MC623A1 - Procédé perfectionné pour la production de 7-chloro-6-demethyltetracycline - Google Patents

Description

BREVET D'INVENTION

Procédé perfectionné pour la production de J-ohloroS-déméthyltétracycline.

Société dite : AMERICAN CYANAMID COMPANY

La présente invéntion est relative à un procédé perfectionné pour la production de 7-chloro-6-déméthyltétracycline. Elle concerne, plus particulièrement, la production sélective de 7-chloro-6-déméthyl-5 tétracycline par biosynthèse fermentative, en utilisant

des souches de Streptomyces aureofaclens qui confèrent à leurs moûts de récolte entiers une coloration telle que

(I) une valeur positive ÛR est obtenue lorsque les valeurs de pourcentage de réflectance d'une solution aqueuse diluée à 1î200 du moût de récolte entier à 460 ncp., 5^0 mp, 560 mp. et 660 mp. sont introduites dans la formule suivante :

^R=R540 + R560~ 1,1 r460"°'9 r66O~2'

ou

(II) la courbe de réflectance de couleur d'une dilution aqueuse à 1:200 du moût de récolte entier a comme propriété que, lorsqu'on porte linéairement sur un graphique

(

le pourcentage de réflectance en fonction de la longueur d'onde, la courbe résultante entre iiôO m)x et 530 .mp. présente un point d'inflexion et a au moins un point de pente nulle et qu'elle est convexe vers le haut à gauche du point d'inflexion et concave vers le haut à droite de ce point d'inflexion.

L'antibiotique qu'est la 7-chloro~6-déméthyltétraeycline a été pour la première fois décrit et revendiqué dans le brevet Jo des Etats-Unis d'Amérique N° 2,878.289 (McCormick et al.)5 qui décrit aussi des procédés pour la production de cet antibiotique. Dans ce brevet on décrit un procédé au moyen duquel on cultive une souche de £>. aureofaciens productrice de 7-chloro-6-démé-thyltétracycline dans un milieu de fermentation. Ce brevet pré-cise aussi que d'autres tétracyclines, telles que la 6-déméthyl-tétracycline, la 7-ehlorotétracycline et la tétracycline sont obtenues en même temps, dans un milieu de fermentation, lorsque les conditions de fermentation, y compris le microorganisme indiqué dans ce brevet, sont utilisées. Ce brevet indique, \p en outre, qu'il se peut qu'on obtienne de la 7~brpmo~6-déméthyl-tétracycline comme produit concomitant lorsque le milieu de fermentation contient du brome. Par ailleurs, la production de plus d'une tétracycline dans un milieu de fermentation dans lequel peut être produite de la déméthylchlortétracycline est également révélée dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique ÎT° 3.028.311 (Perlman et al.), ainsi que dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3'-061.522 (Neidleman), dans lesquels on décrit la présence d'inhibiteurs dits de 6-méthylation dans un milieu de fermentation dans lequel on utilise une souche de S. aureofaciens" productrice de 7~chlortétracycline.

- 3 -

%

k

D'autres procédés pour la production do 7-chloro-6~ déméthytétracycline par culture de souches de S, aureofaciens productrices de 7-chlortétracycline en présence d'inhibiteurs de 6-méthylation sont donnés dans les brevets des Etats-Unis ^ _ d'Amérique n°s 3.03-9.172 et 3.127.328 (Goodman et al,). Ces procédés se heurtent également au problème de la formation concomitante d'autres tétracyclines , Ainsi? dans chacun de ces procédés, un mélange de 7~chlortétracycline, tétracycline, 7™chloro«>6-déméthyltétracycline et 6-démethyltétracycline , est yfo produit.

La production concomitante do 6-déméthyltétracycline (ou d'autres tétracyclines) est répréhensible lorsque la 7-chloro<=-6-déméthyltétracycline est le produit principal recherché. Bien que la 7™chloro=6-déméthyltétracycline de qualité pharma-^ ceutique puisse contenir de petites quantités de 6-démethyltétracycline, la présence d'une quantité substantielle de 6-=démethyltétracycline est répréhensible. La présence de 6-=démethyltétracycline (ou d'autres tétracyclines) dans le môme moût de fermontation en quantités notables pose également des problèmes difficiles de séparation, au cours des traitements de raffinage ou d'extraction, lorsqu'on désire obtenir de la 7™chloro~6-déméthyltétracycline. Il est évidemment possible d'extraire les antibiotiques du moût de fermentation et de les séparer par des procédés de raffinage sélectifs. Cepen» ^/\ dant, les procédés de raffinage pour séparer les antibiotiques sont difficiles et impliquent habituellement une certaine perte de l'activité antibiotique totale. De plus, dans les cas où la 7"Chloro-6~déméthyltétracycline est le principal produit de la fermentation , la 6-déméthyltétracycline (ou d'autres So tétracyclines) est indésirable et est ordinairement séparée et jetée. C'est pourquoi un procédé permettant la production

%

•\

accrue cle 7-chloro-6-déméthyltétracycline et une production conjomitante moindre de 6-déméthyltétracycline (ou d'autres tétracyclines) constitue un progrès notable dans la technique de l'obtention d'antibiotiquespar fermentation, ^ On a découvert selon l'invention d'une manière inatten due, que certaines souches mutantes nouvelles et originales do Streptomyces aureofaciens produisent, dans un milieu de fermentation classique, de la 7-chloro-6-démethvltétracycline, en même temps qu'une quantité ne dépassant pas 5% de 6-démethyl~ tétracycline comme produit concomitant. Par ailleurs, il n'y a pas de production décelable de tétracycline ou de 7-chlorotétra-cycline avec les souches mutantes nouvelles selon l'invention, La découverte de ces souches évite la nécessité d'employer des procédés coûteux et difficiles d'extraction et de purification étant donné, que les cristaux de 7~chloro-6-déméthyltétracycline obtenus sont de qualité pharmaceutique ,

Les souches mutantes nouvelles et originales suivant la présente invention sont des souches de l'espèce Streptomyces aureofaciens L Les souches S, aureofaciens représentatives décrites ci-dessous sont des descendantes directes de la souche de Sj. aure ofac i en s A-377 pcodiaotrice de 7-chlorotétracycline isolée du sol décrite dans le Brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 2.482i,055 (Duggar) et déposée aux Northern Régional Research Laboratories, Peoria, Illinois, Etats-Unis d'Amérique, et réperto-rié sous le n° NRRL 2209,.Elles ont été obtenues par des procédés mutagéniques connus dans la technique , par exemple par irradiation au moyen de rayons ultra-violets, par traitement avec de la nicotine ou par traitement avec de la moutarde à 11 azote. Des souches mutantes caractéristiques de S.aureofaciens Vo qui possèdent les propriétés spéciales décrites dans le présent mémoire ont été désignées par les symboles IE-1352, IE-I354, IE-1355 et IE-2322...

