DD287950A5 - Verfahren zur kovalenten bindung von biologisch aktiven verbindungen an substituierte polyoxyalkylenglykole und ihre monoalkoxyderivate - Google Patents
Verfahren zur kovalenten bindung von biologisch aktiven verbindungen an substituierte polyoxyalkylenglykole und ihre monoalkoxyderivate Download PDFInfo
- Publication number
- DD287950A5 DD287950A5 DD33271989A DD33271989A DD287950A5 DD 287950 A5 DD287950 A5 DD 287950A5 DD 33271989 A DD33271989 A DD 33271989A DD 33271989 A DD33271989 A DD 33271989A DD 287950 A5 DD287950 A5 DD 287950A5
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- acid
- organic solvents
- biologically active
- active compounds
- mixtures
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 title claims abstract description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 34
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 13
- NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,3-dimethyl-7-nitro-4h-isoquinolin-1-one Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C=C2C(=O)N(O)C(C)(C)CC2=C1 NEAQRZUHTPSBBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims abstract description 9
- SFZULDYEOVSIKM-UHFFFAOYSA-N chembl321317 Chemical group C1=CC(C(=N)NO)=CC=C1C1=CC=C(C=2C=CC(=CC=2)C(=N)NO)O1 SFZULDYEOVSIKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- -1 antibodies Substances 0.000 claims description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 7
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims description 6
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910000288 alkali metal carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000008041 alkali metal carbonates Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 claims description 3
- 125000005442 diisocyanate group Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000002390 heteroarenes Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims description 2
- 150000001340 alkali metals Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 2
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 claims description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 150000004984 aromatic diamines Chemical class 0.000 claims 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims 1
- 239000003791 organic solvent mixture Substances 0.000 claims 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 abstract description 7
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 abstract description 6
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 14
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 8
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 2
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 1-[(4s,5s)-4-azido-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical class O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010000659 Choline oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 1
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 description 1
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001990 dicarboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 1
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 1
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003544 oxime group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N toluene 2,4-diisocyanate Chemical compound CC1=CC=C(N=C=O)C=C1N=C=O DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kovalenten Bindung von biologisch aktiven Verbindungen an substituierte Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate. Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate mit primaere Aminogruppen, Thiolgruppen, Amidoximgruppen, Hydroxamsaeuregruppen und Karbonsaeurehydrazidgruppen enthaltenden, funktionellen Gruppen werden in einem ersten Reaktionsschritt mit bi- oder multifunktionellen Aktivierungsmitteln in aktivierte Polymere ueberfuehrt. In einem zweiten Reaktionsschritt erfolgt die kovalente Bindung von biologisch aktiven Verbindungen, zum Beispiel von biokatalytisch aktiven oder inaktiven Proteinen und hoeher integrierten Systemen wie Mikroorganismen an die aktivierten Polymeren. Die Umsetzungen erfolgen in waeszrigen Loesungen, organischen Loesungsmitteln oder Gemischen beider, gegebenenfalls in Gegenwart eines saeurebindenden Mittels. Die modifizierten, biologisch aktiven Verbindungen werden in der Biotechnologie und Medizin eingesetzt.{Verfahren; kovalente Bindung; Polyoxyalkylenglykole; biologisch aktive Verbindungen; bifunktionelle Aktivierungsmittel}
Description
-2- 237 950
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kovalenten Bindung von biologisch aktiven Verbindungen an substituierte Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate. Das Verfahren und die danach hergestellten Verbindungen können in dor Biotechnologie, Biochemie, Pharmazie und Medizin angewendet werden.
Makromolekulare Verbindungen mit Aminogruppen werden sehr oft und solche mit Thiol-, Amldoxim-, Hydroxamsäure- oder Karbonsäurehydrazidgruppen weniger zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen verwendet (Methods Enzymol. 1988,137, [Immobilized Enzymes and Cells], R. A-D, Ed. by K. Mosbach). In dieser Form können die mit den genannten, funktioneilen Gruppen versehenen Makromoleküle bei Immobilisierungsreaktionen allerdings nur eingesetzt werden, wenn reaktive, hochaktivierte Gruppen besitzende, biologisch aktive Verbindungen an die Makromoleküle kovalent gebunden werden sollen. In der Regel werden bei Immobilisierungsreaktionen aber die makromolekularen Verbindungen mit den genannten, funktioneilen Gruppen vor der kovalenten Bindung der biologisch aktiven Verbindungen aktiviert, was praktisch bedeutet, daß die funktionellen Gruppen der Makromoleküle in einen solchen reaktiven Zustand überführt werden müssen, daß eine Verdünnungsreaktion beider Komponenten erfolgen kann.
