Verfahren zur Anreicherung von L-Asparaginase
L-Asparaginase in Form eines mehr oder weniger rohen Enzympräparates ist bekannt. Sie wurde nach gebäuchlichen Methoden der Enzymchemie aus tierischen oder pflanzlichen Materialien extrahiert und angereichert. Das Enzym spaltet die Amidbindung im L-Asparagin, wobei L-Asparaginsäure und Ammoniak entstehen. Man kann das Ammoniak mit Nesslers Reagens colorimetrisch bestimmen und hat dadurch eine Messmethode für L-Asparaginase [Cancer Research 26, 2213-17 (1966)].
Da die L-Asparaginase-Einheit noch nicht völlig übereinstimmend definiert worden ist, soll sie hier wie folgt festgelegt werden:
Eine Einheit (30-Minuteneinheit) L-Asparaginase ist diejenige Menge, die bei 370 C und bei pH 7,2 während 30 Minuten ein , Mol Ammoniak aus L-Asparagin abspaltet. Soweit aus der Literatur ersichtlich, sind bisher L-Asparaginase-Präparate beschrieben worden, welche maximal zirka 1000 E/mg enthalten [Biochemistry 6, 721(1967)].
Die Herstellung erfolgt u.a. aus E. coli-Zellen, aus denen man das Enzym durch Behandlung mit Ultraschall freisetzte und die rohen Lösungen mit Ammoniumsulfat partiell sättigte. Hiebei wird das Enzym ausgesalzen und kann dann durch in der Enzymchemie übliche Säulenchromatographie weiter angereichert werden. L-Asparaginase hat nach der Injektion eine Wirkung gegen solche Geschwülste, die zu ihrem Wachstum L-Asparagin benötigen. Sie wird in steigendem Masse klinisch angewendet, ohne dass es bisher möglich wäre, die hierfür erforderlichen Mengen zur Verfügung zu stellen [Proc. N.A.S. 56, 1516-19 1966)]. Sie hat zur Bekämpfung des malignen Wachstums in der Medizin grosse Bedeutung bekommen.
Es wurde nun gefunden, dass man L-Asparaginase anreichern bzw. kristallisierte L-Asparaginase gewinnen kann, wenn man gemäss der Erfindung vorzugsweise nach Abtrennnung der Pyrogene, die rohen wässrigen Lösungen der L-Asparaginase gegebenenfalls nach Zusatz von Harnstoff oder anderen Amiden, die Wasserstoffbrückenbindungen lösen, mit Polyalkylenglykol versetzt und die so gewonnenen L-Asparaginase enthaltenden Niederschläge isoliert und gegebenenfalls weiterreinigt.
Sofern man nur in den rohen wässerigen L-Aspara ginase-Lösungen mit Polyalkylenglykol Niederschläge erzeugt und die nach an sich bekannten Methoden zerlegt, geht man bei dem erfindungsgemässen Verfahren so vor, dass man die rohen Enzymlösungen, die 1 bis 30, vorzugsweise 1 bis 10%, L-Asparaginase enthalten, mit wässerigen Lösungen des Polyalkylenglykols, vorzugsweise von Polyäthylenglykol versetzt. Hiebei liegt die optimale Konzentration der Fällungslösung bei 40 bis 60% Äthylenglykol; es können jedoch auch Lösungen wesentlich niedrigerer Konzentration verwendet werden. Das optimale Molekulargewicht des verwendeten Polyäthylenglykols liegt zwischen 1000 und 5000.
Niedrigere und höhere Molekulargewichte sind weniger gut geeignet. Die genannten wässerigen Polyäthylenglykollösungen werden bis zu einer Endkonzentration von 15 bis 40%, vorzugsweise 18 bis 30%, zugesetzt.
Das sich bildende Sediment schleudert man ab, zur überstehenden klaren Lösung gibt man weitere Polyäthylenglykollösung, schleudert erneut ab und wiederholt diesen Vorgang beliebig oft. Einige der bei dieser Fraktionierung anfallenden Niederschläge enthalten überwiegend biologisch aktives Material neben geringen Mengen inerter Proteine. Die Reinigung der Niederschläge von anhaftendem Polyäthylengylkol kann so erfolgen, dass man sie in Wasser löst, die Lösung von unlöslichen Bestandteilen befreit und mit einem Überschuss Aceton fällt.
Hiebei flockt L-Asparaginase aus, während Polyäthylenglykol in Lösung bleibt. Es ist auch möglich, mit anderen Lösungsmitteln zu fällen, wie z. B. mit niederen Alkoholen. Andererseits kann man aus der Lösung des Niederschlages das Polyäthylenglykol auch mit solchen Lösungsmitteln, die das Enzym nicht denaturieren und die nicht mit Wasser mischbar sind, extrahieren, zum Beispiel mit Diisopropyläther. Weiterhin ist es möglich, aus dem gelösten Niederschlag das Polyäthylenglykol, das ein Molekulargewicht von 10000 nicht überschreiten soll. durch Dialyse zu entfernen und das Enzym durch Gefriertrocknung der nicht dialysablen Anteile zu gewinnen. Es ist auch möglich, den Niederschlag zu trocknen und dann mit Aceton oder anderen Lösungsmitteln zu extrahieren.
Zweckmässig führt man diese Operationen bei einer Temperatur. die zwischen 0 und + 400 C liegen kann, aus. Die Fällung des Enzyms aus den wässerigen Lösungen ist unabhängig vom pH-Wert. Man arbeitet zweckmässig in pH-Bereichen zwischen 4 und 10.