6

Il est entendu que dos mutantes additionnelles possédant cette propriété spéciale de conférer une teinte déterminée à leurs moûts de récolte entiers peuvent être dérivées de ces souches par les procédés classiques. Ces ^ mutantes peuvent varier quelque peu quant à leurs caractéristiques morphologiques et physiologiques générales, comme les diverses souches de l'espèce S, aureofaciens . Ainsi, les souches n° IE-2803 et n° IE-2750 ont été dérivés respectivement des souches n° IE-1352 et n° IE-2322 en utilisant des méthodes bien connues dans la technique, pour sélectionner des mutantes naturelles et pour sélectionner des mutantes résultant d'un traitement délibéré par le mutagène chimique, la moutarde à l'azote ou les rayons ultra»violets. Ces méthodes sont décrites, notamment, dans l'article intitulé " Induced

S

^ Mutagenesis in Selection of Microorganisms " (La mutagénèse provoquée dans la sélection des microorganismes)par S.I. Alikhanian, pages 1-50 incl,.de " Progress in Applied Microbiology'' (Progrès de la microbiologie appliquée) Vol.4 (1962), Academic Press, New-York et Londres. On peut ho également s'attendre à ce que les souches de S. aureofaciens productrices de 7-chloro-6-démethytétracycline suivant l'invention puissent être trouvées da»s la nature ou être dérivées de souches présentement isolées de S. aureofaciens par des procédés mutagéniques bien connus dans la technique.

les caractéristiques taxonomiques de l'espèce S. aureofaciens et peuvent être aisément identifiées comme appartenant à cette espèce, bien qu'elles diffèrent des souches de S. aureofacienf décrites'jusqu'ici , non seulement par la pigmentation sur des

Les souches suivant la présente invention présentent

milieux solides, mais également par les teintes des moûts i

de récolte entiers obtenus1 à partir de ces souches.

En général, ces souches nouvelles et originales (classes I et II) et les souches qui sont connues actuel-/^lement dans la technique pour leur capacité de production de 7-chloro-6-déméthyltétracycline dans les milieux classiques peuvent être divisées en 3 catégories: 1) souches de S. aureofaciens ATCC 12.551, 12.552, 12.553 et 12.55^ décrites dans le "brevet des Etats-Unis d'Amérique 2.878.289 Jo (McCormick et al.) et produisant diverses quantités de 7-chloro-6-déméthyltétracycline, 6-déméthyltétracycline, tétracycline et 7-chlorotétracycline; 2) souches de S. aureofaciens V-I38, E-^75, E-1311, ED-1723, ED-2C$+7 et ED-2311* décrites dans les brevets énumérés ci-après: souche V-138 dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3.037.916 (Goodman), souches E-ti-75, E-1311, ED-1723 et ED-20^7 dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3«050.!+1+6 (Goodman), souche ED-2311*- dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3.1^5.15^ (Goodman) et qui produisent diverses quantités de 7-chloro-6-déméthyltétracycline 0X/0 et de 6-déméthyltétracycline virtuellement à l'exclusion de tétracyclines méthylées; et 3) nouvelles souches suivant la présente invention, IE-1352, 13-135^, IE-1355, IE-2803, IE-2322 et IE-2750, qui produisent de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline virtuellement à l'exclusion de toutes autres tétracyclines.

Les souches mutantes nouvelles et originales de la classe I suivant la présente invention, représentées par les souches NOS IE-1352, IE-1351»-, IE-1355 et IE-2803^ peuvent se distinguer des deux groupes de souches de la technique antérieure par une interprétation mathématique des courbes de réflectance spectrophotométrique de leurs moûts de récolte entiers respectifs. Plus précisément, lorsque le pourcentage

- 7 -

de réflectance d'échantillons dilués (dilution aqueuse à 1:200) des moûts de récolte entiers d'un bon. rondement - (tels que ceux des exemples donnés plus loin) des souches nouvelles et originales suivant la présente invention est mesuré à des longueurs d'ondes déterminées (i+ôO my, 5^0 mp,; 560 mji et 660 mp,) et lorsque les pourcentages de réflectance à ces longueurs d'ondes par-= ticulières sont introduites dans la formule suivante :

R==R5^0 + R560 ~ 1'1 \60 " °'9 R660 " 2>°

un résultat défini est obtenu. Chacune do ces quatre souches de la classe I suivant l'invention, à savoir les souches IE-1352 IE"»1354? IE-1355 et IE-2803 produit une valcur.A-R positive (supérieure à 0), tandis que chacune des souches représentatives de la technique antérieure donne une valeur A R négative (inférieure à 0), La lettre R désigne la valeur de réflectance à une longueur d'onde déterminée ; ainsi, ^60 ^dique la valeur de réflectance à une longueur d'o.-de de 560 mp,.

Les souches mutantes nouvelles et originales de la classe II suivant la présente invention, représentées par la souche n° IE-2322 et n° IE-2750, peuvent se distinguer des deux groupes de souches de la technique antérieure par le fait que l'analyse de réflectance de couleur d'une solution aqueuse diluée à 1:200 du moût do récolte entier, déterminée dans les mêmes conditions spectrophotométriques et avec le même appareil que les courbes dos quatre autres souches, a comme propriété que, lorsqu'on porte linéairement sur un graphique, le pourcentage de réflectance en fonction de la longueur d'onde, la courbe résultante entre 460 mp. et 530 mp présente un point d'inflexion et a au moins un point de pente nulle et qu'elle est convexe vers le haut à gauche du point d'inflexion et concave vers le haut à droite de fce point d'inflexion. Par exemple, la courbe résultant pour la souche type IE-2322, représentée par la FIGURE 12+ des

9

dessins, présente un maximum entre l±60 mia, et 520 mji (approximatif- ment au point 500 mp), ce maxirum étant un point de pente nulle, présente'un point d'unflexion à environ 510 m.|i et un minimum a approximativement 520 mp, ce minimum étant un point de pente nulle. Par ailleurs, les souches de cette classe produisent de la 7"chloro-6-déméthyltétracycline sensiblement à l'exclusion de 6-déméthyltétracycline.

des courbes de réflectance spectrophoijonétrique obtenues avec des cellules en verre de 1 cm remplies d'un échantillon dilué (1:200) de moût de récolte entier prélevé dar ~ le bouillon de fermentation des souches mutantes nouvelles et originales suivant la présente invention, de même que des dix souches connues déjà décrites, indiquées dans le tableau I. La courbe de réflectance spectrophotométrique d'une matière constitue un enregistrement permanent qui n'exige pas la conservation d'un échantillon. De plias, les unités qui expriment la courbe sont interna-tionalement admises et acceptées comme moyen pour mesurer la lumière. Dans les figures 1 à 16, la longueur d'onde de la lumière en millicrons est portée en abcisse, tandis que la réflectance en pourcent est portée en ordonnée . La longueur d'onde de la lumière a été adoptée internationalement comme étalon fondamental de longueur, auquel tous les autres étalons de longueur se réfèrent. Ces courbes de réflectance spectrophotométrique ont été déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre enregistreur connu sous la dénomination de " General Electric Hardy Recording Spectrophotometer " (General Electric Company, Schenectady, H.Y., U.S.A.), l'échantillon étant appliqué sur de l'oxyde de magnésium, l'étalon de référence étant constitué par de l'oxyde de magnésium et la composante spéculaire étant exclào Les courbes sont enregistrées sur du papier '' General Electric Co. Chart paper NP 62581".

