Zubereitung der Nährlösung geschieht wie folgt:
Eine 2,4-4%ige Maisquellwasserlösung wird neutralisiert und filtriert oder zentrifugiert. Die übrigen Bestandteile der Nährlösung (Glukose. fehlende Wassermenge) werden danach zugegeben. Der jeweilige Prozentgehalt des Maisquellwassers hängt von der Qualität, bzw. dem Stickstoffgehalt desselben ab.

II. Maisquellwasser 12 g
Hefeautolysatum 50 ml
Leitungswasser ad 1000 ml
Der pH-Wert wurde vor der Sterilisation auf 6,8-7,2 eingestellt. Der Hefeautolysatum wurde laut Vorschriften des Fachbuches Mikroorganismen -der Gärungsindustrie) > (7. Auflage, Hans Karl, Nürnberg 1956), Seite 527, zubereitet.

III. Maisquellwasser 5 g
Glukose 10 g
Asparagin 4g
Glutaminsäure 3 g
Leitungswasser ad 1000 ml
Der pH-Wert wurde vor der Sterilisation auf 6,8-7,2 eingestellt.

Die Nährlösungen wurden laut einer früheren ungarischen Patentschrift sterilisiert.

Die Kolbennährlösungen wurden mit von Schrägagar gewaschener Zellensuspension, der Laborfermentor hingegen mit einer eintägigen Schüttelkolben-Kultur geimpft.

Die geimpften Kolben wurden bei 370C auf einem Kreisschüttelapparat mit einer Drehzahl von 300 Umdrehungen pro Min. und einem Ausschlag von 2 cm zwei Tage lang geschüttelt. Es wurde im Fermentor bei 37-450C mit einer Drehzahl von 250 Umdrehungen pro Minute gearbeitet und ein Volumen Luft pro Liter Nährlösung und pro Minute wurde auf die Oberfläche der Kultur geblasen.

Nach zwei Tagen wurde eine entsprechende Kultur gewonnen. Es wurde kein Schaumhemmungsmittel verwendet. Die ausgewachsene Kultur wurde danach sedimentiert. Nach- der Sedimentation wurde die Nährlösung von den Zellen abgegossen, mit sterilem Wasser oder vorzugsweise mit einer 0,4%igen Natriumchloridlösung von gleicher Menge vertauscht. Erfahrungsgemäss vermindem nämlich der verbleibende Zuckergehalt und eventuell andere Komponenten der Nährlösung die Steroid-Umset zungsfähigkeft der Bakterien. Danach wurden die umzusetzenden Substanzen und 8-Hydroxy-chinolin in Alkohol, Aceton oder Dioxan gelöst und der -Kultur zugefügt. Die Steroid-Umsetzung wurde unter den bereits angegebenen Wachstumbedingungen der Bakterien nach zwei Tagen abgebrochen.

Die Fermentlösung wurde danach filtriert oder zentrifugiert, weil das entstandene 1,4-Dien-3,17- -dion im Fermentat oder in dem Oberschwimmenden zu finden ist. Die abfiltrierten Zellen sind in neuer Salzlösung zur Umsetzung nach Zugabe von Steroid und Hemmungsmittel wieder fähig.

Die Menge der im Laufe der Fermentation entstandenen, eine 1,4-Dien-3,17-dion-Struktur aufweisenden Steroide wurde wie folgt festgestellt: Die gemessene Menge des Fermentats wurde mit Dichlorethan gründlich extrahiert und nachher durch mehrmaliges Spülen mit Wasser von dem 8-Hydroxy-chinolin befreit. Der Extrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der eingedampfte Rückstand wurde in Aceton gelöst. diese Lösung auf mit Propylenglykol imprägniertem Papier getropft und anschliessend mit einem Gemisch von Tetrachlorkohlenstoff und Methylcyclohexan im Verhältnis von 1 : 1 mit absteigendem System chromatographiert. Die enstandenen Produkte geben im ultravioletten Licht eine starke Absorption.

