Procédé de production de 7-chloro-6-déméthyltétracycline
La présente invention est relative à un procédé per fectionné pour la production de 7-chlor*6déméthyl-té- tracycline. Elle concerne, plus particulièrement, la production sélective de 7-chloro6-déméthyltétracycline par biosynthèse fermentative, en sélectionnant une souche de Streptomyces aureofaciens produisant sélectivement la 7-chloro-6-déméthyltétracycline et apte à conférer à une solution aqueuse diluée (dilution 1:
:200) du moût de récolte entier une coloration caractérisée par une courbe de réflectance telle que, lorsqu'on relève linéairement le pourcentage de réflectance en fonction de la longueur d'onde, la courbe résultante entre 460 mu et 530 mu présente un point d'inflexion et a au moins un point de pente nulle et qu'elle est convexe vers le haut à gauche du point d'inflexion et concave vers le haut à droite de ce point d'inflexion.
L'antibiotique qu'est la 7-chloro-6-déméthyltracycline a été pour la première fois décrit et revendiqué dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2 878 289, qui décrit aussi des procédés pour la production de cet antibiotique. Dans ce brevet on décrit un procédé au moyen duquel on cultive une souche de S.
aureofaciens productrice de 7-chloro-6-déméthyltétracycline dans un milieu de fermentation. Ce brevet précise aussi que d'autres tétracyclines, telles que la 6-déméthyltétracycline, la 7-chlorotétracycline et la tétracycline sont obtenues en même temps, dans un milieu de fermentation, lorsque les conditions de fermentation, y compris le microorganisme indiqué dans ce brevet, sont utilisées. Ce brevet indique, en outre, qu'il se peut qu'on obtienne de la 7-bromo-6-déméthyltétracycline comme produit concomitant lorsque le milieu de fermentation contient du brome.
Par ailleurs, la production de plus d'une tétracycline dans un milieu de fermentation dans lequel peut être produite de la déméthylchlortétracycline est également révélée dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 3 028 311, ainsi que dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 3 061 522, dans lequel on décrit la preésence d'inhibiteurs dits de 6-méthylation dans un milieu de fermentation dans lequel on utilise une souche de S. aureofaciens productrice de 7-chlortétracycline.
D'autres procédés pour la production de 7-chloro6-déméthy-tétracycline par culture de souches de S.
aureofaciens productrices de 7-chlortetracycline en présence d'inhibiteurs de 6-méthylation sont donnés dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 3 019 172 et 3 127 328. Ces procédés se heurtent également au problème de la formation concomitante d'autre tétracyclines. Ainsi, dans chacun de ces procédés, un mélange de 7-chlortétracycline, tétracycline, 7-chloro6-déméthyltétracycline et 6-déméthyltétracycline, est produit.
La production concomitante de 6-déméthyltétracycline (ou d'autres tétracyclines) est répréhensible lorsque la 7-chloro-6-déméthyltétracycline est le produit principal recherché. Bien que la 7-chloro-6-déméthyltétracycline de qualité pharmaceutique puisse contenir de petites quantités de 6-déméthyltétracycline, la présence d'une quantité substantielle de 6-déméthyltétracycline est répréhensible. La présence de 6-déméthyltétracycline (ou d'autre tétracyclines) dans le même moût de fermentation en quantités notables pose également des problèmes difficiles de séparation, au cours des traitements de raffinage ou d'extraction, lorsqu'on désire obtenir de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline. Il est évidemment possible d'extraire les antibiotiques du moût de fermentation et de les séparer par des procédés de raffinage sélectifs.
Cependant, les procédés de raffinage pour séparer les antibiotiques sont difficiles et impliquent habituellement une certaine perte de l'activité antibiotique totale. Au surplus, dans les cas où la 7-chloro-6-déméthyltétracycline est le principal produit de la fermentation, la 6-déméthyltétracycline (ou d'autres tétracyclines3 est indésirable et est ordinairement extraite et jetée. C'est pourquoi un procédé permettant la production accrue de 7-chloro-6-déméthyltétracycline et une production concomitante moindre de 6-déméthyltétracycline (ou d'autres tétracyclines) constitue un progrès notable dans la technique de l'obtention d'antibiotiques par fermentation.
