DD262673A5 - Verfahren zur extraktion von lipolhilen proteinen aus zellen der gattung pichia - Google Patents

Verfahren zur extraktion von lipolhilen proteinen aus zellen der gattung pichia Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von lipophilen Proteinen aus Zellen der Gattung Pichia. Es wird ein Verfahren zur selektiven Extraktion von gewuenschten lipophilen Proteinen aus transformierten Zellen der Gattung Pichia durch Zellysis in Gegenwart eines chaotropen Salzes beschrieben. Das unter den erfindungsgemaessen Zellysisbedingungen extrahierte Gesamtprotein wird verringert, waehrend die Gewinnung der gewuenschten lipophilen Proteine relativ konstant bleibt, wodurch man im Vergleich zu einem Kontrollzellextrakt einen Zellextrakt mit erhoehter Konzentration an dem gewuenschten lipophilen Protein erhaelt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Gewinnung von Proteinen.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die rekombinante DNA-Technik hat sich rasch zu einem wertvollen Werkzeug zur Herstellung von Peptiden und Proteinen, die für eine Reihe von diagnostischen, therapeutischen und chemischen Anwendungszwecken und dergl. von Interesse sind, entwickelt. Eine Schwierigkeit, die dabei häufig auftritt, besteht darin, daß es erforderlich ist, das gewünschte Protein in einer gereinigten Form frei von verunreinigenden Proteinen, die während der Expression des gewünschten Produkts ebenfalls gebildet werden, zu erhalten. Die Erfindung ist auf ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Proteinen, die durch rekombinante DNA-Techniken erhalten worden sind, ausgerichtet.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung von erwünschten Proteinen, die durch genetisch modifizierte Hefeorganismen gebildet worden sind, bereitzustellen.
-2- 262673 Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von lipophilen Proteinen aus Wirtszellen der Gattung Pichia zu schaffen, wobei die gewünschten Proteine in möglichst hoher Konzentration und Ausbeute anfallen sollen. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß durch genetisch modifizierte Pichia-Stämme gebildete lipophile Proteine unter Verwendung eines Lysispuffers mit einem Gehalt an chaotropen Salzen selektiv gewonnen werden können. Das Aufbrechen von Pichia-Zellen in Gegenwart von derartigen Lysispuffem vermindert die Gesamtmenge an extrahiertem Protein, während es eine geringe Wirkung auf die Extraktion der gewünschten lipophilen Proteine ausübt. Somit erhält der gemäß der erfindungsgemäßen Praxis erhaltene lösliche Zellextrakt eine erhöhte Konzentration an lipophilem Protein im Vergleich zu sämtlichen übrigen im Extrakt enthaltenen Proteinen, wodurch alle weiteren Reinigungsschritte, denen das gewünschte lipophile Protein unterworfen werdensoll, vereinfacht werden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von lipophilen Proteinen aus Wirtszellen der Gattung Pichia, gekennzeichnet dadurch, daß man
(a) die Zellen unter Zellaufbrechbedingungen ausreichend lang behandelt, um ein Aufbrechen sämtlicher Zellen zu erreichen, wobei das Aufbrechen in Gegenwart eines Extraktionsmediums durchgeführt wird, das mindestens ein chaotropes Salz in einer Konzentration von etwa 1 bis 8 molar in einem Medium, das auf einen zum Erhalt des lipophilen Proteins in stabiler Form geeigneten pH-Wert, typischerweise im Bereich von etwa 6 bis 8, gepuffert ist, enthält, und
(b) die in Stufe (a) erhaltene lösliche Fraktion gewinnt.