Auch andere Polyglykole, z. B. Polypropylenglykol, sind zur Durchführung des Verfahrens geeignet.
Von einer amerikanischen Arbeitsgruppe wurde im Jahre 1967 ein Verfahren zur teilweisen Fraktionierung von Serum bzw. Plasma mit Polyäthylenglykol beschrieben (Fed. Proc. 1967 s. 3218).
Die selektive Ausfällung eines bestimmten Enzyms wie z. B. der L-Asparaginase mit Polyäthylenglykollö- sungen ist bisher jedoch ohne Analogie in der Enzymchemie.
Den Vorteil des neuen Verfahrens gegenüber den bisher bekannten Methoden, z. B. der bekannten Fällung mit Ammonsulfat, zur Anreicherung von L-Asparaginase ist in den folgenden Punkten zu sehen:
1. Man kann praktisch beliebige Mengen Rohasparaginase einsetzen, ohne dabei die Ausbeuten zu ver schlechtem.
2. Man arbeitet in sehr konzentrierten wässerigen Lösungen. Dadurch kann das Enzym leicht durch Fällung mit Lösungsmitteln oder durch Gefriertrocknung in angereicherter Form gewonnen werden.
3. Man kann überschüssiges Polyäthylenglykol leicht mit Lösungsmitteln entfernen.
4. Das Verfahren stellt einen wesentlichen Schritt auf dem Wege zur Gewinnung kristallisierter Asparaginase dar.
Die beschriebene Methode führt in zwei Fällungsschritten von der Roh-Asparaginase mit zirka 3 bis 4 i.E./mg Substanz zu Produkten von einem Reinheitsgrad von 70 bis 80 i.E./mg Substanz.
Für die klinische Anwendung der L-Asparaginase ist es nun notwendig den praktisch erreichbaren Reinheitsgrad dem maximalen Wert anzunähern. Dabei muss das Verfahren zur Errreichung dieses Zieles auf technische Dimensionen übertragbar sein.
Es wurde nun weiters gefunden, dass man die Selektivität der Polyäthylenglykolfällung erheblich verbessern kann. wenn man zur L-Asparaginaselösung vor der Fällung Harnstoff oder andere Amide zusetzt, die Wasserstoffbrückenbindungen spalten.
Aus dieser Lösung wird die L-Asparaginase erst bei relativ hohen Konzentrationen von etwa 150 bis 200g Polyäthylenglykol/Liter Lösung ausgefällt, während die inerten Proteine und sonstige Verunreinigungen bei sehr viel niedrigeren, und zwar bei den gleichen Konzentrationen wie bei der Fällung aus harnstofffreier Lösung gefällt werden.
Zweckmässig führt man diese Operationen bei einer Temperatur. die zwischen - 4 und + 400 C liegen kann, aus. Die Fällung des Enzyms aus den wässerigen Lösungen ist im pH-Bereich von 6 bis 10 vom pH-Wert unabhängig.
Der im Sediment der Polyäthylenglykolfällung verbleibende Harnstoff kann z. B. durch Aufnahme des Sedimentes in Wasser und nachfolgende erneute Poly äthylenglykolfällung entfernt werden.
Anstelle von Harnstoff können auch andere Amide, die Wasserstoffbrückenbindungen lösen, z. B. Guanidin, Formamid, Acetamid und andere wasserlösliche Amide, verwendet werden. Über die deaggregierende Wirkung von Harnstoff und anderen Amiden auf Proteine wird an vielen Stellen berichtet [z. B. J. Biol. Chem. 123 (1938), Seite 543].
Der Vorteil des genannten zusätzlichen Verfahrensschrittes besteht in folgenden Punkten:
1. Man gelangt mit zwei Fällungsschritten zu einem Reinheitsgrad der L-Asparaginase, wie er im technischen Massstab bisher nicht möglich war.
2. Durch die lösungsvermittelnde Eigenschaft von z. B. Harnstoff kann in höher konzentrierten wässerigen L-Asparaginase-Lösungen gearbeitet werden, wodurch das technische Verfahren erheblich an Einfachheit gewinnt.
3. Die Ergebnisse einer Polyäthylenglykolfällung werden in Gegenwart von z. B. Harnstoff trotz wechselnder Beschaffenheit der Rohasparaginase besser reproduzierbar.
4. Das Verfahren stellt einen sehr wesentlichen Schritt auf dem Wege zur Gewinnung kristallisierter Asparaginase dar. Es gelingt mit den dafür üblichen Methoden der Proteinchemie, z. B. durch Fällung mit MgSO4, (NH4?3SOS, Aceton usw., das Enzym zur Kristallisation zu bringen.
Weiters wurde nun gefunden, dass man die Reinheit der L-Asparaginase noch mehr verbessern kann, wenn man das mittels Polyäthylenglykol-Fällung auf eine Aktivität von 100 bis 150 U/mg Protein vorgereinigte Enzym einer Fällung beim isoelektrischen Punkt des Enzyms unterwirft.
An seinem isoellektrischen Punkt von etwa pH 4,9 hat das Enzym eine geringere Löslichkeit als alle übrigen in der Lösung noch vorhandenen Proteine. Dies führt zur Ausflockung der L-Asparaginase, welche man durch Zugabe von geringen Mengen Polyäthylenglykol oder von wassermischbaren organischen Lösungsmitteln unterstützen kann. Zweckmässig führt man diese Operationen durch, indem man den pH-Wert auf etwa 4,9 bis 5,5 einstellt und die Fällung bei niedrigen Temperaturen vornimmt.