On a découvert à présent, non sans surprise, que certaines souches mutantes nouvelles et originales de
Streptomyces aureofaciens produisent, dans un milieu de fermentation classique, de la 7-chloro-6aéméthylté- tracycline comme produit concomitant. Par ailleurs, il n'y a pas de production discernable de tétracycline ou de 7-chlorotétracycline avec les souches sélectionnées selon le critère de la courbe de réflectance déjà mentionné. Le sélection de telles souches obvie à la nécessité de procédés coûteux et difficiles d'extraction et de purification, étant donné que les cristaux de 7-chloro6-déméthyltracycline obtenus sont de qualité pharmaceutique.
Les souches produisant sélectivement la 7-chlorodéméthyltétracycline sont des souches de l'espèce Streptomyces aureofaciens. Les souches S. aureofaciens repésentatives décrites ci-dessous sont des descendantes directes de la souche de S. aureofaciens productrice de 7-chlorotétracycline isolée du sol A-377 décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2482055 et déposée aux Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, Etats-Unis d'Amerique, et répertorié sous le No NRRL 2209. Elles ont été obtenues par des procédés mutagéniques connus dans la technique, par exemple par irradiation au moyen de rayons ultraviolets, par traitement avec de la nicotine ou par traitement avec des moutardes azotées.
Des souches mutantes typiques de S. aureofaciens qui possèdent les propriétés spéciales décrites dans le présent mémoire ont été désignées par les symboles IE-2322 et IE-2750 et déposées aux Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, Etats=Unis d'Amérique, sous les
No NRRL 3204 et 3234.
On comprendra, bien entendu, que des mutantes additionnelles possédant cette propriété spéciale de conférer une teinte déterminée à leurs moûts de récolte entiers peuvent être dérivées de ces souches par les procédés classiques. Ces mutantes peuvent varier quelque peu quant à leurs caractéristiques morphologiques et physiologiques générales, comme les diverses souches de l'espèce S. aureofaciens. Ainsi, la souche No
IE-2750 a été dérivée de la souche No IE-2322 en utilisant des méthodes bien connues dans la technique, par exemple celle consistant à sélectionner des mutantes qui se trouvent dans la nature et celle ayant consisté à sélectionner des mutantes qui se sont présentées à la suite d'un traitement délibéré par le mutagène chimique, la moutarde azotée ou les rayons ultra-violets.
Ces méthodes sont décrites, notamment, dans le texte intitulé Induced Mutagenesis in Selection of Microorganisms (La mutagénèse provoquée dans la sélection des microorganismes) par S.I. Alikhanian, pages 1-50 incl.
de Progress in Applied Microbiology (Progrès de la microbiologie appliquée), Vol. 4 (1962), Academic
Press, New York et Londres. On peut également s'attendre à ce que des souches de S. aureofaciens produisant sélectivement la 7-chloro-6-déméthyltétracycline puissent être trouvées dans la nature, ou être dérivées de souches présentement isolées de S. aureofaciens par des procédés mutagéniques bien connus dans la tech- nique.
Les souches à production sélective présentent les caractéristiques taxonomiques de l'espèce S. aureofa- ci ens et peuvent être aisément identifiées comme appartenant à cette espèce, bien qu'elles diffèrent des souches de S. aureofaciens décrites jusqu'ici, non seulement par la pigmentation sur des milieux solides, mais également par les teintes des moûts de récolte entiers obtenus à partir de ces souches.
Les souches qui sont aptes à produire de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline dans les milieux classiques peuvent être divisées en 3 catégories: 1) souches de S. aureofaciens ATCC 12551, 12552, 12 553, et 12 554 décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2 878 289 et produisant diverses quantités de 7-chloro-6-déméthyltétracycline, 6-déméthyltétracycline, tétracycline et 7-chlorotétracycline; 2) souches de S. aureofaciens V-138, E-475, E-1311, ED1723, ED-2047 et ED-2314 décrites dans les brevets énumérés ci-après:
souche V-138 dans les brevets des
Etats-Unis d'Amérique No 3 037 916, souches E-475,
E-1311, ED-1723 et ED-2047 dans le brevet des
Etats-Unis d'Amérique No 3 050 446, souche ED-2314 dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 3 145 154 et qui produisent diverses quantités de 7-chloro-6-déméthyltétracycline et de 6-déméthyltétracycline virtuellement à l'exclusion de tétracyclines méthylées; et 3) souches -selectionnées suivant le critère déjà décrit, par exemple IE-2322 et IE-2750, qui produisent de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline virtuellement à l'exclusion de toutes autres tétracyclines.