Die erfindungsgemäß gewonnene lösliche Fraktion kann nach bekannten Techniken weiter behandelt werden, um eine zusätzliche Konzentrierung und Reinigung des gewünschten Proteins zu ereichen. So kann das Protein in der löslichen Fraktion durch Dialyse, Passage durch ein Umkehrphasenharz und anschließende Eiution mit einem minimalen Lösungsmittelvolumen, Fällung, Ultrafiitration, Lyophilisation und dergl. konzentriert werden. Techniken, die zur weiteren Reinigung des gewünschten Proteins zur Verfügung stehen, sind die Größenfraktionierung unter Verwendung von Größenausschlußharzen, Hochleistungsflüssigchromatographie, Ionenaustausch, hydrophobe Chromatographie und dergl. Der hier verwendete Ausdruck „lipophiles Protein" bezieht sich auf Proteine, die eine Neigung zur Assoziierung mit Lipidmembranen zeigen oder in Gegenwart von Lipid oder lipidähnlichem Material sich zu micellarähnlichen Strukturen vereinigen. Derartige Proteine haben typischerweise einen hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren, d. h. Isoleucin, Valin, Leucin, Phenylalanin, Tryptophan und Alanin.
Beispiele für derartige lipophile Proteine sind: sämtliche Formen von Hepatitis B-Oberflächenantigen unter Einschluß der S-Form, der preS-i-Form, der preS2-Form und dergl.; Phosphatidylserin-decarboxylase (aus E. coli); λ-Bacteriophagen-D-Protein; Lipoprotein geringer Dichte (LDL); Lipoprotein hoher Dichte (HDL); und Dihydroorotat-dehydrogenase.
Der hier verwendete Ausdruck „chaotropes Salz" bezieht sich auf Salze, deren Anionen die Übertragung von apolaren Gruppen auf Wasser begünstigen. Zu diesen Salzen gehören Verbindungen, die das Thiocyanation, Halogenidionen, wie Jodid und Bromid, Hypohalogenitionen, wie Hypochlorit, und Perchlorationen sowie Kationen, z. B. Lithium, Calcium und Barium, enthalten.
Beispiele für im erfindungsgemäßen Verfahren geeignete chaotrope Salze sind Natriumthiocyanat, Kaliumthiocyanat, Natriumiodid, Kaliumiodid, Natriumhypochlorit, Lithiumchlorid, Lithiumbromid, Guanidiniumhydrochlorid, Guanidiniumthiocyanat, Harnstoff und dergl.
Die Bildung von lipophilen Proteinen durch Pichia kann durch genetische Modifikation von geeigneten Pichia-Wirtsstämmen mit DNA-Sequenzen, die für das gewünschte Protein kodieren, erreicht werden. Die geeigneten DNA-Sequenzen, die für ein gewünschtes lipophiles Protein kodieren, lassen sich vom Fachmann leicht erhalten, beispielsweise durch Isolierung aus natürlichen Quellen, Konstruktion einer synthetischen DNA-Sequenz und dergl. Spezielle Techniken für die Manipulation von DNA in Pichia-Stämmen sind in Artikeln in „Molecular and Cellular Biology", Bd. 5 (1985), S. 1111 und 3376 beschrieben. Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren wird, wie bereits erwähnt, durchgeführt, indem man die Zellen unter Zellaufbrechbedingungen ausreichend lang behandelt, um ein Aufbrechen im wesentlichen sämtlicher Zellen zu erreichen. Dieses Aufbrechen der Zellen wird in Gegenwart eines Extraktionsmediums durchgeführt, das mindestens ein chaotropes Salz in einer Konzentration von etwa 1 bis 8 molar in einem Medium, das auf einen zum Erhalt des lipophilen Proteins in stabiler Form geeigneten pH-Wert, typischerweise im Bereich von etwa 6 bis 8, gepuffert ist, enthält. Gegebenenfalls können zur Minimierung des Proteinabbaus während des Extraktionsverfahrens Antiproteasemittel, wie Phenylmethylsulfonylfluorid, dem Lysispuffer zugesetzt werden.