Der Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens gegenüber der erwähnten reinen oder modifizierten Poly äthylenglykol-Methode liegt in folgendem:
1. Man benötigt keine oder nur geringe Mengen an Fällungsmitteln.
2. Man gelangt ausgehend von einer spez. Aktivität der L-Asparaginase um 100 bis 150U/mg Protein zu einer spez. Aktivität bis zu 190 U/mg Protein.
3. Die Methode liefert das Ausgangsprodukt für die Kristallisation der L-Asparaginase.
Bei der Herstellung von L-Asparaginase-Präparaten z. B. aus E. coli nach Methoden, die von Campbell et. al.
[Biochemistry 6 (1967), Seite 721 bis 730, dort weitere Literatur] beschrieben worden sind, werden Pyrogene der Colizellen in das Endprodukt eingeschleppt.
Ebenso ist es möglich, dass während der Aufarbeitung. die zum grössten Teil im wässerigen Medium geschehen muss, Verunreinigungen in die L-Asparaginasepräparation gelangen, die pyrogen wirken. Trotz vieler Bemühungen ist es bisher nicht gelungen, pyrogenfreie L-Asparaginase zu erhalten. Auch die üblichen Methoden zur Entfernung der Pyrogene, wie die Filtration über Klärschichten, Adsorptionsmethoden mit Hydroxylapatit, Aluminiumhydroxyd, Silikaten, ferner mit Kunstharzen, führten zu keinem Erfolg. Selbst die Chromatographie an Dextrangelen ohne ionisierte Gruppen oder an Diäthylaminoäthyl-Cellulose nach Campbell war vergeblich.
Es wurde nun gefunden, dass man die Pyrogene aus rohen L-Asparaginasepräparaten mit Hilfe von Diäthylaminoäthyl-dextrangelen (DEAE-Dextrangel) entfernen kann, indem man das Enzym in Puffern niedriger Ionenstärke löst, die so erhaltene Lösung entweder nach der chromatographischen Methodik auf eine Säule des gequollenen und mit demselben Puffer äquilibrierten Dextrangels gibt und die L-Asparaginase durch steigende Salzkonzentration fraktioniert und eluiert oder sie nach der Batch-Methode mit dem Dextrangel versetzt, die Suspension filtriert oder zentrifugiert und das an das Gel gebundene Enzym mit geeigneten Puffern höherer Salzkonzentration eluiert.
Bei dem chromatographischen Verfahren löst man das rohe Enzympräparat in etwa 0,02 M-Puffern, vorzugsweise Ammoniumacetat- oder Formiat-Puffern, im neutralen oder leicht alkalischen Bereich, etwa pH 7 bis 8,5, auf, wobei die entstehende Lösung nicht zu konzentriert sein darf. Vorzugsweise werden 1- bis 2%ige Lösungen des Enzyms verwendet.
Das Dextrangel wird zuvor in demselben Puffer gequollen und durch mehrmaligen Wechsel des Puffers äquilibriert. Es wird hierauf in Chromatographiesäulen gefüllt, wobei das Verhältnis von Durchmesser zu Betthöhe 1: 3 bis 1: 30 beträgt. Die Enzymlösung wird auf die Säule gegeben, wobei die Durchlaufgeschwindigkeit 2 bis 4 ml/Stunde und pro cm2 Querschnitt der Säule beträgt. Die Elution wird mit steigendem Salzgehalt des Puffers durchgeführt, am besten mit einem linearen Gradienten; es ist jedoch ebenso möglich, die Konzentration des Elutionsmittels stufenweise zu erhöhen. Das Enzym wird von Acetationen bei Konzentrationen von 0,08 M und höher eluiert.
Die Reinigung lässt sich auch im Batch-Verfahren durchführen, indem man die Enzymlösung zu dem gequollenen DEAE-Dextrangel gibt und das pH auf 7,5 einstellt. Das Enzym wird hiebei von dem Gel absorbiert und kann nach gründlichem Auswaschen des Gels auf einer Nutsche oder mit Hilfe einer Zentrifuge von Salzlösungen geeigneter Konzentration eluiert werden. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber dem Säulenverfahren ist, dass man einfach mit grossen Mengen arbeiten kann. Der Nachteil besteht in der weniger exakt möglichen Trennung von Begleitsubstanzen und der zur Elution nötigen grösseren Flüssigkeitsmenge.
Die Isolierung der L-Asparaginase aus der Lösung in fester Form kann nach bekannten Methoden, wie z. B. der Gefriertrocknung, gegebenenfalls nach Dialyse oder durch Fällung mit Polyäthylenglykol oder Aceton geschehen.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhält man, ausgehend von Präparaten mit etwa 20 bis 100U/mg Reinpräparate mit 180 bis 220U/mg Protein, die frei von pyrogenen Begleitstoffen sind. Diese Präparate sind zur Anwendung in der Chemotherapie geeignet.
Eine weitere Methode zu einer weitgehenden Befreiung der L-Asparaginase von Pyrogenen besteht darin, dass man die Enzymlösung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 bis 15%, in Gegenwart einer Aminosäure, vorzugsweise Glycin, bei einem pH-Wert zwischen 7,0 und 9,2, vorzugsweise zwischen 8 und 9 auf 40 bis 610 C erhitzt, die Lösung von ausgefallenen Begleitstoffen befreit und anschliessend eine Fällung bei pH 4,5 bis 5,5 mit Polyäthylenglykol-Lösung durchgeführt.