Les figures 1 à 16 des dessins ci-annexés montrent

10

En ce qui concerne la détermination spectrophotométrique précitée, on notera que la dilution du moût de récolte entier est nécessaire pour obtenir les résultats mathématiques indiqués.

A

Si le moût de récolte entier est utilisé à l'état non dilué,

la différence en ce qui concerne la valeur À R entre les nouvellos souches et les souches connues n'apparaît pas. Ce n'est que lorsque le moût de récolte entier est dilué avec de l'eau à

raison de 1 partie de moût de récolte entier pour 2f0 parties d'eau que les résultats inhabituels, c'est-à-dire une valeur A, R

positive pour les nouvelles souches de la classe I et une valeur

A.R négative pour les souches de la technique antérieure^

apparaissent de manière évidente.

Un " moût de récolte entier'' est un moût non traité

obtenu lorsqu'une fermentation utilisant le milieu suivant :

Amidon . 45 grammes

CaCO^ ... 10,5grammes

NH^Cl l,5gramme

Farine de graines de coton ...... 45 grammes

Levure - l,5gramme

Eau q. s. ad lwQO ml

Huile de saindoux 3% (vnl./vo-l.

. dTe milieu)

a progressé jusqu'au moment où la biosynthèse de l'antibiotique primaire s'est arrêtée en pratique, Eçi général, dans les conditions indiquées plus loin, l'activité antibiotique du moût de fermentation, telle qu'on peut la déterminer de façon classique, cesse d'augmenter de façon appréciable lorsque la fermentation a duré pendant environ 14# à environ l&C heures. Il est concevable, toutefois, que dans des conditions légèrement différentes l'activité antibiotique maxima" puisse être atteinte après des durées un peu plus longues ou plus courtes .

11

10

15.

20

Les souches mutantes nouvelles et originales de S. aureofaciens suivant la présente invention, qui ne produisent virtuellement aucune autre tétracycline que la 7~chloro~6~ déméthyltétracycline, possèdent les mômes caractéristiques morphologiques que les souches qui produisent, de manière concomitante, de la 7~chlo:i$;étracycline, de la tétracycline,

de la 7-"chloro~6*»déméthyltétracycline et de la 6-déméthyltétracycline et les souches qui produisent de la 7-chloro-6~déméthyl~ tétracycline et une proportion substantielle de 6-déméthyltétracycline j et elles diffèrent entre elles de la môme manière générale que les souches connues diffèrent l'une de l'autre,

comme cela a été décrit dans un certain nombre d'articles scientifiques publiés. Les données qui figurent dans les tableaux suivants serviront à distinguer davantage les souches mutantes nouvelles et originales de S. aureofaciens de classe I et II, décrites dans le présent mémoire, de la souche A-377 primitive que l'on peut se procurer sous le n° i:'RRL 2209 et de la souche de McCormick et al.,ATCC n° 12.551 (S-ôOij.)

Dans les observations suivantes de la coloration d'une série de milieux, les données de coloration de la souche S-60i+

(ATCC 12.551) °nt été reproduites d'après le Brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 2.878.289.

Pour illustrer les variations visuelles de couleur que l'on rencontre avec les souches mutantes nouvelles et originales de S. aureofaciens suivant la présente invention , on fait pousser ces souches sur de l'agar AP2+ et on a fait les observations suivantes .

'ft

Observations de couleur: 1 S. aureofaciens: Agar Apî+: six jours

Incubation à 26,5° C

Souche

Colonies simples Colonie principale Colonie secondaire Type 1 Type II

Croissance en masse

<

1E-1352

5pn (brun chocolat)! a 6pl (brun rougeâtre sombre)1

8pn (brun rougeâtre et grisâtre foncé)!

£pn (brun choeolat)! à 6pn (brun rougeâtre foncé)!

1E-13^

^pi (brun-jaune rougeâtre)! à 5pl (brun sombre)!

6pn (brun rougeâtre foncé)!

5pi (brun rougeâtre et jaunâtre)! à

5nl (chocolat)! j.c

IE-1355

5pl (brun sombre)! à 5pn (brun chocolat)1

6pn (brun rougeâtre foncé)1

6pn (brun rougeâtre fonce)1

IE-2322

7pl (rouge bleuâtre)! à 7nl (brun-rose foncé)!

8pn (brun rougeâtre et grisâtre foncé)!

7pl (rouge bleuâtre)! à 7nl (brun-rose ,■ foncé)!

1E-2750

5pn (brun chocolat)!

8pn (brun rougeâtre et grisâtre foncé)!

6 1/2 ni (brun-rose)!

IE-2803

5pl (brun sombre)! à 5pn (brun chocolat)!

6pn (brun rougeâtre foncé)! à 7po^

5lg (brun cacao)!

! Les teintes précitées, ainsi que celles dont il est question dans la suite du présent mémoire (lorsqu'elles sont désignées!)sont celles du "Color Harmony Manual", 3e édition, Container Corporation of America (Editeur).

* Le symbole-code est la seule désignation, aucun nom de couleur attribué ne figurant dans le "Color Harmony Manual". § -

COMPOSITION D5 L'AGAR AP*f

gramme

gramme

KH2P0i[.

gramme

(RHlK)2HP0if

gramme

. . . 0,if gramme

. . . 2,0

gramme

pH après stérilisation =6,3

Les nouvelles souches de S. aureofaciens citées comme exemples suivantV

la présente invention; telles qu'elles sont décrites dans les présentes, se différencient de la souche S. aureofaciens A-377 (NRRL 2209) par observation des caractéristiques de croissance sur divers milieux incubés à.26,5°C jusqu'à maturité.