Les souches produisant sélectivement la 7-chloro6-déméthyltétracycline, représentées par exemple par les souches Nos IE-2322 et lE-2750, peuvent se distinguer des deux groupes de souches de la technique antérieure par une interprétation mathématique des courbes de réflectance spectrophotométrique de leurs moûts de récolte entiers respectifs.
Plus précisément, lorsque le pourcentage de réflectance d'échantillons dilués (échantillons aqueux à 1:200) des moûts de récolte entiers d'un bon rendement (tels que ceux des exemples donnés plus loin) desdites souches est mesuré à des longueurs d'ondes déterminées (460 m,u, 540 m,u, 560 mu et 660 m et lorsqu'on relève linéairement le pourcentage de réflectance en fonction de la longueur d'onde, la courbe résultante entre 460 mu et 530 mu présente un point d'inflexion et a au moins un point de pente nulle et elle est convexe vers le haut à gauche du point d'inflexion et concave vers le haut à droite de ce point d'inflexion.
Par exemple, la courbe résultante pour la souche type IE-2322, représentée par la fig. 1 1 des des sins, présente un maximum entre 460 mu et 520 m, (approximativement au point 500 m,u), ce maximum étant un point de pente nulle, a un point d'inflexion à environ 510 m, et a un minimum à approximativement 520 m,u, ce minimum étant un point de pente nulle. Par ailleurs, les souches de cette classe produisent de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline sensiblement à l'exclusion de 6-déméthyltétracycline.
Les fig. 1 à 12 des dessins ci-annexés montrent des courbes de réflectance spectrophotométrique de cellules en verre de 1 cm remplies d'un échantillon dilué (1:200) de moût de récolte entier prélevé dans le bouillon de fermentation des souches produisant sélectivement la 7-chloro-6-déméthyltétracycline, de même que des dix souches connues déjà décrites, indiquées dans le tableau I. La courbe de réflectance spectrophotométrique d'une matière constitue un enregistrement permanent qui n'exige pas la conservation d'un échantillon. Au surplus, les unités qui expriment la courbe sont internationalement admises et acceptées, comme moyen pour mesurer la lumière. Dans les fig. 1 à 12, la longueur d'onde de la lumière en millicrons est donnée en abscisse, tandis que la réflectance en pourcent est donnée en ordonnée.
La longueur d'onde de la lumière a été adoptée internationalement comme étalon fondamental de longueur, auquel tous les autres étalons de longueur se réfèrent. Ces courbes de réflectance spectrophotométrique ont été déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre à enregistrement connu sous la dénomination de General Electric Hardy Recording
Spectrophotometer (General Electric Company, Schenectady, N. Y., USA), l'échantillon étant appliqué sur de l'oxyde de magnésium, l'étalon de référence étant constitué par de l'oxyde de magnésium et la composante spéculaire étant exclue. Les courbes sont enregistrées sur du papier General Electric Co. Chart paper NP 62581 .
En ce qui concerne la détermination spectrophotométrique précitée, on notera que la dilution du moût de récolte entier est nécessaire pour obtenir les résultats indiqués.
Un moût de récolte entier est un moût non traité obtenu lorsqu'une fermentation utilisant le milieu suivant:
Amidon 45 grammes
CaCO8 10,5 grammes
NH4Cl 1,5 gramme
Farine de graines de coton 45 grammes
Levure 1,5 gramme
Eau q. s. ad 1000 ml
Huile de lard 3 O/o (vol./vol.
de milieu) a progressé jusqu'au moment où la biosynthèse de l'antibiotique primaire s'est arrêtée en pratique. En général, dans les conditions indiquées plus loin, l'activité antibiotique du moût de fermentation, telle qu'on peut la déterminer de manière classique, cesse d'augmenter dans une mesure appréciable lorsque la fermentation a duré pendant environ 140 à environ 160 heures. Il est concevable, toutefois, que dans des conditions légèrement différentes l'activité antibiotique maximum peut être atteinte après des durées un peu plus longues ou plus courtes.
Les souches de S. aureofaciens qui ne produisent virtuellement aucune autre tétracycline que la 7-chloro6-déméthyltétracycline possèdent les mêmes caractéristiques morphologiques que les souches qui produisent, de manière concomitante, de la 7-chlortétracycline, de la tétracycline, de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline et de la 6-déméthyltétracycline et les souches qui produisent de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline et une proportion substantielle de 6-déméthyltétracycline, et elles diffèrent entre elles de la même manière générale que les souches connues diffèrent l'une de l'autre, comme cela a été décrit dans un certain nombre d'articles scientifiques publiés.