Zur Durchführung dieses erfindungsgemässen Verfahrens wird zu den 0,5- bis 15%igen Lösungen der L-Asparaginase eine Aminosäure vorzugsweise Glycin, in Mengen von 1 bis 10% bei Temperaturen von -10 bis +650 C zugesetzt. Der pH-Wert dieser Lösung wird auf 8 bis 9 eingestellt. Zweckmässig wird die Lösung sodann bei +500 C über 1 bis 5 Tage gehalten. Die überstehende Lösung wird auf pH 5,2 eingestellt und mit Polyäthylenglykol gefällt. Das so erhaltene Material besteht aus angereicherter, pyrogenfreier bzw. pyrogenarmer L-Asparaginase.
Dieses Verfahren bietet folgende Vorteile:
1. Die Pyrogene lassen sich zuverlässiger als nach den bisher bekannten Methoden entfernen,
2. Gleichzeitig mit der Entfernung der Pyrogene wird die spezifische Aktivität des Enzyms L-Asparaginase erheblich erhöht.
Auch ein weiteres Verfahren zur Herstellung pyrogenfreier L-Asparaginase macht sich die Stabilisierungswirkung des Glycins zunutze, u.zw. wird bei diesem Verfahren das Enzym in Gegenwart einer Aminosäure, insbesonderen von Glycin, und eines niederen aliphatischen Alkohols, vorzugsweise Methanol, bei einem pH-Wert zwischen 7.0 und 9,2 auf 40 bis 610 C erhitzt, die Lösung von ausgefallenen Begleitstoffen befreit und anschliessend eine Fällung bei pH 4,5 bis 5,5 mit Poly äthylenglykol-Lösung durchgeführt. Ein Zusatz von 4 bis 40%, vorzugsweise 10%, eines niederen aliphatischen Alkohols, vorzugsweise Methanol, führt zu einer weitgehenden Denaturierung der Fremdproteine.
Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit schwer zu entfernende inerte Begleitproteine der L-Asparaginase, welchen eine hohe antigene Wirkung zugeschrieben wird, zu beseitigen.
Zur Durchführung dieses erfindungsgemässen Verfahrens werden L-Asparaginasen. vorzugsweise solche, die mit Polyäthylenglycol bis zu einem Reinheitsgrad von etwa 160 bis 200U/mg gebracht worden sind, in eine 0.5- bis 15'70ige wässerige Lösung gebracht. Es werden z. B. 10 Vol.-% Methanol und etwa 3 Gew.-% Glycin hinzugegeben. Der pH-Wert wird auf 8 bis 9 eingestellt. Zweckmässig wird die Lösung dann bei +500 C über 1 bis 5 Tage gehalten. Die überstehende Lösung wird auf pH 5,2 eingestellt und mit Polyäthylenglykol gefällt. Das so erhaltene Material besteht aus angereicherter, pyrogenfreier bzw. pyrogenarmer L-Asparaginase.
Die als Ausgangsmaterial verwendete Roh-L-Asparaginase wird wie folgt gewonnen: 1 0%ige Maisquellwasserlösung (bezogen auf Trokkensubstanz) wird mit 2n Kalilauge auf pH 7,0 eingestellt, 20 Minuten auf 1200 C erhitzt und nach Abkühlung in der Überlaufzentrifuge geklärt. 30 Liter dieser klaren Maisquellwasserlösung werden mit 170 Liter Leitungswasser verdünnt. Nach Zusatz und Lösung von 1,20 kg Natriumlactat und 400 g Ammoniumsulfat wird die erhaltene Nährlösung in einem Fermenter 40 Minuten bei 1100 C sterilisiert, anschliessend abgekühlt und dann mit 500 cm3 einer 18 Stunden bei 300 C gewachsenen Scbüttelkultur von Escherichia coli ATCC 9637 in Nährbouillon beimpft. Der Fermentationsansatz wird bei 300 C mit 80 Liter Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet.
Nach einer Wachstumszeit von 17 Stunden werden die Bakterien, welche L-Asparaginase enthalten, in der Überlaufzentrifuge abgetrennt und in 20 Liter destilliertem Wasser resuspendiert. In diese Suspension lässt man unter Rühren 80 Liter Aceton einlaufen, trennt die ausgeflockten Bakterien in der Überlaufzentrifuge ab und resuspendiert die Zellmasse wiederum im 20 Liter destilliertem Wasser. Zur Extraktion der L-Asparaginase aus den Bakterienzellen wird die Suspension 4,5 Stunden bei 300 C gerührt. Während dieser Zeit wird das pH durch Zusätze von In Natronlauge bei 7,5 bis 7,8 gehalten. Durch Abtrennung der extrahierten Bakterienzellen in der Überlaufzentrifuge erhält man zirka 17 Liter einer klaren Lösung, aus der man neben anderen Zellinhaltsstoffen die L-Asparaginase durch Zusatz von 68 Liter Aceton ausfällt.
Die entstandene Fällung wird isoliert, mit Aceton nachgewaschen und im Vakuum bei 25 bis 300 C getrocknet. Die so erhaltene Roh-L-Asparaginase hat eine enzymatische Aktivität von zirka 100 Einheiten (30-Minuteneinheiten) pro mg.
Das so erhaltene Ausgangsmaterial kann gegebenenfalls wie folgt vorgereinigt werden:
50 g Rohasparaginase mit einer Aktivität von 100 E/mg werden in 1000 ml m/15 Trispuffer vom pH 8,5 unter Rühren bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wird in Anteilen von jeweils 100 ml im Wasserbad für 15 Minuten auf 59,50 C erwärmt, wobei eine starke Ausflockung von inaktiven Proteinen eintritt, während das Enzym unverändert in Lösung bleibt. Die vereinigten Denaturierungsansätze werden abgekühlt und bei 6000 min klargeschleudert. Die Lösung besitzt eine spezifische Aktivität von 200-300 E/mg Protein. Sie wird hier als Lösung A bezeichnet.