- 12 - &

i I

Q) AGAR AVEC GIYCEROL, ASPARAGINE ET EXTRAIT T)E BCEUF

Glycérol i 1,0 gramme

L-asparagine „ 0,05 gramme

Extrait de bœuf 0,2 gramme

KHgPOij. « . . . . c . . . 0,05 gramme

Agar Bacto 1,5 gramme

Eau distillée, q.s. .......... 100 millilitres

Réglage du çH à 7,0 avec KOH en solution à 50 pH après stérilisation = 7,1.

/

Streptomyces aureofaciens

Souche 1E-1352

Souche lE-135^

M

Croissance

Hjrphes aériens

Sporulation

Pigment diffusible

Envers

Croissance

Hyphes aériens

Sporulation

Pigment diffusible

Envers rare à faible, 2ie (jaune-rouge grisâtre clair)! à 21g (jaune-rouge grisâtre)1

minces devenant moyens à modérés; 5cb*

moyenne à modérée jaune gris clair devenant vert olive

Souche IE-1355

modérée, 2ie (jaune-rouge grisâtre clair)! à

21g (jaune-rouge grisâtre)!

minces, blanc devenant 5dc (gris rosâtre)1 à 5fe (gris brunâtre clair)!

incomplète jaune gris clair

Souche IE-2322

modérée à abondante,

ambre clair moyens à modérés, 5dc U

(gris rosâtre)l a 5fe (gris brunâtre clair)!

moyenne à modérée jaune ambre clair modérée, 5nl (chocolat)! / à 6 1/2 ni (brun-rose)! \A

abondants, blanc devenant 5dc (gris rosâtre)!

incomplète ambre foncé

5pl (brun sombre)! à 6 1/2 ni (brun-rose)l

Couleurs selon le "Color Harmony Manual", 3e édition, Container Corp. of America; pas de nom de couleur attribué.

- 13 -

Streptomyces aureofaclens

Souche lE-2750

Souche IE-2803

Croissance

Hyphes aériens

Sporulation

Pigment diffusible

Envers

Croissance

Hjrphes aériens

Sporulation

Pigment -diffusible

Envers modérée, 3pn (brun-jaune-rouge jaunâtre foncé)! à 6pl (brun rougeâtre sombre)!

minces à moyens, blanc nulle roux devenant ambre

3pn (brun-jaune-rouge jaunâtre foncé)! à

6pl (brun rougeâtre sombre)!

Souche S-601*

abondante, 6pi (brun-jaune-rouge rougeâtre)!

abondants, blanc à rose-gris faible devenant abondante brun rougeâtre

6pi (brun rougeâtre)!

modérée à abondante, 3ni (brun jaunâtre rougeâtre et grisâtre foncé)! à 3pl (brun sombre)!

modérés à abondants, 5dc (gris rosâtre)!

modérée à abondante roux clair devenant ambre

5pi (brun rougeâtre et jaunâtre)! à

5pl (brun sombre)!

Souche A-377

moyenne blanc, uniforme nulle jaune jaune à jaune orange clair r

M

s

&

(2) , A&AR AVEC DEXTHIHE (CZAPEX-DOX)

Dextrine 1,0 gramme

NaNO^ 0,2 gramme

K^HPOi,. 0,1 gramme

MgS0L|..7H20 0,05 gramme

KC1 0,05 gramme

FeSOi^HgO 0,001 gramme

Agar Bacto 1,5 gramme

Eau distillée, q.s 100 millilitres pH après stérilisation = 7,2

- 1b -

u

Streptomyces aureofaciens

Souche lE-1352

Souche 1E-1351*-

Croissance confluente, mince, translucide, incolore confluente, mince, translucide, incolore

{

Hyphes aériens nuls nuls

Sporulation nulle nulle

Pigment diffusible nul-

nul

Envers translucide translucide

Jo

Souche IE-1355

Souche IE-2322

Croissance confluente, mince, translucide, incolore confluente, mince, translucide, incolore

Hyphes aériens nuls nuls

K

Sporulation nulle nulle

Pigment diffusible nul nul

Envers translucide translucide

Souche 1E-2750

Souche IE-2803

4/O

Croissance confluente. mince, transparente, incolore

1

confluente. mince, transparente, incolore

Hyphes aériens nuls nuls

Sporulation nulle null e

Pigment diffusible nul nul

Envers translucide translucide

.

- 15 -

i

[

Streptomyces aureofaciens

Souche S-ôO^f

Souche A-377

Croissance clairsemée, hyaline profuse

Hyphes aériens nuls abondants, gris plomb, globules superficiels d'un blanc aqueux

Sporulation nulle abondante

Pigment diffusible nui léger, jaune pâle

Envers non pigmentaire non pigmentaire y

(3) AGAR AP^f (tel que décrit plus haut)

Streptomyces aureofaciens

Souche lE-1352

Souche 1E-135^

Croissance

Hyphes aériens

Sporulation

Pigment diffusible

Envers profusé, 5pn (brun chocolat)! à

7n1 (brun-rose foncé)!

moyens â abondants, blanc devenant 5dc (gris rosâtre)!

moyenne, terminée brun rougeâtre

5pn (brun chocolat)! â 7nl (brun-rose foncé)1

profuse, 5pi (brun rougeâtre et jaunâtre)! à 7n1 (brun-rose foncé)1

minces, Jdc (gris rosâtre)!

mince, complète ambre à rouge-brun clair

5pi (brun rougeâtre et jaunâtre)1 à

7nl (brun-rose foncé)!

JÏ

-16 -

Streptomyces aureofaciens

Souche IE-1355

Souche IE-2322

Croissance

Hyphes aériens

Sporulation

Pigment diffusible

Envers

Croissance

Hjrphes aériens

Sporulation

Pigment diffusible

Envers

Croissance

Hyphes aériens

Sporulation

Pigment diffusible

Envers profuse, 6pn (brun rougeâtre foncé)!

modérés, 5fe (gris brunâtre clair)!

moyenne brun-rouge

6pn (brun rougeâtre foncé)!

profuse, 7pl (rouge bleuâtre)! à 7nl f

(brun-rose foncé)l - 1

modérés. ?dc (gris rosâtre)! à 5fe (gris brunâtre clair)!

moyenne brun-rouge sombre - -/ o

7pl (rouge bleuâtre)! à 7nl (brun-rose foncé)!

Souche IE-2750

Souche IE-2803

abondante à profuse, 8pl {brun-gris rougeâtre foncé)! à 8pn (brun rougeâtre et grisâtre foncé)!

minces à modérés,

?dc (gris rosâtre)!

mince à modérée brun rougeâtre à brun rougeâtre sombre

8pl ^brun-gris rougeâtre fonce)l^à 8pn (brun rougeâtre et grisâtre foncé)!

abondante, 6pl (brun -rougeâtre sombre)!

nuls nulle brun rougeâtre b=>

6pl (brun rougeâtre sombre)!