Typischerweise wird in der erfindungsgemäßen Praxis das Aufbrechen der Zellen in einer Perlmühle (bead mill) oder einer ähnlichen Vorrichtung durchgeführt. Die zum Aufbrechen der Zellen erforderliche Zeit hängt von der Empfindlichkeit der Zellwände gegenüber dem Aufbrechvorgang, der Intensität der Homogenisierungsbedingungen, der Gegenwart und Konzentration von dem Lysispuffer zugesetzten Komponenten und dergl. ab. Typischerweise werden die Zellen dem Aufbrechvorgang über einen Zeitraum von etwa 0,5 bis 30 Minuten und vorzugsweise von etwa 1 bis 5 Minuten unterworfen. Die Temperatur wird während des Aufbrechvorgangs der Zellen im allgemeinen so gesteuert, daß die Wirkung von proteinabbauenden Enzymen möglichst gering gehalten wird. Somit wird das Aufbrechen der Zellen im allgemeinen bei einer im Bereich von etwa 0 bis etwa 100C und vorzugsweise bei etwa O0C durchgeführt, um den Anteil an Proteinabbau während der Aufbrechstufe möglichst gering zu halten und damit die Ausbeute an gewünschten Protein, das aus den aufgebrochenen Zellen gewonnen wird, möglichst hoch zu halten.
Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die lösliche Fraktion gewonnen, indem man Zellbruchstücke durch an sich bekannte Verfahren, z. B. Zentrifugation oder Tangentiaifiltration, entfernt. Die erhaltene zellfreie Brühe ist in bezug auf das gewünschte lipophile Protein im Vergleich zu einer Brühe, die durch bloßes Aufbrechen der Zellen und Gewinnen der löslicfien Fraktion" daraus erhalten ist, angereichert.
Gegebenenfalls kann die so behandelte Brühe einer Weiterbehandlung unterworfen werden, um eine konzentrierte Fraktion des gewünschten lipophilen Proteins gemäß verschiedenen bekannten Techniken, z. B. durch Säurefällung, Filtration, Chromatographie, Lösungsmittelverdampfung und dergl., zu erhalten.
Ausführungsbeispiele Beispiel I
Die Extraktion von Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg)-22nm-Teilchen aus Pichia-Zellen, die mit dem Vektor pBSAGI5l (erhältlich in einem E. coli-Wirt beim Northern Regional Research Center, US Department of Agriculture, Peoria, ILL. unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18021) transformiert worden sind, ist nachstehend beschrieben.
Kulturen von P. pastoris wurden auf eine Zelldichte im Bereich von 10 bis 100 optischen Dichteeinheiten (600 nm) pro ml gezüchtet. Eine Aliquotmenge von 100 optischen Dichteeinheiten wurde entfernt und auf ein Borsilicat-Kulturröhrchen der Abmessungen 13 χ 100mm übertragen und 2 mal mit 20 Volumina Lysierungspuffer (die Zusammensetzung ist nachstehend angegeben) gewaschen.
Die pelletisierten Zellen (klinische Zentrifuge IEC) wurden mit 0,5g säuregewaschenen Glasperlen (0,5mm) und anschließend mit 0,35ml Lysierungspuffer versetzt. Der Lysierungspuffer enthielt entweder 0,5m NaCI und 0,1% Triton X-100(Gew./Vol.) als Kontrolle oder ein chaotropes Salz in einer Konzentration von 2 m oder 3 min Gegenwart oder Abwesenheit von 0,1 % Triton X-100. Sämtliche Lösungen wurden mit 10 millimolarNatriumphosphat auf den pH-Wert 7,5 gepuffert. Das Gemisch wurde unter Verwendung eines Wirbelmischers während 8 Zeiträumen von 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit bewegt. Während der Bewegungspausen wurde das Gemisch mindestens 1 Minute auf Eis gekühlt. Die Röhrchen wurden während des Mischvorgangs vorzugsweise in einem Winkel von 20 bis 40° gehalten, um ein maximales Aufbrechen zu erreichen. Nach Beendigung des Lysierens wurde die Lösung mit den aufgebrochenen Zellen entfernt, die Glasperlen wurden mit 0,35ml Lysierungspuffer gewaschen, und die beiden Lösungen wurden vereinigt und 15 Minuten bei 13000g zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt und auf immunoreaktive HBsAg-Teilchen (Ausria-Test) und Gesamtprotein (Bradford) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I (a) zusammengestellt.
