CH503700A - Verfahren zur Herstellung von vernetzten Proteinen und Peptiden - Google Patents

Description

  Verfahren zur Herstellung von vernetzten Proteinen und Peptiden    Es wurde bereits versucht, Proteinmoleküle durch  aromatische Di-isocyanate oder     Bis-diazoniumverbin-          dungen    miteinander zu verknüpfen. Der Vernetzungs  grad der dabei erhaltenen Produkte ist jedoch gering,  da sich bei Verwendung niedermolekularer Vernet  zungskomponenten die zu vernetzenden Proteinmole  küle gegenseitig sterisch behindern.  



  Es ist auch bekannt, dass man Proteine und Peptide an  unlösliche Trägersubstanzen, beispielsweise     Polyamino-          styrol,    binden kann und dadurch Proteinaggregate er  hält, die jedoch unlöslich sind. Es wurde nun gefun  den, dass hochmolekulare, wasserlösliche vernetzte Pro  teine und Peptide erhält, wenn man reaktionsfähige  Derivate von Amino- und Carboxyl- sowie gegebenen  falls Hydroxylgruppen enthaltenden aromatischen     Poly-          aminocarbonsäure,    gegebenenfalls nach Reduktion zu  sätzlich vorhandener Nitrogruppen, mit Proteinen oder  Peptiden in an sich bekannter Weise umsetzt.

   Da die  genannten Polyaminocarbonsäuren mehrere funktionelle  Gruppen enthalten, sind sie imstande, mehrere Pro  tein- oder Peptidmoleküle zu binden und führen daher  zu besonders hochvernetzten Produkten, die gleichwohl  trotz ihres hohen Molekulargewichts wasserlöslich sind.  



  Die Herstellung der Verfahrensprodukte ist dadurch  gekennzeichnet, dass man ein freie Aminogruppen und  Carboxyl- sowie gegebenenfalls Hydroxylgruppen ent  haltendes Polykondensat entsprechender aromatischer  Aminocarbonsäure, die ausserdem durch Halogen so  wie durch Alkyl-, Sulfo- oder Nitrogruppen substituiert  sein können, jedoch keine kondensierten Kerne enthal  ten, mit einem reaktionsfähigen Derivat der Kohlen  säure umsetzt und das erhaltene Produkt mit den  Amino- und Carboxylgruppen eines Proteins bzw.     Pep-          tids    reagieren lässt.  



  Als reaktionsfähige Derivate kommen z. B. Phos  gen, Thiophosgen oder Chlorameisensäureester in Frage;  mit den genannten Polyaminocarbonsäuren entstehen  daraus Isocyanate, Isothiocyanate bzw. Carbaminsäure-    ester. Diese reagieren dann mit den als Reaktionspart  ner verwendeten Proteinen oder Peptiden.  



  Die als Ausgangsstoffe verwendeten aromatischen  Polyaminocarbonsäuren lassen sich dadurch herstellen,  dass man mehrfunktionelle aromatische Verbindungen,  die keine kondensierten Kerne, aber Amino-,     Hydroxyl-          und    Carboxylgruppen enthalten, in Gegenwart von  Phosphorpentoxyd und niederen Dialkylphosphiten als  Lösungsmittel in stark saurem Medium umsetzt. Sie  können sich von Derivaten des Benzols, Diphenyls,     Di-          phenylmethans,    Diphenylamins, Diphenyläthers oder  Diphenylsulfons ableiten.

   Sie können ausser den erfor  derlichen Amino- und Carboxylgruppen noch Alkyl  gruppen, vorzugsweise solche mit 1-4 C-Atomen,  insbesondere Methyl- und Äthylgruppen, Halogen  atome, vorzugsweise Chlor und Brom, sowie Sulfo-,  Nitro- oder Hydroxygruppen enthalten.  



  Die für das Verfahren der Erfindung weiterhin in  Betracht kommenden Proteine und Peptide können ent  weder Naturstoffe oder synthetische Produkte sein. Als  Naturstoffe kommen in Frage, z. B. Enzyme, beispiels  weise Ribonuclease, Trypsin, Chymotrypsin;     Glycopro-          teine    wie die Gonadotropine, Peptidhormone wie In  sulin, Glucagon, ACTH, Vasopressin; Virusproteine,  z. B. solche des Polio-, Grippe-, Masernvirus; Bakte  rientoxine und -toxoide wie Diphtherie- und Tetanus  toxine, sowie auch serologisch determinante Bruch  stücke der genannten Proteine und Peptide.  



  Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhal  tenen hochmolekularen Vernetzungsprodukte besitzen  nicht mehr die biologische Aktivität der als Ausgangs  produkte verwendeten Proteine oder     Peptide,    so dass  bei einer Applikation als     Immunogene    keine direkten  physiologischen Störungen eintreten. Die durch Im  munisierung mit den vernetzten Proteinen oder Pep  tiden erhaltenen Antiseren geben jedoch mit den als  Ausgangsprodukten verwendeten Proteinen und     Pepti-          den    eine     serologische    Kreuzreaktion, die zur Neutrali-      sation der biologischen Aktivität der Ausgangsprodukte  führt.

   Dadurch ergibt sich eine immuntherapeutische  Methode, um eine Überproduktion an biologisch aktiven  Proteinen und Peptiden in vivo zu kompensieren. Über  raschend ist, dass die Verbindungen trotz ihres hohen  Vernetzungsgrades und des dementsprechend hohen  Molekulargewichts von bis zu 250 000 wasserlöslich  sind.  



  Die Verfahrensprodukte eignen sich beispielsweise  als Antigene in der Immuntherapie, z. B. zur Herstel  lung von Vaccinen und Seren. Das auf erfindungsge  mässem Wege erhaltene Antigonadotropinserum erzeugt  bei Versuchstieren temporäre Sterilität. Andere erfin  dungsgemäss erhaltene Antiseren können für Immun  bestimmung verwendet werden, z. B. zu Bestimmung  von Insulin und Gonadotropin.  



  <I>Beispiel 1</I>  500 mg reduziertes Polykondensat (hergestellt ana  log Beispiel 1) werden in 50 ml Dimethylformamid ge  löst, 1 g festes Natriumbicarbonat zugegeben und un  ter Rühren mit 0,5 ml Thiophosgen in 20 ml Äther  zugeführt. Das Gemisch wird unter Feuchtigkeitsaus  schluss über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt, dann  zwei Stunden auf 70  C erwärmt und anschliessend zur  Entfernung des überschüssigen Thiophosgens zweimal  im Vakuum mit Dimethylformamid abgedampft. Der    Rückstand wird in 20 ml Dimethylformamid aufge  nommen, wobei nicht alles gelöst zu sein braucht, und  zu einer Lösung von 5 g Rinderserumalbumin in 200 ml  Wasser, die mit Natronlauge auf pH 9,5 eingestellt  ist, bei 40  C während 30     Minuten    zugegeben.

   Nach  der Reaktion wird 15 Minuten auf 60  C erwärmt,  drei Stunden gegen 0,1 m Ammoniumcarbonat, an  schliessend einen Tag lang gegen Wasser bei 4  C di  alysiert und dann lyophilisiert.  



  Ausbeute: 5,5 g eines schwach gelblichen Pulvers.  Das Molekulargewicht des vernetzten Rinderserumal  bumins schwankt zwischen 190 000-270 000.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von hochmolekularen wasserlöslichen vernetzten Proteinen oder Peptiden, da durch gekennzeichnet, dass man ein freie Aminogrup- pen und Carboxyl- sowie gegebenenfalls Hydroxylgrup pen enthaltendes Polykondensat entsprechender aroma tischer Aminocarbonsäuren, die ausserdem durch Halo gen sowie durch Alkyl-, Sulfo- oder Nitrogruppen sub stituiert sein können, jedoch keine kondensierten Kerne enthalten, mit einem reaktionsfähigen Derivat der Koh lensäure umsetzt und das erhaltene Produkt mit den Amino- und Carboxylgruppen eines Proteins bzw. Pep- tids reagieren lässt.

   <I>Anmerkung des</I> Eidg. <I>Amtes für geistiges Eigentum:</I> Sollten Teile der Beschreibung mit der im Patentanspruch gegebenen Definition der Erfindung nicht in Einklang stehen, so sei daran erinnert, dass gemäss Art. 51 des Patentgesetzes der Patentanspruch für den sachlichen Geltungs bereich des Patentes massgebend ist.