Deshalb wurde das getrocknete Papier im Kontaktverfahren photographiert, die Flek- ke des Photos wurden auf dem Chromatogramm bezeichnet. Die entsprechenden Papierteile wurden ausgeschnitten, mit 10 ml abs. Alkohol abgelöst, und die Extinktion der Lösung bei 1 = 244 mp, gemessen. So wurde die Menge der entstandenen Produkte festgestellt.

Die Produkte wurden wie folgt gewonnen: Nach der mikrobiologischen Umsetzung wurden die Bakterienzellen durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde dreimal mit einem Chlorkohlenwasserstoff (ie 20 Volumenprozent des Filtrats) oder mit einem anderen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit verdünnter Natriumhydroxydlör sung von dem 8-Hydroxy-chinolin befreit und der Rückstand nach Eintrocknung aus einem geeigneten Lösungsmittel kristallisiert.

Beispiel I
5 Liter Nährlösung Nr. I wurden in einem Glasfermentor von 10 Liter Inhalt sterilisiert und mit 100 ml eintägiger geschüttelter Kultur von gleicher Nährlösung geimpft. Der Fermentor wurde bei 370C mit 250 Umdrehungen pro Minute gerührt und unter 5 Lit./Minute auf die Oberfläche der Kultur geblasener sterilen Luft zwei Tage inkubiert. Nachher wurde die Kultur sedimentiert und die Nährlösung mit einer 0,4%igen Natriumchloridlösung vertauscht. Dann wurden 3 g Cholesterin und 360 mg 8-Hydroxy-chinolin in 60 ml Äthanol gelöst der Kultur zugegeben.

Die Fermentation wurde unter den bereits angegebenen Wachstumbedingungen fortgesetzt und 60 Stunden hindurch wurden je 6 Stunden je 100 ml Proben entnommen. Die Proben wurden mit Dichloräthan extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit einer 1 %gen Natrium hydroxyd-Lösung vom 8 -Hydroxy-chinolin befreit, danach mit Wasser neutralisiert, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml Aceton aufgenommen. Diese Lösung wurde auf mit 40% Äthanol enthaltendem Propylenglykol imprägniertes Papier < (Macherey-Nagel Nr. 214 getropft und in einer mit Propylenglykol gesättigten Mischung von Tetrachlorkohlenstoff u. Methylcyclohexan im Verhältnis von 1:1 in absteigendem System chromatographiert.

Die Papiere wurden nach Trocknung mit Kontaktverfahren im utravioletten;Licht photographiert u. so die Stellen der Flecke bestimmt. Die entstandenen Pro dukte wurden mit 10 ml abs. Alkohol gelöst. Die Extinktion der Alkohol-Lösung wurde bei i = 244 mll bestimmt und die erhaltenen Extinktionswerte wurden unmittelbar auf Androsta- 1 ,4-dien-3 17-dion-Gehalt umgerechnet.

Die erhaltenen Werte sind wie folgt:
Zeitpunkt der Probenahme Gehalt an
Stunden Androsta-l ,4-djen-3,l7-dion
0 O eg/ml
6 42
12 90
18 149
24 162
30 190
36 191
42 202
48 238
60 229
Nach Beendingung der Umsetzung wurde der Rückstand der Fermentationslösung filtriert und das Filtrat dreimal mit je 20 Vol.% Dichloräthan extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und nach Entwässerung zur Trockne eingedampft. Eine Lösung von 1 g-0-Naphtol in 20 ml Dichloräthan wurde dem Rückstand zugegeben und 24 Stunden bei OOC gehalten.