Lösung A kann in Anlehnung an die bekannte Fraktionierung von Enzymen mit Lösungsmitteln fBiochem. J. 48, 42-48 (1951)] mit Aceton fraktioniert werden, wobei die L-Asparaginase in dem Niederschlag, der beim Einstellen der Lösung von 30 auf 50% Aceton ausfällt, enthalten ist. Man gelangt auf diese Weise zu Präparaten mit zirka 500 E/mg.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren kann man entweder von einer Rohasparaginase mit zirka 100 E/mg ausgehen oder von einem angereicherten Präparat. Besonders zweckmässig als Ausgangsmaterial für die Fraktionierung mit Polyäthylenglykol hat sich Lösung A erwiesen oder die daraus durch Acetonfraktionierung zugängliche L-Asparaginase. Die Fraktioniergrenzen sind nicht konstant, da sie von der Art der Verunreinigungen abhängen. Es ist jedoch durch einen einfachen Vorverversuch möglich, diese Grenzen zu ermitteln.
Beispiele: Fällung mit Polyalkylenglykol:
Beispiel I
1000 ml Lösung A (gewonnen aus 50 g roher L-Asparaginase mit einer Aktivität von 112 E/mg) wurden auf 30 C gekühlt und mit 500 ml 50%iger Polyäthylenglykol lösung versetzt. Das Sediment wurde durch Zentrifugieren gewonnen.
Die anfallende L-Asparaginase erhielt die Bezeichnung Fraktion 1 . Aus der überstehenden Lösung von Fraktion 1(1468 ml) wurde mit 100ml 50%iger Poly- äthylenglykollösung weiteres Material ausgefällt und aufgearbeitet. Ausfällung = Fraktion 2. Die überstehende Lösung von Fraktion 2 (1550 ml) wurde erneut mit 100 ml Polyäthylenglykollösung versetzt und aufgearbeitet. Ausfällung = Fraktion 3. Auf analogem Wege wurde Fraktion 4 gewonnen. Die bei dieser Fraktionierung er zielten Reinheitsgrade und Ausbeuten gehen aus der folgenden Tabelle hervor:
Fraktions- Ausbeute % Einheiten,bezo
Nr. in g E/mg gen auf eingesetzte
Roh-Asparaginase
1 1,46 230 6
2 2,43 1050 43
3 1,40 1240 29
4 0,64 310 4
Beispiel 2
100 g Rohasparaginase mit 103 E/mg wurden in 2 Liter Wasser gelöst und durch Zentrifugieren geklärt.
Die Lösung wurde mit ln KOH auf pH 8,5 eingestellt und mit Polyäthylenglykollösung analog Beispiel 1 fraktioniert. Die dabei erhaltenen Fraktionen 2 und 3 wurden vereinigt. Ausbeute 12,0g. Einheiten/mg 765. Ausbeute bezogen auf eingesetzte Einheiten 88% d. Th.
Beispiel 3
Die vereinigten Sedimente der in Beispiel 2 gewonnenen Fraktionen 2 und 3 wurden in 400 ml Wasser gelöst und erneut einer Fraktionierung mit Polyäthylenglykollösung unterzogen. Die so erhaltenen Sedimente der Fraktion 2 und 3 wurden zweimal in trockenem, tiefgekühlten Aceton dispergiert, zentrifugiert, in Wasser gelöst, über eine Seitz-K3-Schicht filtriert und lyophilisiert.
Ausbeute 4,40 g; Einheiten/mg 1730; Ausbeute bezogen auf 100 g Roh-Asparaginase 74%.
Beispiel 4
5,0 g einer aus Lösung A durch Fraktionierung mit Aceton vorgereinigten L-Asparaginase mit 576 E/mg wurden in 100ml Wasser gelöst und mit Polyäthylenglykollösung, wie in Beispiel 1 beschrieben, fraktioniert.
Die bei dieser Fraktionierung erzielten Reinheitsgrade und Ausbeuten geben aus der folgenden Tabelle hervor: Fraktions- Ausbeute % Einheiten,bezo Nr. in g E/mg gen auf eingesetzte
Roh-Asparaginase
1 1,381 790 38
2 0,362 1930 24
3 0,155 640 3
4 1,00 180 6 Zusatz von Harnstoff oder anderen Amiden:
Beispiel 5
5 kg Roh-Asparaginase (hergestellt in der beschriebenen Weise) werden bei Zimmertemperatur in 40 Liter destilliertes Wasser eingetragen. Der pH-Wert der langsam entstehenden Lösung wird mit etwa 1,5 Litern ln NaOH auf 8,5 bis 8,9 eingestellt. Danach wird Harnstoff bis zu einer Konzentration von etwa 3 Mol/Liter dazugegeben. Die Temperatur der Lösung sinkt dabei um etwa 100 C. Es wird noch eine Stunde gerührt und die entstehende Lösung bei 40 C 16 bis 24 Stunden aufbewahrt.
Nach dieser Zeit wird Fraktion I durch Zugabe von 25 bis 30 Litern einer 50%igen Polyäthylenglykollösung gefällt. Fraktion I wird verworfen. Fraktion II wird durch Zugabe von weiteren 15 Litern 50%iger Polyäthylenglykollösung gefällt. Fraktion II enthält die Hauptaktivität. Durch Zugabe von weiteren 15 Litern der Polyäthylenglykollösung zu dem Überstand aus Fraktion II wird Fraktion III gewonnen, die etwa 20 bis 25% der angesetzten Asparaginase-Aktivität enthält.