Souche S-60^

profuse abondants. 71i (brun-rouge grisâtre) *

très abondante, uniforme très concentré, 5pl (brun sombre)l à 6pl (brun rougeâtre sombre)!

6pn (brun rougeâtre foncé)!

Souche A-377

profuse abondants, ^li (brun-jaune grisâtre foncé)!

très abondante, uniforme jaune verdâtre clair

2nl (brun olive)!

3rT

- 17 -

(4) AGAB Q4 AVEC LIQUEUR DE MACÉRATION DE MAïS

(Liqueur de macération de maïs) . ; 9 grammes

Saccharose 10 grammes

MgS0!+.7H20 0,25 gramme

(NH^ÎgHPO^ 2 grammes .

KHgPO^ ^ grammes

Agar brut 30 grammes '

Eau, q.s. ...... 1000 millilitres pH après stérilisation = 6,5

Streptomyces aureofaciens

Jo

Souche 1E-1352

Souche 1E-135^

Croissance abondante. 7pl (rouge bleuâtre) 1

abondante, 7ng (rouge foncé)!

Hyphes aériens minces à moyens, blanc devenant 5<3.c (gris rosâtre)!

minces à modérés, blanc devenant 5fe (gris brunâtre clair)!

.Sporulation mince à moyenne mince à modérée

Pigment diffusible brun-rouge brun-rouge

Envers

7pl (rouge bleuâtre)!

7ng (rouge foncé)!

&

Souche IE-1355

Souche IE-2322

Croissance abondante, 7pl (rouge bleuâtre) !•

abondante, ^pl (rouge bleuâtre)! a 7nl (brun-rose foncé)!

Hyphes aériens moyens à modérés, blanc devenant 5<ic (gris rosâtre)!

minces. 5fe (gris brunâtre clair)!- ^

Sporulation mince à moyenne rare

Pigment diffusible ambre

7pl (rouge bleuâtre)! à 7nl (brun-rose foncé)!

h

Envers

7pl (rouge bleuâtre)!

7pl (rouge bleuâtre)! à 7nl (brun-rose foncé)!

- 18 -

Streptomyces aureofaciens

Souche lE-2750

Souche IE-2803

Croissance abondante, 8pl^(brun-gris rougeâtre foncé)! à 8pn (brun rougeâtre et grisâtre fonce)!

abondante, 5pi (brun rougeâtre et jaunâtre)! devenant 7pn (brun-rose foncé)1

Hyphes aériens moyens à modérés,

?dç (gris rosâtre)! à.

5fe (gris brunâtre clair)!

moyens à modérés,

(gris brunâtre clair)-*-

Sporulation mince à moyenne mince à moyenne y

Pigment diffusible

8pl (brun-gris rougeâtre fonce)1

brun-rouge foncé

Envers

8pn £brun rougeâtre et grisâtre fonce)!

7pl (rouge bleuâtre)1

Souche S-ôO^

Souche A-377

Croissance profuse, 7pl (rouge bleuâtre)!

excellente, jaune pâle

Hyphes aériens profus, 5nl (chocolat)l profus, 2pn (brun foncé) J-

Sporulation profuse profuse

Pigment diffusible

7pl (rouge bleuâtre)1

brun-orange

Envers

7pl (rouge bleuâtre)1

orange à jaune-orange

- 19 -

(5) AUTRES MILIEUX D'AGAR

Milieu t

Streptomyces aureofaciens

Souche lE-1352

Souche 1E-135^

Agar nutritif

Agar avec glucose, asparagine, extrait de viande

Lait pourpre

Cultures inclinées sur pommes de terre croissance faible à moyenne; %>1 (brun-rouge jaunâtre foncé)! à 5pn (brun chocolat)!. Absence d'hyphes aériens. Pigment soluble ambre clair.' Envers; 5pn (brun chocolat)!.

croissance abondante; 5pi (brun rougeâtre et jaunâtre)1. Hyphes aériens abondants; 5dc (gris rosâtre)1 devenant 5fe (gris brunâtre clair)1. Sporulation: abondante. Pigment soluble ambre sombre. Envers:A5pi (brun rougeâtre et*jaunâtre)1.

collet de croissance prononcé 5 ?li (brun rougeâtre et grisâtre)1 à 6 1/2 ni (brun rose)1 . Changement de pH peu sensible. Fausse réaction colorée alcaline due à la diffusion du pigment.

pH 6,55 à 2 semaines croissance crénelée abondante et humide; >+ni (brun-orange rougeâtre foncé)! à 5pn (brun chocolat)! devenant 3po (noir)1. Pigment soluble 6ig (brun-rouge grisâtre clair)!. Absence d'hyphes aériens.

croissance mince; 5pl . (brun sombre)1 à 6pn^ { (brun rougeâtre foncé)1. Absence d'hyphes aériens. Pigment soluble brun-rouge faible.

Envers: 5pl (brun Q

sombre)! a 6pn^(brun J] rougeâtre foncé)1.

croissance abondante; *+le (jaune-rouge ^

jaunâtre et brunâtre)1 ^ a >+ng (brun clair)1.

Hyphes aériens abondants; 5f® (gris brunâtre clair)!. Sporulation modérée à abondante. Pigment soluble jaune sombre. Envers: n-le (jaune-rouge jaunâtre et brunâtre)1 à. ^ng (brun clair)1.

collet de croissance prononcé 5 5li (brun rougeâtro et grisâtre)1 à 6 1/2 ni (brun rose)1. Changemént de pH peu sensible. Fausse réaction colorée alcaline due à la diffusion du pigment.

pH 6,8 à 2 semaines croissance crénelée abondante et humide; 2nl (brun olive )1 à ^ne (orange brunâtre)! devenant 5pn (brun chocolat)1. Pigment soluble 6ig (brun-rouge grisâtre clair)1 . Absence d'hyphes aériens.