Die kristalline Mole külverbindung Androsta-1,4-dien-3,17-dion- 0 - Naphtol wurde filtriert (F.p.: 168-1700C), in 200 ml Dichloräthan gelöst, mit 1Cr,iger wässriger Natriumhydroxydlösung von dem ass-Naphtol befreit, dann nach Spülen mit Wasser und Entwässerung zur Trockne eingedampft und aus wenig Äther kristallisiert. Die Kristalle wurden filtriert und getrocknet. Es wurden 850 mg Androsta-1 ,4-dien-3,17- -dion gewonnen (F.p.: 141-1420C; [X]D = 1150(c = 1, Chloroform): ReHa30H = 244 mjl. Aus der Mutterlauge konnten noch weitere 60 mg Androsta-l,4-dien-3,17-dion gewonnen werden. Ausbeute: 38 Gewichtsprozent.

Beispiel 2
Es wurde nach Beispiel 1 vorgegangen, mit dem
Unterschied, dass statt Cholesterin 5 g Cholest-4-en-3-on der Kultur zugefügt wurden. Die Kontrolle der Umset zung und die Aufarbeitung geschahen ebenfalls auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise. Ausbeute 40 Gewichts prozent.

Beispiel 3
Es wurde nach Beispiel 1 vorgegangen, mit dem
Unterschied, dass statt Cholesterin 3 g Sx-Cholestan-39- -ol der Kultur zugefügt wurden. Die Kontrolle der Umset zung und die Aufarbeitung geschahen ebenfalls auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise. Ausbeute: 34 Gewichts prozent.

Beispiel 4
Es wurde nach Beispiel 1 vorgegangen, mit dem
Unterschied, dass statt Cholesterin 3 g rp-sitosterin der
Kultur zugefügt wurden. Die Kontrolle der Umsetzung und die Aufarbeitung geschahen ebenfalls auf die im
Beispiel 1 beschriebene Weise. Aubeute: 18 Gewichts prozent.

Beispiel 5
Es wurde nach Beispiel 1 vorgegangen, mit dem Unterschied, dass statt Cholesterin 1 g Pregn-5-en-3,8-ol- -20-on-3-acetat der Kultur zugefügt wurde. Die Kontrolle der Umsetzung und die Aufarbeitung geschahen ebenfalls auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise. Ausbeute: 63,5 Gewichtsprozent.

Beispiel 6
Es wurde nach Beispiel 1 vorgegangen, mit dem Unterschied, dass statt Cholesterin 1 g Androst-5-en-3ss- -ol-17-on-acetat der Kultur zugfügt wurde. Die Kontrolle der Umsetzung und die Aufarbeitung geschahen ebenfalls auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise. Ausbeute: 70 Gewichtsprozent.

Beispiel 7
100 ml sterile Nährlösung III wurden mit 1 ml einer von einer fünftägigen Schrägagar-Kultur mit 10 ml Bouillon zubereiteten Zellensuspension geimpft. Das Wachsen dauerte 2 Tage bei 280C auf dem Schütteltisch. Die Kultur wurde sedimentiert und die Nährlösung mit einer 0,4%igen sterilen Natriumchloridlösung von gleicher Menge vertauscht. Der Kultur wurden 20 mg Cholesta -1,4-dien-3-on in 1 ml Äthanol und 7,2 mg 8-Hydroxy -chinolin in 0,5 ml Aceton zugefügt. Der Kolben wurde 2 Tage bei 370C geschüttelt. Die Aufarbeitung und die Steroidgehalt-Bestimmung geschahen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise. Bei einer Versuchsreihe von 10 Kolben wurden durchschnittlich 41 Gewichtsprozent Andro statt ,4-dien-3 17-dion nachgewiesen.

Beispiel 8
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-l,4-dien-3-on 5v- -Cholestan-3-on der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 38 Gewichtsprozent Androsta-1,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.

Beispiel 9
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-l,4-dien-3-on Cholest-5-en-3-on der Kultur zugfügt wurde. Es wurden 38 Gewichtsprozent Androsta-1 ,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.

Beispiel 10
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Cholest-4,6-dien-3-on der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 36 Gewichtsprozent Androsta- 1 ,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.