Fraktion II wird in etwa 2,5 Liter destilliertes Wasser aufgenommen. Durch Zugabe von 250 ml einer 50%igen Polyäthylenglykollösung wird Fraktion Ia ausgefällt; durch weitere Zugabe von 250ml Polyäthylenglykollösung Fraktion IIa. In gleicher Weise werden Fraktion IIIa und IVa gewonnen. Die bei dieser Fraktionierung erzielten Reinheitsgrade und Ausbeuten gehen aus der folgenden Tabelle hervor: E/ )/o E/mg J/o der enzymatischen
Fraktions- Ausbeute E/mg Aktivitat, bezogen Nr. in g (1-Minuten- auf eingesetzte
Roh-Asparaginase
Ia 1,6 19,4 0,3
IIa 8,1 100,0 8,0
IIIa 23,0 144,0 31,2
IVa 16,2 74,0 11,5
Va 18,9 25,0 4,6
55,6
Beispiel 6
Es wird wie in Beispiel 5 verfahren, jedoch wird die Konzentration an Harnstoff auf etwa 6 Mol/Liter erhöht.
Die anschliessende Standzeit der Lösung beträgt dabei nur 2 Stunden. Die Ausbeuten sind mit denen aus Beispiel 5 weitgehend übereinstimmend.
Beispiel 7
Es wird wie in Beispiel 5 verfahren, jedoch wird anstelle von Harnstoff Guanidinhydrochlorid bis zu einer Konzentration von etwa 2 Mol/Liter zugegeben. Die Standzeit der Lösung beträgt 2 Stunden. Die Ausbeuten entsprechen denen aus Beispiel 5.
Fällung am isoelektrischen Punkt:
Beispiel 8
100g L-Asparaginase mit einer spez. Aktivität von etwa 100 U/mg Protein werden in 1000 cm3 destilliertem Wasser bei Zimmertemperatur gelöst. Während des Lösungsvorgangs wird der pH-Wert mit in NaOH auf 8,5 bis 8,9 eingestellt. Das dann verbleibende Unlösliche wird 10 Minuten bei 6000 um/min abzentrifugiert. Der pH-Wert des klaren Überstandes wird im Eisbad langsam auf pH 7 bis 6,8 gebracht. Ein sich dort abscheidendes öliges Sediment wird 25 Minuten bei 6000 um/min abzentrifugiert. Der klare Überstand dieser Zentrifugation wird mit 1n HCI auf pH 5,3 eingestellt. Danach werden stufenweise je 25 ml einer 50%igen Polyäthylenglykollösung hinzugegeben und jeweils bei 6000 um/min über 10 Minuten abzentrifugiert. Man erhält auf diese Weise etwa 5 bis 6 Fraktionen, wobei die Hauptaktivität mit der höchsten spez.
Aktivität in Fraktion 3 bis 5 enthalten ist. Ausbeute: 60 bis 70%.
Beispiel 9
Es wird wie in Beispiel 8 verfahren, jedoch wird anstelle von Polyäthylenglykol kaltes Aceton in 4 Schritten bis zu 20% des Lösungsvolumens hinzugegeben. Die Ausbeuten sind denen aus Beispiel 8 ähnlich.
Beispiel 10
Es wird wie in Beispiel 8 verfahren, jedoch wird anstelle von Polyäthylenglykol Äthylalkohol in 5 Schritten bis zu 20% des Lösungsvolumens hinzugegeben. Die Ausbeuten sind denen aus Beispiel 8 ähnlich.
Beispiel 11
100g L-Asparaginase mit einer spez. Aktivität von 140 U/mg Protein werden in 500 ml Wasser gelöst, der pH-Wert der Lösung wird mit in NaOH auf 8,5 eingestellt Ungelöst gebliebene Substanz wird bei 6000 um/min über 15 Minuten abzentrifugiert. Der pH-Wert der klaren Lösung wird bei 40 C und mit 1n HCI auf pH 6,8 eingestellt und der dabei auftretende Niederschlag abzentrifugiert. Der klare Überstand nach der Zentrifugation wird mit 1n HC1 langsam auf pH 5,0 bis 5,1 eingestellt und bei 40 C über mehrere Stunden belassen. Der danach aufgetretene Niederschlag wird abzentrifugiert.
Er enthält die L-Asparaginase mit einer Ausbeute von 60 bis 80% der eingesetzten Aktivität und mit einer maximalen spez. Aktivität bis zu 190 U/mg Protein.
Gewinnung von kristallisierter L-Asparaginase:
Beispiel 12
200 g Rohasparaginase mit einer Aktivität von 97 E/mg werden in 4000 ml Glykokollpuffer, pH 8,5 (Biochemisches Taschenbuch, Seite 91, 1964) gelöst und portionsweise 30 Minuten auf 600 C erhitzt. Hiebei flockt inaktives Protein aus, während das Enzym unver ändert in Lösung bleibt. Der Ansatz wird bei 6000 um/ min klargeschleudert und mit Aceton fraktioniert. Der bei Zugabe von 40 bis 45% Aceton ausfallende Anteil beträgt 16,4 g. Er enthält 863 E/mg.
9,3 g dieser angereicherten Asparaginase werden in 190 ml 3molarer Harnstofflösung gelöst, mit Natronlauge auf pH 8,5 eingestellt und mit Polyäthylenglykol (50%ige wässerige Lösung) fraktioniert. Die nach Zugabe von 22 bis 30ml anfallende Fraktion wird gewonnen und wie üblich aufgearbeitet. Ausbeute 2,1 g; E/mg: 3130.