5^

U

- 20 -

Streptomyces aureofaciens

Milieu

Souche IE-1355

Souche IE-2322

Agar nutritif

Agar ave glucose, asparagine, extrait de viande

Lait pourpre

Cultures inclinées sur pommes de terre croissance mince; *+çl (brun-rouge jaunâtre foncé)1 à 5pn (brun chocolat)!. Absence d'hyphes aériens. Pigment soluble ambre très clair. Envers: 5pn (brun chocolat)!.

croissance abondante5 5ni (brun cacao)l à 5pi (brun rougeâtre et jaunâtre)!. Hyphes aériens abondants: 5fe (gris brunâtre clair)!. Sporulation abondante. Pigment soluble jaune sombre. ^Envers: 5ni (brun cacao)l à 5pi (brun rougeâtre et. jaunâtre)1.

collet de croissance prononcé 5 51i (brun rougeâtre et grisâtr-e)! à 6 1/2 ni (brun rose)l,. Changement de pH peu sensible. Fausse réaction colorée alcaline due à la diffusion du pigment.

pH 6,75 à 2 semaines croissance crénelée abondante et humide; 5pi (brun rougeâtre et jaunâtre)! à 5pl (brun sombre)! devenant 5pn (brun chocolat)!. Pigment soluble 6ig (brun-rouge grisâtre clair)l. Absence d'hyphes aériens.

croissance mince; 5pn (brun chocolat)!. Absence > d'hyphes aériens. Pigment C soluble violacé clair»

Envers; 5pn (brun chocolat)!.

croissance abondante; 5pl (brun sombre)!. Hyphes aériens abondants; blancs devenant 5fe (gris brunâtre clair)!. Sporulation abondante. Pigment soluble jaune sombre. Envers: 5pl (brun sombre)!.

l J

collet de croissance prononcé ; 5li (brun rougeâtre et grisâtre)! à 6 1/2 ni (brun rose)l. Changement de pH peu sensible. Fausse réaction colorée alcaline due à la diffusion du pigment.

pH 6,75 à 2 semaines croissance crénelée abondante et humide; *+pg (orange-brun foncé)! devenant * 7po à lOpo (noir violacé)!. Pigment soluble 6ig (brun-rouge grisâtre clair)l. Absence d'hyphes aériens.

ko

* Le symbole-code est la seule désignation, aucun nom de couleur attribué ne figurant dans le "Color Harmony Manual".

- 21 -

%

Streptomyces aureofaciens

Souche IE-2750

Souche IE-2803

Agar nutritif

Agar avec glucose, asparagine, extrait de viande

Lait pourpre

Cultures inclinées sur pommes de terre croissance confluente faible à moyenne; 6pn (brun rougeâtre foncé>1. Absence d'hyphes aériens. Pigment diffusible roux teinté de brun rougeâtre. Envers: 6pn (brun rougeâtre foncé)!.

croissance bonne à abondante, 5pi (brun rougeâtre et jaunâtre)! à 6pi (brun rougeâtre)l. Hyphes aériens abondants uniformément 5dc (grià rosâtre)l. Sporulation abondante. Pigment diffusible jaune-roux clair devenant ambre. Envers: 5pi (brun rougeâtre et jaunâtre)l à 6pi (brun rougeâtre)l devenant 6pn (brun rougeâtre foncé)1.

collet de croissance prononcé.. 5 5li (brun rougeâtre et .grisâtre)! à 7nl (brun rose foncé)!. Changement de pH peu sensible. Fausse réaction colorée alcaline due à la diffusion du pigment.

pH 6,75 à 2 semaines croissance crénelée abondante et humide, *fgl (brun-^'aune rougeâtre)!

clair a 5pi (brun rougeâtre et jaunâtre)! devenant lOpo (noir violacé)!. Tendance à former des zones denses et blanches d'hyphes aériens à foyers distincts. Pigment diffusible: 5ig (brun-rouge grisâtre clair)l à 5li (brun rougeâtre et grisâtre)!.

croissance confluente faible à moyenne; 3pl /

(brun jaunâtre rougeâtre s. et grisâtre foncé)! à 3pn (brun-jaune-rouge jaunâtre foncé)1. Absence d'hyphes aériens. Pigment diffusible roux /o teinté de brun rougeâtre. Envers: 3pl (brun jau- ' nâtre rougeâtre et grisâtre foncé)! à 3pn (brun-jaune-rouge jau- /l nâtre foncé)1 devenant 3pn (brun-jaune-rouge jaunâtre foncé)!.

croissance abondante, 5pl (brun sombre)!. °6o

Hyphes aériens compacts et abondants, 5fe (gris brunâtre clair)!. Sporulation abondante. ,

Pigment diffusible "It brun rougeâtre, léger à modéré, devenant ambre. Envers: 5pl (brun sombre)! devenant 6pn (brun rou- „ geâtre foncé)!. ^

collet de croissance prononcé } 5li (brun rougeâtre et grisâtre)! à 7nl (brun rose foncé]!. Changement de pH peu sensible. Fausse réaction colorée alcaline due à la diffusion du pigment. H

pH 6,75 à 2 semaines croissance crénelée abondante et humide. 6pi (brun rougeâtre)! devenant 3po (noir)l à 5po (brun iif chocolat)! . Zones éparses d'hyphes aériens denses et blancs à foyers séparés. Pigment diffusible: 5ig

(brun-rouge grisâtre clair)! à 5li (brun rougeâtre et grisâtre)!.

Streptomyces aureofaciens

Milieu

Souche S-60*+

Souche A-377

Agar nutritif

Agar arec glucose, asparagine, extrait de viande

Lait pourpre

Cultures inclinées sur pommes de terre croissance médiocre, 5li (brun rougeâtre et grisâtre)l à 2pn (brun foncé)l. Absence d'hyphes aériens. Envers: 2pn (brun rougeâtre et grisâtre)! . Pigment soluble brun rougeâtre.

croissance abondante. Hyçhes aériens prononcés, marbrés. 5ig (brun-rouge grisâtre clair)! à *fi^ (brun-jaune rougeâtre)! a 3ge (brun-jaune grisâtre clair)!. Sporulation: abondante.a Envers: 2pn (brun rougeâtre et grisâtre)! « Pigment soluble brun rougeâtre.

léger collet de croissance 6 1/2^pl (brun-rouge rougeâtre sombre)!. Pas de changement notable du pH, ni de peçtonisation apça-rente. Légère fausse réaction colorée alcaline due à la diffusion du pigment soluble.

croissance noduleuse lisse, humide et abondante; fon (brun rougeâtre foncé)1 avec traces de 5gc (brun orange rougeâtre et grisâtre }1. Hyphes aériens:

nuls a abondants devenant blancs à 3ge (brun-jaune grisâtre clair)1. Sporulation abondante dans les zones d'hyphes aériens denses. Pigment solublo 5nl (chocolat)! à Jpn (brun chocolat)!.

croissance assez bonne. Absence d'hyphes aériens. ^ Envers: jaune pâle. Pig- j ment soluble jaune à jaune brunâtre clair.

croissance assez bonne. )$. Hyphes aériens blancs devenant de plus en plus gris à mesure qu'augmente la formation de spores. Envers: jaune clair. \{

Pigment soluble jaune clair.

léger collet de croissance lo blanc à jaune pâle. Pas de changement notable du pH, ni de peptonisation apparente en 15 jours.

M

croissance, noduleuse lisse, humide et abondante; 3ea 5^ (jaune orange pâle)l à 71e (rouge grisâtre)l.

Traces d'hyphes aériens. Pas de pigment soluble.