Les données qui figurent dans les tableaux suivants peuvent servir à une distinction accessoire des souches mutantes nouvelles et originales de
S. aureofaciens, décrites ci-après, de la souche A-377 originelle que l'on peut se procurer sous le
No NRRL 2209, et de la souche de McCormick et al.
ATCC No 12 551 (S-604). Dans les observations suivantes de la coloration d'une série de milieux, les données de coloration de la souche S-604 (ATCC 12 551) ont été reproduites d'après le Brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2 878 289.
Pour illustrer les variations visuelles de couleur que l'on rencontre avec les souches mutantes nouvelles et originales de S. aureofaciens, on a fait pousser ces souches sur de l'agar AP4 et on a fait les observations suivantes:
Observations de couleur: t S. aureofaciens: ** Agar AP4:
six jours Incubation à 26,5 C
Souche Colonies simples
Colonie principale Colonie secondaire Croissance en masse
Type I Type II 1E-2322 7pl (rouge bleuâtre) t à 8pn (brun rougeâtre 7pl (rouge bleuâtre) i à
7nl (brun-rose foncé) t et grisâtre foncé) t 7nl (brun-rose foncé) lE-2750 5pn (brun chocolat) t 8pn (brun rougeâtre 61/2 ni (brun-rose) t
et grisâtre foncé) t I Les teintes précitées, ainsi que celles dont il est question dans la suite du présent mémoire (lorsqu'elles sont désignées 1), sont celles
du ColorHarmonyManual , 3e édition,
Container Corporation of America (Editeur).
* Le symbole-code est la seule désignation, aucun nom de couleur attribué ne figurant dans le zColor Harmony Manuel,.
** Composition de l'Agar AP4
Saccharose 1,0 gramme
MgSO4. 7H20 0,025 gramme
KH2PO4 0,2 gramme (NH4)2HPO4 0,2 gramme
Liqueur de macération de maïs 0,4 gramme
Agar Bacto 2,0 gramme
Eau, q. s. 100,0 millilitres
pH après stérilisation = 6,3
Les nouvelles souches de S. aureofaciens citées comme exemples se différencient en outre de la souche comparative S. aureofaciens A-377 (NRRL 2209) par observation des caractéristiques de croissance sur divers milieux incubés à 26,50 C jusqu'à maturité.
(1) Agar avec Glycérol,
Asparagine et Extrait de boeuf
Glycérol 1,0 gramme
L-asparagine 0,05 gramme Agar Bacto 1,5 gramme
Extrait de boeuf 0,2 gramme Eau distillée, q. s. 100 millilitres
KH2KO4 0,05 gramme Réglage du pH à 7,0 avec KOH en solution à 50 oxo.
pH apres stérilisation = 7,1.
Streptomyces aureofaciens
Souche lE-2750 Souche 1E-2322
Croissance modérée, 3pn (brun-jaune- modérée, 5nl * (chocolat) t
rouge jaunâtre foncé) t à à 6 t/2 ni (brun-rose)
6pl (brun rougeâtre sombre)Ú
Hyphes aériens minces à moyens, blanc abondants, blanc devenant
5dc (gris rosâtre) t
Sporulation nulle incomplète
Pigment diffusible roux devenant ambre ambre foncé
Envers 3pn (brun-jaune-rouge 5pl (brun sombre)' à
jaunâtre foncé) l à 6 t/2 ni (brun-rose)'
6pl (brun rougeâtre sombre) i
Souche S-604 ** Souche A-377 **
Croissance abondante,
6pi (brun- moyenne
jaune-rouge rougeâtre) l
Hyphes aériens abondants, blanc à rose-gris blanc, uniforme
Sporulation faible devenant abondante nulle
Pigment diffusible brun rougeâtre jaune
Envers 6pi (brun rougeâtre) l jaune à jaune orange clair
* Couleurs selon le zColor Harmony Manuel , 3e édition, Container Corp. of America; pas de nom de couleur attribué.
** à titre comparatif
(2) Agar avec Dextrine (Czapex-Dox) KCl 0,05 gramme
Dextrine 1,0 gramme FeSO4 . 7H2O 0,001 gramme
NaNO3 0,2 gramme Agar Bacto 1,5 gramme
K2HPO4 0,1 gramme Eau distillée, q. s. 100 millilitres
MgSO4.