Eine Lösung von 4,0 g dieser Probe in 40 ml bidestilliertem Wasser wird mit 1-n Salzsäure auf pH 5,2 eingestellt und mit Polyäthylenglykollösung fraktioniert. Der nach Zugabe von 12,5 bis 15 ml ausfallende Anteil wird nach 20minütigem Stehen bei Raumtemperatur abgeschleudert und nach zweistündigem Stehen unter Aceton mit weiterem Aceton gewaschen. Ausbeute: 1,2 g; E/mg: 6110.
Flache Prismen. Braunfärbung bei 2250 C, Sintern ab 2600 C, Schäumen ab 2700 C und vollständige Zersetzung ab 2740 C.
Die so erhaltenen Kristalle werden aus wässerigen Lösungen durch Zusatz organischer Lösungsmittel, wie Aceton oder Alkohol oder durch Zugabe von Polyäthylenglykol umkristallisiert.
Die Kristalle zeigen folgende Analysenergebnisse:
Wassergehalt: 12,5% (Die HO-Gehaltsbestimmung erfolgte durch 6stündiges Trocknen im Hockvakuum bei 1100 C in einer Spezial-Trockenpistole nach J. Unterzaucher [Mikrochem. 18, 315 (1935)]. Auf Gewichtskonstanz wurde durch fortgesetzte Trocknung geprüft.)
Glührückstand: 0,11% (Die Bestimmung des Aschegehaltes von Proteinen erfolgte nach F. Pregl und H. Roth [Quantitative organische Mikroanalyse, S. 174, Springer, Wien, (1949)]).
Proteingehalt: 88,0% Die Proteinbestimmung erfolgte nach Trichloressigsäurefällung nach der BIURET-Methode [T.E. Weiselbaum, Am. J. Clin. Path. (Techn. Sec.), 10, 40 (1946)]). Gesamtvolumen: 4 ml (davon 2 ml Biuret-Reagens): E l46emnS 12,3 = mg Protein/ml Testlösung.
Die Sedimentationskonstante zeigte einen Wert von S20 < = 4,33.
Fig. 1 zeigt das IR-Spektrum der kristallisierten L-Asparaginase, aufgenommen nach der KBr-Technik.
In Fig. 2 ist das UV-Spektrum des Präparates gezeigt. Messgerät: Zeiss Spektralphotometer PMQ II (Verstärkung l/1/I); Schichtdicke: 1 cm; Konzentration: jeweils 1 mg HG- und salzfr. Präparat pro ml.
Als Lösungsmittel diente ein pH 7-Phosphatpuffer (Merck Titrisol) Nr. 9887.
Fig. 3 ist eine Wiedergabe der Kristallaufnahme von L-Asparaginase.
Abtrennung der Pyrogene:
Beispiel 13
30 g DEAE-Dextrangel (Diäthylaminoäthyldextrangel = DEAE-Sephadex A 50 3, Handelsprodukt der Aktiebolaget Pharmacia, Uppsala, Schweden) wird in der üblichen Weise vorbehandelt, mit 0,02 M-Glycin, 0,02 M Ammoniumformiatpuffer pH 7,8 äquilibriert und in eine Säule mit 3,2 cm Durchmesser eingelüllt. Betthöhe: 90 cm. 500 mg rohe L-Asparaginase mit 100 U/mg werden in 50ml obigen Puffers gelöst und auf die Säule aufgetragen. Anschliessend wird das Enzym mit einem linearen Gradienten von 2 Litern des obigen Puffers zu 2 Litern 0,02 M-Glycin, 1 M-Ammoniumformiat pH 7,5 eluiert. Die asparaginasehaltigen Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausbeute: 1,03 g mit 27 800 U = 83% der eingesetzten Aktivität. Die spez.
Aktivität, auf Protein bezogen, beträgt 210 U/mg.
Pyrogentest am Kaninchen: 5 Kaninchen wurden 200 U/kg Tier gegeben. Der Mittelwert der Temperaturerhöhung betrug 0,480 C.
Die Ausgangs substanz zeigte unter gleichen Bedingungen eine Temperaturerhöhung um 1,60 C.
Beispiel 4
30 g DEAE-Dextrangel werden in der üblichen Weise vorbehandelt und mit 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 äquilibriert und in eine Säule mit 3,2 cm Durchmesser eingefüllt. Betthöhe 95 cm. 500 mg rohe L-Asparaginase mit 39,7 U/mg werden in 50 ml 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die Elution erfolgt mit einem linearen Gradienten von 2 Litern 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 zu 2 Litern 1 M -Ammoniumacetat pH 7,5. Die asparaginasehaltigen Fraktionen werden vereinigt. Ausbeute 18 600 U = 94% der eingesetzten Aktivität. Spezifische Aktivität: 200 U/mg Protein.
Pyrogentest am Kaninchen: Bei 300 U/mg Tier betrug der Mittelwert der Temperaturerhöhung 0,40 C.
Die Ausgangssubstanz zeigte bei 200 U/kg Tier eine Temperaturerhöhung um 1,60 C.
Zum Vergleich sei ein Reinigungsversuch mit Di äthylaminoäthyl-Cellulose angeführt:
30 g DEAE-Cellulose wurden mit 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 äquilibriert und in eine Säule eingefüllt. 500 mg rohe L-Asparaginase (34 U/mg) wurden in 50 ml des obigen Puffers gelöst, auf die Säule aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 1 Liter 0,05 Ammoniumacetat pH 7,5 zu 1 Liter 0,5 M-Ammoniumacetat pH 7,5 eluiert.