In Amino-, Thiol-, Amidoxim-, Karbonsäurehydrazld - und Hydroxamsäuregruppen· in letzteren Verbindungen kann als tautomere Form ebenfalls die Oximgruppe =NOK vorliegen - enthaltenden Verbindungen besitzen die funktionellen Gruppen nukleophile Eigenschaften, so daß die nukleophilen Substitutionsreaktionen und auch verschiedenartigsten Additionsreaktionen zugänglich sind. Diese Reaktionstypen gehören zu den grundlegenden Reaktionen der Synthesechemie, und auf diese Weise können durch eine Vielzahl von Verknüpfungsreaktionen von zwei oder mehreren bekannten Verbindungen neue Verbindungen synthetisiert werden. Diese Reaktionsprinzipien werden auch zur Aktivierung der zur Immobilisierung von biologisch aktiven Verbindungen geeigneten, unlöslichen Makromoleküle wie Zellulose, Sepharosen, Sephadexe oder PoIyhydroxyethylmethakrylate angewendet. Mit Vorteil werden in diesen Fällen sehr oft bi- beziehungsweise multifunktionelle, niedermolekulare Aktivierungsmittel verwendet, well auf diese Weise schon nach einem Reaktionsschritt das Makromolekül in aktivierter Form vorliegt. Unter den bi- oder multifunktionellen und zur Aktivierung von Makromolekülen geeigneten Aktivierungsmitteln sind eine Vielzahl leicht zugänglicher, chemischer Reagentien, die für eine Aktivierung in Frage kommen. Einige wichtige s!.i J zum Beispiel Dialdehyde, aktivierte Dikarbonsäurederivate, aliphatische, durch Aktivierung reaktiv gemachte aromatische und heteroaromatische Dihalogenide beziehungsweise höher halogenierte Verbindungen und funktionalisierte und gleichzeitig reaktiv gemachte Diaminoverbindungen.
In wäßrigen Lösungen und organischen Lösungsmitteln lösliche Polymere vom Typ der Polyoxyalkylenglykole unmd ihrer Monoalkoxyderivate sind für verschiedene Anwendungsfälle von Interesse, vor allem in der Biotechnologie und angewandten, medizinischen Forschung. Das setzt in jedem Falle auch die Funktionaüsierung dieser Polymeren, am besten durch kovalente Verknüpfung, mit biologisch aktiven Verbindungen voraus. Diese kovalente Bindung von biologisch aktiven Verbindungen erfordert aber, daß zunächst einmal reaktive Derivate der genannten Polymeren vorliegen, die zu diesen Verknüpfungsreaktionen befähigt sind. Die bisher beschriebenen Methoden zur Aktivierung und Funktionalisierung mit biologisch aktiven Verbindungen der hydroxylgruppenhaltigen Polyoxyalkylenglykole und der Monalkoxyderivate dieser Polymeren (Life Sei., 1983,33,1467-1473) reichen für eine breite Anwendung aber mit Sicherheit nicht aus. Mit primären Aminogruppen, Thiolgruppen, Amidoxigruppen, Hydroxamsäuregruppen oder Karbonsäurehydrazidgruppen substituierte Derivate der Polyoxyalkylenglykole und ihre gleichartig substituierten Monoalkoxyderivate stellen ebenso geeignete Derivate dieser Polymeren dar, um biologisch aktive Verbindungen an sie kovalent zu binden, zumal mit diesen reaktiven Gruppen substituierte Polymere der genannten Art aus den hydroxylgruppenhaltigen Ausgangspolymeren durch in der Regel einfache chemische Reaktionen synthetisiert werden können.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, biologisch aktive Verbindungen an mit primären Aminogruppen, Thiolgruppen, Amidoximgruppen, Hydroxamsäuregruppen oder Karbonsäurehydrazidgruppen substituierte Polymere vom Typ der Polyoxyalkylenglykole und ihrer Monoalkoxyderivate nach Aktivierung der genannten, funktionellen Gruppen kcvalent zu binden. Dadurch sollen modifizierte, biologisch aktive Verbindungen mit breiten Anwendungsmöglichkeiten erhalten werden.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, mit primären Amlnogruppend, Thiolgruppen, Amidoximgruppen, Hydroxamsäuregruppen und Karbonsäurehydrazidgruppen substituierte Polyox/alkylenglykole oder ihre ebenso substituierten Monoalkoxyderivate in eine aktivierte Form zu überführen und an diese aktivierten Polymeren biologisch aktive Verbindungen kovalent zu binden. Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß primäre Aminogruppen, Thiolgruppen, Amidoximgruppen, Hydroxamsäuregruppen oder Karbonsäurehydrazidgruppen enthaltende Polymere, abgeleitet vom Typ der Polyoxyalkylenglykole oder ihrer Monoalkoxyderivate, in widrigen Lösungen im pH-Bereich von 2,0 bis 12,0 oder organischen Lösungsmitteln beziehungsweise Gemischen organischer Lösungsmittel oder Gemischen von wäßrigen Lösungen und organischen Lösungsmitteln bei Reaktionstemperaturen im Bereich von O0C bis 15O0C im Verlaufe von 30 Minuten bis 8 Stunden, gegebenenfalls in Gegenwart einer Puffersubstanz oder eines säurebindenden Mittels, mit bi- oder multifunktionellen Aktivierungsmitteln umgesetzt und aktiviert werden und an die aktivierten Polymeren in wäßrigen Lösungen, die gegebenenfalls
gepuffert sind oder Gemischen dieser mit organischen Lösungsmitteln oder in organischen Lösungsmitteln oder in Gemischen organischer Lösungsmittel, in letzteren beiden Fällen gegebenenfalls in Gegenwart säurebindender MiHeI, im Verlaufe von 30 Minuten bis 12 Stunden bei Temperaturen von O0C bis 160°C biologisch aktive Verbindungen kovalent gebunden werden. Als biologisch aktive Verbindungen für die erfindungsgemäße, kovalente Bindung an Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate werden nieder- und hochmolekulare Verbindungen eingesetzt. Neben Ihrer biologischen Wirksamkeit ist für eine erfolgreiche und stabile Bindung an die genannten Polymeren das Vorliegen reaktiver, funktioneller Gruppen zusätzliche Voraussetzung. Erfindungsgemäß werden biokatalytisch aktive Verbindungen wie Enzyme - bevorzugt solche aus den Klassen der Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen und Isomerasen-Mikroorganlsmen, tierische, pflanzliche und humane Zellen, Zellorganellen, synthetische Enzyme oder Koenzyme, aber auch biokatalytisch inaktive Proteine wie Antigene, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Interferone, Hemoprotoine, Albumine und zuckerbindende Proteine wie die Lektine Covalent gebunden. Andere biologisch aktive Verbindungen, die den zuvor genannten Kategorien nicht zugeordnet werden können und die für eine kovalente Bindung an Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate in Frage kommen, sind zum Beispiel Nukleinsäuren, Bruchstücke der Nukleinsäuren, Koenzyme, Peptide, Haptene, Hormone, Vitamine, Pharmaka sowie Sauerstoff bindende, transportiernde und aktivierende, synthetische Verbindungen.
Als bi- oder multifunktionelle Aktivierungsmittel für mit primären Aminogruppen, Thiolgruppen, Amidoximgruppen, Hydroxamsäuregruppen oder Karbonsäurehydrazldgruppen substituierte Polyoxyalkylenglykole Und ihre Monoalkoxyderivate werden Dialdehyde, aromatische, diazotierte Diamine, Diisocanate, Dilsothiocyanate, Säurechloride, Säureazide, und aktivierte Ester von Dikarbonsäuren, Diepoxide, Chinone, Karbodilmide, Epihalogenhydrine, 2,4,6-Trihalogon-1,3,5-triazine, oder 2-substituierte,4,6-Dihalogen-1,3,5-triazlne verwendet, wobei die Auswahl der bi- oder multifunktionellen Aktivierungsmittel auch durch die Reaktivität der substituierten Polymeren bestimmt wird. Die Aktivierungsreaktionen werdon vorzugsweise in organischen Lösungsmitteln ausgeführt und dann bei Reaktionstemperaturen von 20°C bis 80°C im Verlaufe von 30 Minuten bis 6 Stunden. Da bei einer Reihe von Reaktionen Säuren freigesetzt werden, wird in diesen Fällen in Gegenwart eines säurebindenden Mittels gearbeitet, zum Beispiel einem tertiärem Amin, Hetrocyclen mit endocyclischem, teritiärem Stickstoffatom, Alkalihydroxiden, Alkalikarbonaten, Alkalialkoholaten oder Alkalisalzen kondensierter Aromaten und Heteroaromaten. Die ebenfalls möglichen Aktivierungsreaktionen mit einer Reihe bl- oder multifunktioneller Aktivierungsmittel in wäßrigen Lösungen werden bei säurefreisetzenden Reaktionen vorzugsweise in Gegenwart von Puffersubstanzen durchgeführt.