- 23 -

(6) OBSERVATIONS MICROSCOFIQUBS

AGAR AVEC GLUCOSE,

S. aureofaciens ASPARAGINE ET EXTRAIT DE BŒUF AGAR

Souche lE-1352

Mycélium Spores

Flexueux, continu, ramifié. Diamètre 0,8 à 1,2 p..

Sphériques à ovoïdaux. Diamètre 0,8 à 1,5 fi»

Flexueux, continu, / ramifié. Diamètre j 0,8 à 1,2 ji.

Sphériques à ovoïdaux. Diamètre 0,8 à 1,5 fi.

Souche 1E-13^

Mycélium Spores

Flexueux, continu, ramifié. Diamètre 0,S à 1,2 fi.

Sphériques à ovoïdaux. Diamètre 0,8 à 1,5 fi.

Flexueux, continu, J0 ramifié. Diamètr e 0,8 à 1,2 fi.

Sphériques à ovoïdaux. Diamètre 0,8 à 1,5 M»

Souche

IE-1355

Mycélium Spores

Flexueux, continu, ramifié. Diamètre 0,8 à 1,2 fi.

Sphériques à ovoïdaux. Diamètre 0,8 à 1,5 fi»

Flexueux, continu,

ramifié. Diamètre 0,8 à 1,2 fi.

Sphériques à ovoïdaux. ^ Diamètre 0,8 à 1,5 Jû»

Souche IE-2322

Mycélium Spores

Flexueux, continu, ramifié. Diamètre 0,8 à 1,2 p..

Sphériques à ovoïdaux. Diamètre 0,8 à 1,5 ju

Flexueux, continu,

ramifié. Diamètre 0,8 à 1,2 fi.

Sphériques à ovoïdaux. Xf, Diamètre 0,8 à 1,5 fi»

Souche 1E-2750

Mycélium Spores

Flexueux, continu, ramifié. Diamètre 0,8 à 1,2 ju.

Sphériques à ovoïdaux. Diamètre 0,8 à 1,5 fi»

Flexueux, continu, ramifié. Diamètre 0,8 à 1,2 fi. 3°

1

Sphériques à ovoïdaux. Diamètre 0,8 à 1,5 fi*

Souche IE-2803

Mycélium Spores

Flexueux, continu, ramifié. Diamètre 0,8 à 1,2 fi.

Sphériques à ovoïdaux. Diamètre 0,8 à 1,5 fi»

Flexueux, continu, ^ ramifié. Diamètre V| 0,8 à 1,2 fi. ^

Sphériques à ovoïdaux. Diamètre 0,8 à 1,5 fi»

Souche S-60^

Mycélium Spores

Flexueux, continu,

rami fi é. Diamè tre 0,8 à 1,0 fi.

Sphéroïdaux à ovoïdaux. Diamètre 1,5 à 2,0 fi.

Flexueux, continu, 4^ ramifié. Diamètre 0,8 à 1,2 fi.

Sphéroïdaux ovoïdaux. Diamètre 1,5 à 2,0 ji. ^ f

25

AGAR AVEC GLUCOSE jS. aureofaciens ASPARAGINE ET EXTRAIT AGAR Qk

DE BOEUF

f Mycélium Flexueux, continu Flexueux, continu

^ ramifié, diamètre ramifié, diamètre

Souche 0,7 à 1,0 p. 0,8 à 1,2 p

4-377

Spores Sphéroïdaux à ovoïdaux Sphéroïdaux à ovoïdaux diamètre de 1,5 à 2,* p. diamètre do 1,5 à 2,0p

Jo La morphologie des mycélia et des spores, comme on la .voit au microscope ordinaire, est apparemment semblable pour les souches IE-1352, IE-1354, IE-1355, IE-2322, IE-2750 et IE-2803, comme pour les souches A-377 et S--6O4. Cependant, les diamètres du mycélium typique et des spores des pre-mières souches paraissent, de manière caractéristique , plus

* petits que ceux des souches mentionnées en dernier lieu .

Toutes les souches présentent un mycélium continu, flexueux et ramifié avec une tendance occasionnelle des hyphes aériens à présenter des crochets ou des boucles ou à former dos VO spirales libres primitives telles que celles qui sont typiques de l'espèce S. aureofaciens.

Les conditions de la fermentation sont généralement les mômes que pour les procédés connus actuellement de production de chlorotétracycline par fermentation. Ainsi, le milieu de fermentation contient les sources assimilables usuelles de carbone, d'azote et de sels minéraux. Des substances nutritives appropriées sont l'amidon, le dextrose, le sucre de canne, le glucose, les mélasses, la farine de soja, le lait en poudre, la levure, les extraits de viande, la peptone, l'urée, la liqueur ^0 ^e macération de maïs (cornsteep), la farine de graines de coton, les produits solubles de distillation, les huiles glyeé-ridiques, la farine de poisson et d'autres substances classiques. Les sels minéraux comprennent, par exemple, le carbonate de calcium, le sulfate d'.ammonium, le chlorure d'ammonium et les S* sels de divers oligo-éléments, tels que le manganèse, le cobalt, le zinc, le cuivre, le fer, etc.

Les autres conditions générales de la'fermentation,

telles la concentration des ions hydrogène, la température, la durée

le degré d'aération, la1 préparation de l'iaoculum, la stérilisa-

i tion, l'inoculation, etc., sont classiques et peuvent être semblables à celles prévues pour la production de 7-chloro-6-démé~ ^/'thyltétracycline décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amé-rique N° 2.878.289 (McCormick et al.).

La récupération de la 7-chloro~6~déméthyltétracycline de la liqueur de fermentation se fait de la manière habituelle et n'a pas besoin d'être décrite, car de nombreux procédés permettant de récupérer ce produit des liqueurs de fermentation ont déjà JP été publiés.

L'invention sera décrite d'une manière plus détaillée dans l'exemple particulier suivant:

EXEMPLE

^ - On a préparé un milieu de fermentation contenant les

Jy à ingrédients suivants:

Amidon *+5 grammes

CaCO^ . . 10,5 grammes

KE^Cl . . 1,5 gramme

Farine de graines de coton .... k-5 grammes

Levure 1,5 gramme

Eau q.s. ad 1000 millilitres

Ce milieu a été réparti, en quantités appropriées, dans des flacons contenant 3 % (vol./vol. du milieu) d'huile de saindoux, après quoi on a stérilisé le contenu de ces flacons. Ces flacons ont ensuite été divisés en 16 groupes contenant environ le même nombre de flacons. Chaque groupe a été ensuite inoculé à l'aide d'un inoculum végétatif d'une des souches suivantes de S. aureofaclens.