Beispiel Il
Zur weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden 80 ml Aufschlämmung (1 Teil gepackte Zellen/2 Teile Lysierungspuffer, Vol./Vol.) der Wirkung eines Zeilaufbrechgeräts (Impandex Inc.) unter Verwendung einer 64mm-Bewegungsscheibe bei 4500 U/min unterworfen. Der Lysierungspuffer enthielt entweder 0,5 m NaCI und 0,1 % Triton (Gew./Vol.) oder 3m KSCN. Die Überstände wurden auf HBsAg (Ausria) und Gesamtprotein (Bradford) getestet. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle Kb).
Tabelle I
Lysierungsbedingungen I Il III
HBsAg-Teilchen ^g/ml) Gesamtprotein (mg/ml) HBsAg/Protein
(Gew.-%)
(a)Salz(Konz.)
+ Triton 230 10,1 2,3
KJ (2 m)+ Triton 14 1,4 1,0
KJ (2 m)-Triton 169 2,4 7,0
KSCNOm)
+ Triton <10 1,9 <0,5
KSCN (3 m)
-Triton 222 3,5 6,3
(b)Zellaufbrechgerät
NaCI (0,5 m) 600 32,5 1,8
KSCN (3 m) 803 10,6 7,6
Während bei keiner der Bedingungen unter Verwendung eines chaotropen Salzes (KJ oder KSCN) im Vergleich zur Kontrolle (Spalte I) höhere Werte für die HBsAg-Teilchen erzielt werden, ist klar ersichtlich, daß die chaotropen Salze die Freisetzung von Gesamtprotein (Spalte II) hemmen, wodurch die spezifische Aktivität der HBsAg-Teilchen auf das 2- bis 5fache gesteigert wird (Spalte III).

Claims (9)

1. Verfahren zur Extraktion von lipophilen Proteinen aus Wirtszellen der Gattung Pichia, gekennzeichnet dadurch, daß man
(a) die Zellen unter Zeilaufbrechbedingungen ausreichend lang behandelt, um ein Aufbrechen im wesentlichen sämtlicher Zellen zu erreichen, wobei das Aufbrechen in Gegenwart eines Extraktionsmediums durchgeführt wird, das mindestens ein chaotropes Salz in einer Konzentration von etwa 1 bis 8 molar in einem Medium, das auf einen zum Erhalt des lipophilen Proteins in stabiler Form geeigneten pH-Wert gepuffert ist, enthält, und
(b) die in Stufe (a) erhaltene lösliche Fraktion gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis 8 gehalten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem lipophilen Protein um ein Protein handelt, das eine Neigung zur Assoziierung mit Lipidmembranen zeigt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem lipophilen Protein um ein Protein handelt, das in Gegenwart von Lipid oder lipidähnlichem Material sich zu micellarähnlichen Strukturen vereinigt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das lipophile Protein aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
S-Form von Hepatitis B-Oberflächenantigen,
preSrForm von Hepatitis B-Oberflächenantigen, preS2-Form von Hepatitis B-Oberflächenantigen, Phosphatidylserin-decarboxylase (aus E.coli),
λ-Bacteriophagen-D-Protein,
Lipoprotein geringer Dichte (LDL),
Lipoproteih hoher Dichte (HDL) und
Dihydroorotat-dehydrogenase.
6. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß man das Aufbrechen der Zellen bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 10°C über einen Zeitraum von etwa 0,5 bis 30 Minuten hinweg durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das chaotrope Salz aus folgender Gruppe ausgewählt ist: Natriumthiocyanat, Kaliumthiocyanat, Natriumiodid, Kaliumiodid, Natriumhypochlorit, Lithiumchlorid, Lithiumbromid, Guanidiniumhydrochlorid, Guanidiniumthiocyanat, Harnstoff und Gemische aus zwei oder mehr dieser Verbindungen.
8. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß in der Stufe (b) die Gewinnung der löslichen Fraktion durch Zentrifugation der die aufgebrochenen Zellen enthaltenden Lösung erreicht wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man die in Stufe (b) erhaltene lösliche Fraktion behandelt, um eine konzentrierte Fraktion des lipophilen Proteins daraus zu gewinnen.
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