Die Reaktionen zur kovalenten Bindung der biologisch aktiven Verbindungen an die aktivierten Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate können in Abhängigkeit von der zu bindenden Komponente unter unterschiedlichsten Reaktionsbedingungen ausgeführt werden. Eine bevorzugte Variante, vor allem für Proteine, besteht darin, daß die biologisch aktiven Verbindungen in Pufferlösungen mit pH-Werten von 2,0 bis 12,0 bei O0C bis 600C im Verlaufe von 1 Stunde bis 12 Stunden an die Polymeren kovalent gebunden werden. Eine andere bevorzugte Variante besteht darin, daß die kovalente Bindung der biologisch aktiven Verbindungen in wäßrigen Lösungen, Gemischen dieser mit organischen Lösungsmitteln, organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel bei O0C bis 1000C, bei Säuren freisetzenden Reaktionen in Gegenwart eines säurebindonden Mittels, im Verlaufe von 1 Stunde bis 10 Stunden erfolgt. Eine weitere erfindungsgemäße Variante ist dadurch gekennzeichnet, daß Biokatalysatoren und hierbei vorzugsweise Enzyme, in organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel bei O0C bis 100X, bei Säuren freisetzenden Reaktionen in Gegenwart eines säurebindenden Mittels, im Verlaufe von 1 Stunde bis 10 Stunden kovalent an die substituierten Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoyderivate gebunden werden. Bei den Umsetzungen In organischen Lösungsmitteln gegebenenfalls freigesetzte Säuren werden durch säurebindende Mittel wie teritiäre Amine, Heterocyclen mit endocyclischem, tertiärem Stickstoffatom, Alkalihydroxide, Alkalikarbonate, Alkalialkoholate, oder Alkalisalzen kondensierter Aromaten und Heteroaromaten gebunden und neutralisiert.
Für die Isolierung und gegebenenfalls erforderliche Reinigung der an substituierte Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate kovalent gebundenen, biologisch aktiven Verbindungen stehen eine Vielzahl bekannter Methoden zur Verfügung. Die mit Biokatalysatoren oder mit biokatalytisch inaktiven Proteinen modifizierten Polymeren werden in der Regel aus den wäßrigen Reaktionslösungen nach Methoden der Proteingewinnung und Proteinreinigung zum Beispiel durch Dialyse, Ultrafiltration und Gefriertrocknung oder durch Fällungsreaktionen mit anorganischen Salzen und organischen Lösungsmitteln Isoliert. Die dabei gewonnenen Produkte können durch chromatographische Methoden wie die Gel-, Ionenaustauscher oder Affinitätschromatographie weiter gereinigt werden. In organischen Lösungsmitteln lösliche Reaktionsprodukte der Umsetzungsreaktionen, besonders die Kopplungsprodukte von niedermolekularen, biologisch aktiven Verbindungen mit den substituierten Polyoxyalkylenglykolen und ihren Monoalkoxyderivaten, werden aus den Reaktionslösungen durch Verdampfen der organischen Lösungsmittel, gegebenenfalls im Vakuum oder durch Fällungsreaktionen mit anderen organischen Lösungsmitteln oder nach Versetzen der Reaktionslösungen mit Wasser durch Extraktion mit in Wasser nicht löslichen oder mischbaren, organischen Lösungsmittel und Ausfällen aus diesen Lösungsmitteln isoliert. Auch diese Reaktionsprodukte können weiter gereinigt werdon, zum Beispiel durch Umfallen, Umkristallisieren oder mit Methoden der Chromatographie. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können eine Vielzahl biologisch aktiver Verbindungen in einfacher Weise an Polymere vom Typ der Polyoxyalkylenglykole und ihrer Monoalkoxyderivate kovalent gebunden werden. Durch die kovalente Bindung entstehen neue und stabile Derivate biologisch aktiver Verbindungen. Sie besitzen für die praktische Anwendung vorteilhafte Eigenschaften, da sie in der Regel sowohl in wäßrigen Lösungen als auch in organischen Lösungsmitteln löslich sind. Dadurch ergeben sich breite und verbesserte Anwendungsfelder dieser modifizierten Polymeren in der Biotechnologie, Biochemie, Pharmazie und Medzin. Die Erfindung wird anhand von Beispielen weiter erläutert.