S-ôO^f (ATCC 12.551)

S-1071 (ATCC 12.552)

V-62 (ATCC 12.553)

B-7^0 (ATCC 12.55^)

- 26 -

y-138 E -h-75

B-1311 ED-1723

ED-asi^

IE-1352 IE-1351*-IE-135?

— 40 IE-2322

IE-2803 IE-2750

Tous les flacons ont ensuite été incubés sur un agitateur rotatif animé d'un mouvement circulaire de 6,25 cm à 185-I ^ 200 tours par minute à 25° G pendant 180 heures. Des échantillons ont été prélevés, dilués avec 199 parties d'eau et les courbes de réflectance ont été déterminées de la manière décrite plus haut. Les résultats sont indiqués dans les FIGURES 1 à 16. Les résultats des essais effectués sur les échantillons de mofits de . récolte sont indiqués dans le Tableau I donné plus loin. Ces essais ont été effectués en utilisant les procédés suivants:

Essai N° l: Cet essai est basé sur la différence qui existe entre les vitesses de transformation de la 7-chloro-6-déméthyltétra-cycline et de la 6-déméthyltétracycline en leurs formes anhydro ^ - respectives, par une réaction de premier ordre catalysée par un acide. Le degré de transformation en forme anhydro dépend de la durée, de la température et de la concentration de l'acide produisant une réaction qui donne lieu à une diminution d'absor-bance à 368 mu. et une augmentation d'absorbance à ¥+0 mji. \o - Essai N° 2: Cet essai est basé sur le même principe essentiel que l'Essai N° 1, si ce n'est que dans ce cas l'échantillon est traité avec un acide afin de dégrader toutes les tétracyclines

- 27 -

28

présentes, pour les transformer en forme anhydro dans un cas, en comparaison d'un échantillon traité à l'eau dans le second cas.

^ Essai n" 3 : Les valeurs énumérées dans cette colonne ont été ^ déterminées par un procédé classique de chromatographie sur papier, en utilisant le système phosphate de sodium "0,3 M acétate de n-butyle donnant un R^ de 0,30 pour la 6-déméthyl-tétracyclinej Trois systèmes similaires, publiés dans le Journal of the American Chemical Society, Vol, 79? PP. 4561-4563 (1957) ^.Q (McConaick et al.), sont indiqués ci-après.

Système 6-déméthyltétracycline

Rf

Phosphate de sodium 0,3 M /n-butanol . (pH 3,0) 0,30

Tampon Mac Ilvaine/acétate d'éthyle

(pH 4,7) 0,27

0,3 H H„PO , 0,1$ CC1_ COOH 9j1 ' 3 4 3

CHCl^-n-butanol 0,22

Dans ce tableau I, le pourcentage de 6-déméthyltétra~ to cycline (colonne 4) des quatre premières souches (S-6O4, S-IO7I, V-62 et B-74O) a été déterminé en cherchant la quantité de 6-déméthyltétracycline par chromatographie sur papier (colonne 3) et en divisant ce chiffre par la quantité totale de déméthyl-tétracycline déterminée par analyse spectrophotométrique V\ (colonne I) et par analyse chromatographique (colonne 3)

Le pourcentage de 6-déméthyltétracycline (colonne 4) produit par le reste des souches est déterminé en divisant le chiffre trouvé par analyse chromatographique (colonne 3) par" le chiffre trouvé par analyse spectrophotométrique des tétracyclines °yO totales (colonne 2),

")

,'TABLEAU 1

ESSAI

K° 1

N° 2

N° 3

y

S, aureofaciens Souche N°

DMCTC y/ml

Tétracyclines totales y/ml

DMTC y/ml Chromato-gramme quantitatif sur papier

% DMTC

S-60if

1193

2037

110

B,h

S-1071

876

2k28

138

13,1

V-62

1177

2255

573

32,7

B^O

10*+2

2553

380

26,7

V-138

960

1817

6^-5

35,5

E-k-75

23^8

3601

8k7

23,5

E-1311

3186

!f263

820

19,2

ED-1723

1961

330^

1320

39,9

ED-2CA-7

k-726

6316

1775

28,1

ED-231^

b9h6

6650

1100

16,5

lE-1352

578 0

5990

2^7

V

lE-1351^

■ ^20

^565

1^5

3,9

IE-1355

6060

6390

230

M

IE-2803

603^

6220

186

2,8

IE-2322

3281

3197

pas ^ dé celée

0

lE-2750

3^51

3566

, Pas * de celé ®-

0

/

* Pas de 6-déméthyltétracycline trouvée au taux le plus faible S idëcélàblé de 1 y/ml.

- 29 -

Claims (1)

1. 30

   RESUME

   La présente invention a pour objet un procédé de production de 7-ehoro-6-déméthyltétracycline par culture d'une souche de Streptomyces aureofaciens productrice de 7-chloro-6-déméthyltétracycline, dans des conditions de culture en aérobie submergée, dans un milieu aqueux nutritif, contenant des sources assimilables de carbone, d'azote et de sels minéraux, jusqu'à ce que des quantités substantielles de 7-chloro-6-déméthyltétracycline soient produites, caractérisé par les points suivants pris isolément ou en combinaisons l/ Il consiste à utiliser comme souche de Streptomyces aureofaciens productrice de 7-chloro-6-déméthyltétracycline une souche qui produit de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline de manière sélective et a l'aptitude à conférer à une dilution aqueuse à 1:200 du moût de récolte entier une coloration caractérisée par une courbe de réflectance, représentée linéairement, dans laquelle les valeurs du pourcentage de réflectance à 460 mji, 5^0 nji, 560 mp et 660 mp, donnent lorsqu'elles sont introduites dans la formule :

   ^•R = R54Q + R56O " 1,1 R460 " °'9 R660 ~ 2,0 une valeur positive pour $■ R.

   2/ On utilise comme souche de Streptomyces aureofaciens productrice de 7-chloro-6-déméthyltétracycline une souche qui produit de la 7-chloro-6-déméthyltétracycl±ne de manière sélective et à l'aptitude à conférer à une dilution aqueuse à 1:200 du moût de récolte entier une

   31

   coloration caractérisée par une courbe de réflectance telle que, lorsqu'on porte linéairement sur un graphique le pourcentage de réflectance en fonction de la longueur d'onde, la courbe résultante entre 460 mp et 530 mp. présente un 5 point d'inflexion et a au moins un point de pente nulle et qu'elle est convexe vers le haut à gauche du point d'inflexion et concave vers le haut à droite de ce point d'inflexion.

   Par procuration <fe"

   31 PAGES Société dite :

   *"■-> AMERICAN CYANAMID COMPANY

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   en Jl pages contenant Renvois mot ajouté mot rayé nul

   José CURAU

   Conseil en Propriété Industrielle 28, Boni. Princesse Charlotte, 28

   )