7H2O 0,05 gramme pH après stérilisation = 7,2
Streptomyces aureofaciens
Souche lE-2750 Souche 1E-2322
Croissance confluente, mince, confluente, mince,
transparente, incolore transparente, incolore
Hyphes aériens nuls nuls
Sporulation nulle nulle
Pigment diffusible nul nul
Envers translucide translucide
Souche S-604 * Souche A-377 *
Croissance clairsemée, hyaline profuse
Hyphes aériens nuls abondants, gris plomb,
globules superficiels
d'un blanc aqueux
Sporulation nulle abondante
Pigment diffusible nul léger, jaune pâle
Envers non pigmentaire non pigmentaire * à titre comparatif
(3) Agar AP4 (tel que décrit plus haut)
Streptomyces aureofaciens
Souche 1E-275Q Souche 1E-2322
Croissance abondante à profuse, 8pl profuse,
7pl (rouge bleuâtre) t à
(brun-gris rougeâtre foncé)' 7nl (brun-rose foncé)'
à 8pn (brun rougeâtre et grisâtre foncé) t
Hyphes aériens minces à modérés, modérés, 5dc (gris rosâtre) t à
5dc (gris rosâtre)' Sfe (gris brunâtre clair)'
Sporulation mince à modérée moyenne
Pigment diffusible brun rougeâtre à brun-rouge sombre
brun rougeâtre sombre
Envers 8pl (brun-gris rougeâtre 7pl (rouge bleuâtre) t à
foncé) l à 8pn (brun rougeâtre 7nl (brun-rose foncé)'
et grisâtre foncé)'
Souche S.604* Souche A-377 *
Croissance profuse profuse
Hyphes aériens abondants, 71i (brun-rouge abondants,
41i (brun-jaune
grisâtre) t grisâtre foncé) t
Sporulation très abondante, uniforme très abondante, uniforme
Pigment diffusible très conçentré, Spl (brun jaune verdâtre clair
sombre) 1à 6pl (brun
rougeâtre sombre)'
Envers 6pn (brun rougeâtre foncé)' 2n1 (brun olive) t * à titre comparatif
(4) Agar Q4 avec liqueur de macération de maïs (NH4)2HPO4 2 grammes
(Liqueur de macération de maïs) 9 grammes KH2PO4 4 grammes
Saccharose 10 grammes Agar brut 30 grammes
MgSO4. 7HaO 0,25 gramme Eau, q. s.
1000 millilitres
pH après stérilisation = 6,5
Streptomyces aureofaciens
Souche lE-27S0 Souche 1E-2322
Croissance abondante, 8pl (brun-gris abondante, 7pl (rouge bleuâtre) t à
rougeâtre foncé) t à 7nl (brun-rose foncé)Ú
8pn (brun rougeâtre et
grisâtre foncé) t
Souche lE-2750 Souche IE-2322
Hyphes aériens moyens à modérés, minces,
5fe
Sdc (gris rosâtre) t à (gris brunâtre clair)'
Sfe (gris brunâtre clair)'
Sporulation mince à moyenne rare
Pigment diffusible spl (brun-gris 7pl (rouge bleuâtre) t à
rougeâtre foncé)Ú 7nl (brun-rose foncé)'
Envers 8pn (brun rougeâtre et 7pl (rouge bleuâtre) t à
grisâtre foncé)Ú 7nl (brun-rose foncé)'
Souche S-604 * Souche A-377 *
Croissance profuse, 7pl excellente, jaune pâle
(rouge bleuâtre)'
Hyphes aériens profus, Snl (chocolat)' profus,
2pn
(brun foncé)'
Sporulation profuse profuse
Pigment diffusible 7pl (rouge bleuâtre)' brun-orange
Envers 7pl (rouge bleuâtre) l orange à jaune-orange * à titre comparatif
(5) Autres milieux d'Agar
Milieu Streptomyces aureofaciens
Souche lE-2750 Souche 1E-2322
Agar nutritif croissance confluente faible à croissance mince;
moyenne; 6pn (brun rougeâtre foncé) t. Spn (brun chocolat) l.
Absence d'hyphes aériens. Pigment Absence d'hyphes aériens.
diffusible roux teinté de brun Pigment soluble violacé clair.
rougeâtre. Envers: 6pn Envers: 5pn (brun chocolat) t.