1 g w.w'-Dimercapto-polyethylenglyko! (MG 6000) In der Form seines Natriumsalzes werden in 7 ml destilliertem Wasser gelöst, und zu der Lösung werden 10mI Aceton zugetropft. Die Lösung wird auf 50C bis 10°C abgekühlt und tropfenweise mit einer acetonischen Lösung von 0,8g Cyanurchlorid In 5ml Aceton versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, danach mit 25ml destilliertem Wasser versetzt und anschließend dreimal mit jeweils 15ml Chloroform extrahiert. Das Chloroform wird verdampft, und zum festen Rückstand werden 50mg in 0,1 molarem Boratpuffer vom pH-Wert 10,0 aufgelöste Penlcillinacylase addiert. Nach dem Filtrieren wird die Lösung 8 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösung wird danach gegen destilliertes Wasser dialysiert, durch Ultrafiltration auf 2 ml eingeengt und lyophilisiert.
1 g w.w'-Diamino-polyethylenglykol (MG 6000) werden in 10ml 0,05 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst. Zu der Lösung werden 0,3ml 25%iger Glutaraldehyd addiert. Die Lösung wird 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt, und danach werden 10mg Cholesterinesterase in lyophilisierter Form zur Lösung addiert. Das Reaktionsgemisch wird 5 Stunden bei 40C gerührt und anschließend gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die resultierende Lösung wird durch Ultrafiltration auf 2 ml eingeengt und lyophilisiert.
Entsprechend Beispiel 2 wird das Enzym ß-Lactamase kovalent gebunden, mit der Ausnahme, daß ein 0,1 molarer Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,4 verwendet wird und das dialysierte und eingeengte Reaktionsgemisch zur Isolierung und Reinigung des modifizierten Enzyms auf eine mit einem AffinitätstrHger gefüllte Chromatographiesäule aufgetragen und chromatographiert wird.
1 g des Bishydroxamsäuredenvates des Polyethylenglykols (MG 6000) wird in 10ml 0,05 normaler Natronlauge gelöst, mit 1 ml Epichlorhydrin versetzt, und das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden auf 80°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das aktivierte Derivat des Polyethylenglykols dreimal mit jeweils 15ml Chloroform aus der wäßrigen Lösung extrahiert, das Chloroform wird verdampft, und zum festen Rückstand werden 10 mg Concanavalin A addiert, das in 10 mi 0,1 molarem Boratpuffer vom pH-Wert 10,0 aufgelöst war. Die Lösung wird 9 Stunden bei 30°C gerührt und danach gegen ein Calciumsalz und Zinksalz enthaltendes, destilliertes Wasser dialysiert. Die Lösung wird danach auf 2ml eingeengt, und das modifizierte Concanavalin A wird durch Fällung mit Ammoniumsulfat isoliert.
Es wird ein Reaktionsgemisch aus 1 g des Bisamidoximderivates des Polyethylenglykols (MG 6000) mit 1 ml 25%igem Glutaraldehyd und 0,1 ml einer Suspension vom Mikroorganismus Bacillus subtillis in 20ml 0,1 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 hergestellt, und die resultierende Suspension wird 5 Stunden bei 40C gerührt. Die Suspension wird danach gegen destilliertes Wasser dialysiert, und der Feststoff wird durch Zentrifugation von der Lösung abgetrennt. Zur Isolierung des Feststoffes ohne Dialyse wird dieser mehrfach mit destilliertem Wasser gewaschen und zentrifugiert.
1 g w-Methoxy-w'-hydroxamsäure-polyethylenglykol (MG 5000) werden in 20ml Chloroform gelöst und 0,4ml Toluendiisocyanat, aufgelöst in 5ml trockenem Aceton, werden zur Chloroformlösung addiert. Die Reaktionslösung wird 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt, danach auf etwa 5ml eingeengt und schließlich mit 50ml trockenem Ether versetzt. Der ausgefallene Niederschlag wird gesammelt, getrocknet und in dieser Form zu einer Enzymlösung bei 40C addiert, die hergestellt wurde durch Aullösen von Cholinoxidase oder Cholinesterase in destilliertem Wasser. Die resultierende Lösung wird auf Umgebungstemperatur gebracht und 1 Stunde bei dieser Temperatur gerührt. Danach wird gegen destilliertes Wasser dialysiert, die Lösung auf etwa 2ml eingeengt und lyophilisiert. Der Rückstand wird durch Gelchrumatographi9 mit Sephadex G50 weiter aufgetrennt, um die modifizierten Enzyme in reiner Form zu erhalten.