Beispiel 11
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Ergosterin der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 28 Gewichtsprozent Androsta-1 ,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.

Beispiel 12
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Ergo sta-4,22-dien-3-on der Kultur zugfügt wurde. Es wurden
30 Gewichtsprozent Androsta-1,4-dien-3,17-dion als Pro dukt nachgewiesen.

Beispiel 13
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Stigmasterin der Kultur zugefüht wurde. Es wurden 27 Gewichtsprozent Androsta-1,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.

Beispiel 14
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Untedschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Preg na-5,16-dien-30-ol-20-on-3-acetat der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 64 Gewichtsprozent Androsta-1,4-dien -3,17-dion als Produkt nachgewiesen.

Beispiel 15
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Progesteron der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 66 Gewichtsprozent Androsta- 1 ,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.

Beispiel 16
Es wurde nach Beispiel 7 vorgegangen, jedoch mit dem Unterschied, dass statt Cholesta-1,4-dien-3-on Androst-4-en-3,17-dion der Kultur zugefügt wurde. Es wurden 85 Gewichtsprozent Androsta-l ,4-dien-3,17-dion als Produkt nachgewiesen.

Beispiel 17
Es wurde unter den Fermentationsbedingungen des Beispiels 1 statt Cholesterin 1 g 11-Keto-progesteron der Kultur zugegeben. Die Menge des- entstandenen Andro sta-l,4-dien-3,l 1,17-tions wurde im wesentlichen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durch Messung der Extinktion bei 1 = 238 mq, ermittelt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Fermentlösung filtriert und das Filtrat dreimal mit je 20 Vol. % Dichloräthan extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, mit 140iger Natriumhydroxydlösung bis 8-Oxy-chinolin-frei, ferner mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen und nach Entwässerung zur Trockne eingedampft.

Der Rückstand wurde aus Diäthyläther kristallisiert (0,550 g), ferner nach Behandlung mit Aktivkohle aus einer Mischung von Aceton-Petroläther umkristallisiert. Es wurden 0,37 g Androsta- 1,4-dien-3,11,17-trion (37 Gewichtsprozent) erhalten; F.p.: 195 - 1960C; [u : 2350 (c = 1, Ace ton); AmBXOH = 238 m
Beispiel 18
Unter den Fermentationsbedingungen des Beispiels 1 wurde statt Cholesterin 1 g l la-Hydroxy-progesteron der Kultur zugegeben. Die Menge des entstandenen Andro sta-1,4-dien-11a-hydroxy-3,17-dions wurde im wesentlichen auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise mittels bei 1 = 247 mi gemessener Extinktion bestimmt.

Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Fermentlösung filtriert und das Filtrat dreimal mit je 20 Vol.-prozent Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit einer 1%igen Natriumhydroxydlösung bis 8-Oxy -chinolin-frei und danach mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand (0,400 g) wurde aus einem Gemisch von Aceton-Äther kristallisiert. So hat man 0,180 g Androsta-1,4 dien-l la-hydroxy-3,17-dion gewonnen (18 Gewichtsprozent); F.p.: 209 - 2120C; [ ]D : 87,50 (c = 1, Chloroform); Amea,OH = 247 m,.

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 17 -Oxo-steroidverbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass Steroid-Verbindungen mit einer 170-Seitenkette mit Kulturen eines Mycobacterium-phlei-Stammes in Gegenwart von 8-Hydroxy-chinolin unter aeroben Fermentationsbedingungen behandelt werden.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial ein Steroid mit einer 2-10 Kohlenstoffatome enthaltenden Seitenkette in 17p- Stellung verwendet wird.

2. Verfahren nach Patentanspruch oder nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Seitenkette des als Ausgangsmaterial verwendeten Steroids auch Sauerstoff enthält.

3.Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das als Ausgangsmaterial verwendete Steroid an dem Kohlenstoffatom der Stellung 3 eine Hydroxyl-Acyloxy- oder Ketogruppe enthält.