(brun rougeâtre foncé)'.
Agar avec glucose, croissance bonne à abondante, croissance abondante; asparagine, 5pi (brun rougeâtre et jaunâtre) l à 5pl (brun sombre)Ú.
extrait de viande 6pi (brun rougeâtre)Ú. Hyphes aériens abondants; blancs
Hyphes aériens abondants devenant 5fe (gris brunâtre clair)Ú.
uniformément 5dc (gns rosâtre)'. Sporulation abondante.
Sporulation abondante. Pigment soluble jaune sombre.
Pigment diffusible jaune-roux clair Envers: 5pl (brun sombre)'.
devenant ambre. Envers: Spi
(brun rougeâtre et jaunâtre)' à
6pi (brun rougeâtre) l devenant
6pn (brun rougeâtre foncé) t.
Lait pourpre collet de croissance prononcée, collet de croissance prononcée;
51i (brun rougeâtre et grisâtre)' à 51i (brun rougeâtre ea grisâtre)' à
7nl (brun rose foncé)'. 6 1/2 ni (brun rose) t.
Changement de pH peu sensible. Changement de pH peu sensible.
Fausse réaction colorée alcaline Fausse réaction colorée alcaline
due à la diffusion du pigment. due à la diffusion du pigment.
pH 6,75 à 2 semaines pH 6,75 à 2 semaines
Cultures inclinées croissance crénelée abondante et croissance crénelée sur pommes de terre humide, 4gl (brun-jaune rougeâtre)' abondante et humide;
clair à 5pi (brun rougeâtre et 4pg (orange-brun foncé)' devenant *
jaunâtre devenant lOpo 7po à lOpo (noir violacé)'.
(noir violacé)'. Pigment soluble
Tendance à former des zones denses 6ig (brun rouge grisâtre clair)Ú.
et blanches d'hyphes aériens à Absence d'hyphes aériens.
foyers distincts. Pigment diffusible:
5ig (brun-rouge grisâtre clair)' à
51i (brun rougeâtre et grisâtre)'.
* Le symbole-code est la seule désignation, aucun nom de couleur attribué ne figurant dans le zColor Harmony Manual > .
Milieu Streptomyces aureofaciens
Souche S-604 * Souche A-377 *
Agar nutritif 51i (brun rougeâtre et grisâtre) 1 à croissance assez bonne.
Croissance médiocre. Absence d'hyphes aériens.
2pn (brun foncé) t. Absence Envers: jaune pâle. Pigment soluble
d'hyphes aériens. Envers: jaune à jaune brunâtre clair.
2pn (brun rougeâtre et grisâtre) l.
Pigment soluble brun rougeâtre.
Agar avec glucose, croissance abondante. croissance assez bonne.
asparagine, Hyphes aériens prononcés, marbres. Hyphes aériens blancs devenant de
extrait de viande 5ig (brun-rouge grisâtre clair) i à plus en plus gris à mesure qu'aug
4ig (brun-jaune rougeâtre) t à mente la formation de spores.
3ge (brun-jaune grisâtre clair)Ú. Envers: jaune clair.
Sporulation: abondante. Envers: 2pn Pigment soluble jaune clair.
(brun rougeâtre et grisâtre)'.
Pigment soluble brun rougeâtre.
Lait pourpre léger collet de croissance léger collet de croissance blanc
6 '/2 pl (brun-rouge rougeâtre sombre)'. à jaune pâle. Pas de changement
Pas de changement notable du PH, notable du pH, ni de peptonisation
ni de peptonisation apparente. apparente en 15 jours.
Légère fausse réaction colorée alcaline
due à la diffusion du pigment soluble.
Cultures inclinées croissance noduleuse lisse, croissance noduleuse lisse,
sur pommes de terre humide et abondante; humide et abondante;
6pn (brun rougeâtre foncé) l 3ea (jaune orange pâle) t à
avec traces de 5gc 71e (rouge grisâtre) t.
(brun orange rougeâtre et grisâtre)'. Traces d'hyphes aériens.
Hyphes aériens: nuls à abondants Pas de pigment soluble.
devenant blancs à 3ge
(brun-jaune grisâtre clair)'.
Sporulation abondante dans les
zones d'hyphes aériens denses.
Pigment soluble 5nl (chocolat) t à
5pn (brun chocolat) t.