Ausbeute: 14000 U = 82% der Aktivität mit 89 U/mg Protein.
Pyrogentest am Kaninchen: Bei 200U/kg Tier betrug der Mittelwert der Temperaturerhöhung 1,00 C.
Die Ausgangssubstanz zeigte unter gleichen Bedingungen eine Temperaturerhöhung um 1,80 C.
Auch andere Versuchsbedingungen erbrachten keine weitergehende Entfernung der Pyrogene, woraus die Überlegenheit des erfindungsgemässen Verfahrens klar hervorgeht.
Beispiel 15
490g DEAE-Dextrangel wurden wie üblich vorbehandelt und mit 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 äquilibriert, dem Merthiolat in einer Konzentration von 20 mg/Liter zugesetzt war. Die Suspension wurde in eine auf 40 C gekühlte Säule mit dem Durchmesser von 20 cm gegeben. Betthöhe: 65 cm. 9,8 g einer Rohasparaginase mit 45 U/mg wurden in 880ml 0,02 M-Ammoniumacetat pH 7,5 gelöst und auf die Säule gegeben.
Elution mit linearem Gradienten von 10 Litern 0,05 M Ammoniumacetat pH 7,5 zu 10 Litern 0,5 M-Ammoniumacetat pH 7,5. Die asparaginasehaltigen Fraktionen wurden vereinigt. Ausbeute: 365 000 U = 81% der eingesetzten Menge.
Spezifischer Pyrogentest am Kaninchen: Bei 200 U/kg Tier betrug der Mittelwert der Temperaturerhöhung 0,330 C.
Die Ausgangssubstanz zeigte unter gleichen Bedingungen eine Temperaturerhöhung um 1,80 C.
Beispiel 16
Zu 10g DEAE-Dextrangel, äquilibriert in 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung pH 7,5, wird eine Lösung von 100 mg L-Asparaginase mit 39,7 U/mg in 100 ml 0,05 M Ammoniumacetat-Lösung pH 7,5 gegeben. Der Ansatz wird 15 Minuten gerührt und dann abgesaugt. Der Rückstand wird nacheinander mit Puffern verschiedener Ionenstärke eluiert (s. Tabelle). Die bei niedriger Ionenstärke bereits eluierten L-Asparaginaseanteile sind pyrogenhaltig, während die mit stärkeren Puffern eluierten Anteile pyrogenfrei sind. Die Ausbeuten sind aus der Tabelle zu ersehen.
Akti- Aus- Pyro Puffer vität beute gität
U C/c T!Tier (,C) 0,05 M-Ammoniumacetat pH 7,5 5010 24 1,1 0,10 M-Ammoniumacetat pH 7,5 3820 18 1,2 0,20 M-Ammoniumacetat pH 7,5 7850 37 0,9 0,40 M-Ammoniumacetat pH 7,5 4060 19 0,3 0,80 M-Ammoniumacetat pH 7,5 520 2 0,3
Beispiel 17
100g Asparaginase mit einer spezifischen Aktivität von 100 U/mg werden in einem Liter Wasser gelöst. Es werden etwa 40 g Glycin hinzugegeben und die Lösung auf pH 8,9 eingestellt. Die Lösung wird 90 Stunden bei +500 C gehalten, das danach ausgefällte Protein bei 6000 U/Minute 20 Minuten zentrifugiert. Das klare Zentrifugat wird mit 2n HCI auf pH 5,2 eingestellt und mit 50% iger Polyäthylenglykol-Lösung fraktioniert gefällt.
Der nach Zugabe von etwa 200 ml Polyäthylenglykol ausfallende Anteil wird abgeschleudert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Ausbeute: etwa 35 g mit 200 bis 220 U/mg Substanz. Aus der Fig. 4 geht der minimale Pyrogengehalt des Produktes hervor.
Beispiel 18
Es wird wie in Beispiel 17 verfahren, jedoch wird die Lösung der L-Asparaginase 24 Stunden auf 600 C erhitzt.
Beispiel 19
Es wird wie in Beispiel 17 verfahren, der pH-Wert der Lösung jedoch auf etwa 8,2 eingestellt.
Beispiel 20
Es wird wie in Beispiel 18 verfahren, jedoch werden nur 20 g Glycin zu der Lösung der L-Asparaginase gegeben.
Beispiel 21
100g L-Asparaginase mit einer spez. Aktivität von
100 U/mg werden in einem Liter Wasser gelöst. Es werden 100 m Methanol und 40 g Glycin hinzugegeben und die Lösung auf pH 8,9 eingestellt. Die Lösung wird 90 Stunden bei +500 C gehalten, das danach ausgefällte Protein bei 6000 U/Min. 20 Minuten zentrifugiert. Das klare Zentrifugat wird mit 2n HCI auf pH 5,2 eingestellt und mit 50%iger Polyäthylenglykol-Lösung fraktioniert gefällt. Der nach Zugabe von etwa 200 ml Polyäthylenglykol ausfallende Anteil wird abgeschleudert, mit Ace ton gewaschen und getrocknet. Ausbeute: etwa 33 g mit
200 bis 235 U/mg Substanz.
Beispiel 22
Es wird wie in Beispiel 21 verfahren, jedoch werden 200 ml Methanol zugesetzt.
Beispiel 23
Es wird wie in Beispiel 21 verfahren, jedoch werden der Lösung 100 ml Äthanol zugesetzt.