1 g Polyethylenglykol-w,w'-dikarbonsäure-dihydrazid (MG 6000) wird gemeinsam mit 0,5 g Benzechinon in einem Lösungsmittelgemisch aus 15ml Chloroform und 10ml Aceton gelöst. Es werden 0,2g Kaliumkarbonat zur Lösung addiert, und das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei 50°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird ein fester Rückstand abfiltriert, und die Lösung wird auf 5ml eingeengt und mit 50ml Petrolether versetzt. Der Niederschlag wird abgetrennt, getrocknet und zu 20ml eines 0,1 molarem Boratpuffers vom pH-Wert 8,0, in dem 20mg Rinderserum-Albumin aufgelöst waren, addiert. Dia Lösung wird 8 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, danach gegen destilliertes Wasser dialysiert, auf etwa 2 ml eingeengt und schließlich lyophilisiert.
1 g w-Methoxy-w'-mercapto-polyethylenglykol (MG 6000) werden in 25 ml Benzen gelöst, und 0,8 g 2-Methoxy-4,6-dichlor-1,3,5· triazin und 0,5ml Triethylamin werden zur Lösung addiert. Das Reaktionsgemisch wird 4 Stunden bei 8O0C gerührt und nach dom Abkühlen dreimal mit jeweils 20ml destifiertem Wasser ausgeschüttelt. Die Benzenschicht wird zur Trockne eingedampft, und zum Rückstand werden 10ml 0,5 molarer Boratpuffer vom pH-Wert 10,0 addiert, in dem 20mg Hemoglobin vom Rind aufgelöst waren. Die Lösung wird 8 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, danach gegen destilliertes Wasser dialysiert, eingeengt, und der Rückstand wird chromatographisch mit Hilfe einer mit Sephadex G50 gefüllten Säule aufgetrennt. Das erste Säuleneluat enthält das modifizierte Hemoglobin.
1 g Imidazol, 1 g w.w'-Dimercapto-polyethylenglykol (MG 6000) und 0,6g Cyanurchlorid werden in 50ml trockenem Benzen gelöst, und die Lösung wird 3 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösung wird filtriert, mit 20mg Lipase aus Rhizopus arrhizus versetzt, und die Suspension wird 3 Stunden bei 6O0C gerührt. Nach dem Abkühlen wird filtriert und das Benzen im Vakuum bei Normaltemperatur entfernt. Der Rückstand wird in destilliertem Wasser aufgenommen und über eine Sephadex G50-Säule chromatographiert. Ein biokatalytisch aktives, modifiziertes Lipasepräparat wird als erste Fraktion von der Säule eluiert.
1 g w'-Amidoximderivat des w-Methoxy-polyethylenglykols (MG 6000) werden zu 15ml frisch destilliertem Dimethylformamid addiert, in dem 0,3g Hemin und 1,5g Imidazol aufgelöst waren. Nachdem alle Komponenten aufgelöst waren, wird die Lösung auf eine Temperatur von 0°C bis 40C gebracht, und zur Lösung wird eine Lösung diazotierten Benzidins addiert. Das Reaktionsgemisch wird auf Umgebungstemperatur gebracht und 2 Stunden gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch in 75ml destilliertes Wasser eingetragen, und dreimal wird mit jeweils 20ml Benzen extrahiert. Die Benzenlösung wird mit Natriumsulfat getrocknet, auf 5 bis 10ml eingeengt und mit 75ml Petrolether versetzt. Der Niederschlag des mit w-Methoxypolyethylsnglykol modifizierten Komplexes aus Hämin und Imidazol wird gesammelt und bei Umgebungstemperatur getrocknet.