* à titre comparatif
(6) Observations microscopiques
S. aureofaciens Agar avec Glucose, Agar Q4
Asparagine et Extrait de boeuf
Souche Mycélium Flexueux, continu, ramifié. Flexueux, continu, ramifié.
îE-2322 Spores Diamètre 0,8 à 1,2 . Diamètre 0,8 à 1,2 z.
Sphériques à ovoïdaux. Sphériques à ovoïdaux.
Diamètre 0,8 à 1,5 u. Diamètre 0,8 à 1,5 u
Souche Mycélium Flexueux, continu, ramifié. Flexueux, continu, ramifié.
îE-2750 Spores Diamètre 0,8 à 1,2,u. Diamètre 0,8 à 1,2 tL-
Sphériques à ovoïdaux. Sphériques à ovoïdaux.
Diamètre 0,8 à 1,5,u. Diamètre 0,8 à 1,5 .
Souche Mycélium Flexueux, continu, ramifié. Flexueux, continu, ramifié.
S-604 * Spores Diamètre 0,8 à 1,0 u. Diamètre 0,8 à 1,2 u
Sphéroïdaux à ovoidaux. Sphéroïdaux à ovoïdaux.
Diamètre 1,5 à 2,0 u Diamètre 1,5 à 2,0 .
S. aureofaciens Agar avec Glucose, Agar Q4
Asparagine et Extrait de boeuf
Souche Mycélium Flexueux, continu, ramifié. Flexueux, continu, ramifié.
Diamètre 0,7 à 1,0 . Diamètre 0,8 à 1,2 u
A-377 * Spores Sphéroïdaux à ovoïdaux. Sphéroïdaux à ovoïdaux
Diamètre 1,5 à 2,0 jet. Diamètre 1,5 à 2,0 y.
* àtitrecomparatif
La morphologie des mycélia et des spores, comme on la voit au microscope ordinaire, est apparemment semblable pour les souches 1E 2322 et 1E-2750 comme pour les souches comparatives A-377 et S-604.
Cependant, les diamètres du Mycélium typique et des spores des premières souches paraissent, de manière caractéristique, plus petits que ceux des souches mentionnées en dernier lieu. Toutes les souches présentent un mycélium continu, flexueux et ramifié avec une tendance occasionnelle des hyphes aériens à présenter des crochets ou des boucles ou à former des spirales libres primitives telles que celles qui sont typiques de l'espèce
S. aureofaciens.
Les conditions de la fermentation sont généralement les mêmes que pour les procédés de production de chlortétracycline par fermentation connus actuellement.
Ainsi, le milieu de fermentation contient les sources assimilables usuelles de carbone, d'azote et de sels minéraux. Des substances nutritives appropriées sont l'amidon, le dextrose, le suçre de canne, le glucose, les mélasses, la farine de soja, le lait en poudre, la levure, les extraits de viande, la peptone, l'urée, la liqueur de macération de maïs (cornsteep)i, la farine de graines de coton, les produits solubles de distillation, les huiles glycéridiques, la farine de poisson et d'autres substances classiques. Les sels minéraux comprennent, par exemple, le carbonate de calcium, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium et les sels de divers oligo-éléments, tels que le manganèse, le cobalt, le zinc, le cuivre, le fer, etc.
Les autres conditions générales de la fermentation, telles la concentration des ions d'hydrogènes, la température, la durée, le degré d'aération, la préparation de l'inoculum, la stérilisation, l'inoculation, etc., sont classiques et peuvent être semblables à celles prévues pour la production de 7-chloro-6-déméthyltétracycline décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique
No 2.878.289.
La récupération de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline de la liqueur de fermentation se fait de la manière habituelle et n'a pas besoin d'être décrite, car de nombreux procédés permettant de récupérer ce produit des liqueurs de fermentation ont déjà été publiés.
L'invention sera décrite d'une manière plus détaillée dans l'exemple particulier suivant:
Exemple
On a préparé un milieu de fermentation contenant les ingrédients suivants:
Amidon 45 grammes
CaCOs 10,5 grammes
NH4Cl 1,5 gramme
Farine de graines de Cotorl 45 grammes
Levure 1,5 gramme q. s. ad 1000 milllXitress
Ce milieu a été réparti, en quantités appropriées, dans des flacons contenant 3 o/o (vol./vol. du milieu) çlthuile de saindoux, après quoi on stérilisé le contenu de ees flacons, Ces flacons ont ensuite été divisés en 12 groupes contenant environ le même nombre de flacons.
Chaque groupe a été ensuite inoculé à l'aide d'un inoculum végétai d'un des souches suivantes de S. aureo faciens.
5-609* (ATCC 12.551)
S-1071 * (ATCC 12.552)
V-62 * (ATCC 12.553)
B-740 * (ATCC 12.554)
V-138 *
E-475 * S1311 *
ED-1723 g ED-2047*
ED-2314 *
IE-2322
IE-2750
* à titre comparatif
Tous les flacons ont ensuite été incubés sur un agitateur rotatif animé d'un mouvement circulaire de 6,25 cm à 185-200 tours par minute à 25 C pendant 180 heures. Des échantillons ont été prélevés, dilués avec 199 parties d'eau et les courbes de réflectance ont été déterminées de la manière décrite plus haut. Les résultats sont indiqués dans les fig. 1 à 12. Les résultats des essais effectués sur les échantillons de moûts de récolte sont indiqués dans le tableau I donné plus loin.
Ces essais ont été effectués en utilisant les procédés suivants:
Essai No 1:
Cet essai est basé sur la différence qui existe entre les vitesse de transformation de la 7-chloro-6-déméthyl- tétracycline et de la 6-déméthyltétracycline en leurs formes anhydro respectives, par une réaction de pre mier ordre catalysée par un acide. Le degré de transfor mation en forme anhydro dépend de la durée, de la température et de la concentration de l'acide produisant une réaction qui donne lieu à une diminution d'absorbance à 368 mu et une augmentation d'absorbance à 440 nec.
Essai No 2:
Cet essai est basé sur le même principe essentiel que l'essai No 1, si ce n'est que dans ce cas l'échantillon est traité avec un acide afin de dégrader toutes les tétracy dindes présentes, pour les transformer en forme anhydro dans un cas, en comparaison d'un échantillon traité à l'eau dans le second cas.
Essai No 3:
Les valeurs énumérées dans cette colonne ont été déterminées par un procédé classique de chromatographie sur papier, en utilisant le système phosphate de sodium/acétate de n-butyle 0,3M donnant un Rf de 0,30 pour la 6-déméthyltétracycline. Trois systèmes similaires, publiés dans le Journal of the American Chemical Society, Vol. 79, pp. 4561-4563 (1957) (McCormick et al.), sont indiqués ci-après.
Gdéméthyl-
tétracycline
Système Rf
Phosphate de sodium 0,3 M/n-butanol (pH 3,0) 0,30
Tampon Mac Ilvaine/acétate d'éthyle (pH 4,7) 0,27 0,3 N H3PO4, 0,1 /o CC13COOH 9:1
CHCl3-n-butanol 0,22
Dans ce tableau I, le pourcentage de 6-déméthyltétracycline (colonne 4) des quatre premières souches comparatives (S-604, S-1071, V-62 et B-740) a été déterminé en cherchant la quantité de 6-déméthyltétracycline par chromatographie sur papier (colonne 3) et en divisant ce chiffre par la quantité totale de déméthyltétracyclines déterminée par analyse spectrophotométrique (colonne 1) et par analyse chromatographique (colonne 3).
Le pourcentage de 6-déméthyltétracycline (colonne 4) produit par le restant des souches est déterminé en divisant l'analyse chromatographique (colonne 3) par l'analyse spectrophotométrique des tétracyclines totales (colonne 2).
Tableau I
Essai
No. 1 No. 2 No. 3
S. aureofaciens DMCTC Tétra- DMTC y/ml 'lo DMTC
Souche No. y/ml cyclines Chromato
totales gramme
y/ml quantitatif
sur papier
S-604 ** 1193 2037 110 8,4 S-1071 ** 876 2428 138 13,1
V-62 ** 1177 2255 573 32,7
B-740 ** 1042 2553 380 26,7
V-138 ** 960 1817 645 35,5
E-475 ** 2348 3601 847 23,5
E-1311 ** 3186 4263 820 19,2
ED-1723 ** 1961 3304 1320 39,9
ED-2047 ** 4726 6316 1775 28,1
ED-2314 ** 4946 6650 1100 16,5 1E-2322 3281 3197 pas dé- 0
tectée * lE-2750 3451 3566 pas dé- 0
tectée *
* Pas de 6-déméthyltétracycline trouvée au taux le plus faible détectable de 1 y/ml.
** à titre comparatif.