Claims (8)
1. Verfahren zur kovalenten Bindung von biologisch aktiven Verbindungen an substituierte Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate, dadurch gekennzeichnet, daß biologisch aktive Verbindungen an Thiolgruppen, primäre Aminogruppen, Amidoximgruppen, Hydroxamsäuregruppen oder Karbonsäurehydrazidgruppen enthaltende Polymere, abgeleitet vom Polymertyp der Polyoxyalkylenglykole oder ihrer Monoalkoxyderivate, die in wäßrigen Lösungen im pH-Bereich von 2 bis 12 oder organischen Lösungsmitteln beziehungsweise Lösungsmittelgemischen aus organischen Lösungsmitteln oder Gemischen von wäßrigen Lösungen und organischen Lösungsmitteln bei Reriktionstemperaturen im Bereich von O0C bis 15O0C im Verlaufe von 30 Minuten bis 8 Stunden, gegebenenfalls in Gegenwart eines säurebindenden Mittels oder einer Puffersubstanz, mit bi- oder multifunktionellen Aktivierungsmitteln aktiviert werden, in wäßrigen Lösungen, gegebenenfalls gepuffert oder in organischen Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart säurebindender Mittel oder Gemischen aus wäßrigen Lösungen und organischen Lösungsmitteln, die gegebenenfalls gepuffert oder mit säurebindenden Mitteln versetzt sind oder Gemischen organischer Lösungsmittel, gegebenenfalls ebenfalls in Gegenwart von säurebindenden Mitteln, im Verlaufe von 30 Minuten bis 12 Stunden bei Temperaturen von 00C bis 1500C kovalent gebunden werden und die Isolierung und Reinigung nach an sich bekannten Verfahren erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als biologisch aktive Verbindungen Biokatalysatoren wie Enzyme, Mikroorganismen, tierische, pflanzliche und humane Zellen, Zellorganellen, synthetische Enzyme und Koenzyme oder biokatalytisch inaktive Proteine wie Antigene, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Interferone, Hemoproteine, Albumine, zuckerbindende Proteine oder in vitro hergestellte Konjugate aus Biokatalysatoren und biokatalytisch inaktiven Proteinen oder nieder- und hochmolekulare Effektoren wie Nukleinsäuren, Bruchstücke von Nukleinsäuren, Koenzyme, Peptide, Haptene, Hormone, Vitamine, Pharmaka, Sauerstoff bindende, aktivierende und transportierende, synthetische Verbindungen sowie Affinitätsliganden eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als bi- oder multifunktionelle Aktivierungsmittel Dialdehyde, diazotierte, aromatische Diamine, Diisocyanate, Diisobiocyanate, gleichzeitig Diisocyanat- und Diisothiocyannatgruppen enthaltende Verbindungen, bisaktivierte Derivate von Dikarbonsäuren wie Säurechloride, Säureazide und aktivierte Ester, Diepoxide, Chinone, Epihalogenhydrine, Karbodiimide, 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazine oder 2-substituierte, 4,6-Dihalogen-1,3,5-triazine eingesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierungsreaktionen in organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel im Verlaufe von 30 Minuten bis 6 Stunden bei Reaktionstemperaturen von 2O0C bis 8O0C ausgeführt werden, bei Säuren freisetzenden Aktivierungsreaktionen in Gegenwart eines säurebindenden Mittels.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalente Bindung der biologisch aktiven Verbindungen in Pufferlösungen mit pH-Werten von 2,0 bis 12,0 bei O0C bis 600C im Verlaufe von 1 Stunde bis 12 Stunden erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalente Bindung der biologisch aktiven Verbindungen in wäßrigen Lösungen, Gemischen dieser mit organischen Lösungsmitteln, organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel bei O0C bis 1000C, bei Säuren freisetzenden Reaktionen in Gegenwart einer Puffersubstanz oder eines säurebindenden Mittels, im Verlaufe von 1 Stunde bis 10 Stunden erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die kovalenle Bindung von Biokatalysatoren, vorzugsweise von Enzymen, in organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel, bei Säuren freisetzenden Reaktionen in Gegenwart eines säurebindenden Mittels, bei 00C bis 1000C im Verlaufe von 1 Stunde bis 10 Stunden erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3,4,6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß als säurebindende Mittel tertiäre Amine, Heterocyclen mit endocyclischem, tertiärem Stickstoffatom, Alkalihydroxide, Alkalikarbonate, Alkalialkoholate oder Alkalisalze kondensierter Aromaten und Heteroaromaten eingesetzt werden.
:. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Biokatalysatoren Enzyme aus den Klassen der Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen und Isomerasen eingesetzt werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD33271989A DD287950A5 (de) | 1989-09-15 | 1989-09-15 | Verfahren zur kovalenten bindung von biologisch aktiven verbindungen an substituierte polyoxyalkylenglykole und ihre monoalkoxyderivate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD33271989A DD287950A5 (de) | 1989-09-15 | 1989-09-15 | Verfahren zur kovalenten bindung von biologisch aktiven verbindungen an substituierte polyoxyalkylenglykole und ihre monoalkoxyderivate |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD287950A5 true DD287950A5 (de) | 1991-03-14 |
Family
ID=5612328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD33271989A DD287950A5 (de) | 1989-09-15 | 1989-09-15 | Verfahren zur kovalenten bindung von biologisch aktiven verbindungen an substituierte polyoxyalkylenglykole und ihre monoalkoxyderivate |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD287950A5 (de) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0576589A4 (en) * | 1991-03-18 | 1994-07-27 | Enzon Inc | Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers |
| WO1995006484A1 (de) * | 1993-08-31 | 1995-03-09 | Rapp Polymere Gmbh | Lipopeptid-verbindungen |
| EP0605963A3 (de) * | 1992-12-09 | 1995-11-08 | Ortho Pharma Corp | Reagenzien für die Bildung von Peg-Hydrazon und Peg-Oxim Bindungen und Protein-Derivate daraus. |
| EP0883993A4 (de) * | 1996-08-08 | 2000-08-02 | Mitsuru Akashi | Antivirale materialien |
-
1989
- 1989-09-15 DD DD33271989A patent/DD287950A5/de not_active IP Right Cessation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0576589A4 (en) * | 1991-03-18 | 1994-07-27 | Enzon Inc | Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers |
| EP0605963A3 (de) * | 1992-12-09 | 1995-11-08 | Ortho Pharma Corp | Reagenzien für die Bildung von Peg-Hydrazon und Peg-Oxim Bindungen und Protein-Derivate daraus. |
| WO1995006484A1 (de) * | 1993-08-31 | 1995-03-09 | Rapp Polymere Gmbh | Lipopeptid-verbindungen |
| EP0883993A4 (de) * | 1996-08-08 | 2000-08-02 | Mitsuru Akashi | Antivirale materialien |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE2808476C2 (de) | Reagens zur Verwendung in immunochemischen Untersuchungsmethoden | |
| DE69917889T2 (de) | Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen | |
| DE69332268T2 (de) | Verfahren zur herstellung von rekombinant mhcii protein in mikroorganismen | |
| CA1267851A (en) | Coated transplants and method for making same | |
| DE69230061T2 (de) | Künstliches immunoglobulin-bindendes protein | |
| DE2430356A1 (de) | Verfahren zur markierung von immunoglobulin oder dessen fc-fragment und mittel zur durchfuehrung des verfahrens | |
| DE2322533A1 (de) | Verfahren zum binden von immunoglobulin und hilfsmittel zur durchfuehrung des verfahrens | |
| DE2433883A1 (de) | Geschuetztes polypeptid, im wesentlichen nicht immunogene, enzymisch aktive substanz sowie verfahren zum weitgehenden unterdruekken der immunogenizitaet eines polypeptids | |
| EP0134041A1 (de) | N-Chlorcarbonyloxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung | |
| DE2429398A1 (de) | Verfahren zum unloeslichmachen von aktiven proteinen | |
| EP0562371B1 (de) | Immobilisierung biochemischer Substanzen | |
| DE69030553T2 (de) | Verfahren zur Herstellung modifizierter Superoxid-Dismutase | |
| DE69007006T2 (de) | Ligand enthaltendes Medium für chromatographische Trennung, Verfahren zur dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Isolierung von synthetischen oder natürlichen Molekülen von einer Fluidmischung. | |
| EP0207100B1 (de) | Verfahren zum ändern der wirksamen porenweite einer struktur | |
| DD287950A5 (de) | Verfahren zur kovalenten bindung von biologisch aktiven verbindungen an substituierte polyoxyalkylenglykole und ihre monoalkoxyderivate | |
| EP0027161B1 (de) | Insulinderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
| EP0562373A2 (de) | Immobilisierung biochemischer Substanzen | |
| DD279486A1 (de) | Verfahren zur aktivierung von hydroxylgruppenhaltigen polymeren verbindungen | |
| DE69624975T2 (de) | Verwendung von Harnstoff- und Thioharnstoffverbindungen zur Entfernung oder Entgiftung von Superantigenen aus Körperflüssigkeiten | |
| DD287951A5 (de) | Verfahren zur immobilisierung biologisch aktiver verbindungen an polyoxyalkylenglykole und ihre monoalkoxyderivate | |
| DE3738721A1 (de) | Immobilisierte antikoerper | |
| EP0210532A2 (de) | Verfahren zur Reinigung und gegebenenfalls Gewinnung von Formiat-Dehydrogenase (FDH) aus Candida boidinii und FDH-haltiges Produkt | |
| DD287952A5 (de) | Verfahren zur modifizierung durch immobilisierung von biologisch aktiven verbindungen | |
| EP0444514A2 (de) | Immobilisierung von Proteinen an Trägern | |
| DE1966427A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansaeure |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |