CH505200A

CH505200A - Verfahren zur Herstellung von Primycin

Info

Publication number: CH505200A
Application number: CH1473166A
Authority: CH
Inventors: Valyi-Nagy Tibor Dr Prof; Kulcsar Gabor; Szilagyi Imre Dipl-Ing Dr Chem; Valu Gabriella Dipl-Ing D Chem; Magyar Karoly Dipl-Ing Dr Chem; Horvath Istvan Dipl-Ing D Chem; Hegyaljai Geza Dipl-Ing D Chem
Original assignee: Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1965-10-20
Filing date: 1966-10-12
Publication date: 1971-03-31
Also published as: BE688595A; SE346013B; FI43720C; DE1617383A1; DE1617383B2; DK116934B; NO122362B; DE1617383C3; FI43720B; ES332439A1; AT268522B; US3498884A; GB1159568A

Description

Verfahren zur Herstellung von Primycin
Es ist bekannt, dass das Antibiotikum Primycin, welches ursprünglich durch Züchtung des Pilzstammes Streptomyces primycini gewonnen wurde, sehr wertvolle therapeutische Eigenschaften zeigt. Das von den Pilzen erzeugte Antibiotikum wurde durch die direkte Extraktion der Fermentationsflüssigkeit oder durch die Ansäuerung der Fermentationsflüssigkeit und durch sog.

Fällungsadsorption oder durch Aussalzen isoliert (vgl.

Nature 174, 1105 (1954); Pharmazie 11, 304 (1956); ungarisches Patent 146 332 (1958) und 151 197 (1963).

Der Stamm Streptomyces primycini zeigte an verschiedenen, in Stickstoffquellen reichen Nährböden eine sehr niedrige Produktionsfähigkeit, welche weder durch Anwendung von weiteren, von dem ursprünglichen abweichenden Nährboden noch durch Selektions- und Veredelungsversuche auf ein die rationelle betriebliche Produktion ermöglichendes Niveau gesteigert werden konnte. Die Züchtung von produktionsfähigen natürlichen Varianten dieses Stammes war auch deshalb ziemlich schwierig, weil der Stamm S. primycini an verschiedenen festen Nährböden weder Luftmycelien noch Sporen erzeugte (vgl. Acta Pharm. Hung. XXXI, 3, 133, 140).

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues, zur betrieblichen Produktion ausreichende hohe Ausbeuten lieferndes Verfahren zur Herstellung von Pri- mycin; dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man den neuen Mikroorganismenstamm Thermopolyspora galeriensis, welcher bei dem ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen unter Nr. 650 707 deponiert wurde, oder Abkömmlinge, Varianten bzw. Mutanten dieses Stammes an einem organische Kohlenstoffquellen, organische Stickstoffquellen, anorganische Salze und vorteilhaft natürliche und/oder synthetische Fette, Öle, Fettalkohole bzw. Fettsäuren enthaltenden Nährboden, in gerührter und belüfteter submersen Kultur züchtet und nach Erreichung einer entsprechenden Wirkstoffkonzentration das erzeugte rohe Primycin aus dem Fermentationsmedium isoliert.

Der beim erfindungsgemässen Verfahren angewendete Thermopolyspora-galeriensis-Stamm unterscheidet sich mikromorphologisch wesentlich von den zur Gattung Streptomyces zählbaren Stämmen, so auch vom Streptomyces primycini, und kann nach den Klassifikationssystemen von Waksman bzw. von Krasilnikow in die Gattung Thermopolyspora bzw. Mikromonospora eingereiht werden. Die Luftmycelien dieses Stammes zeigen nicht die charkateristischen strukturellen Eigenschaften der Gattung Streptomyces, d. h. die Mycelien sind nicht in Sporen fragmentiert, sondern die einzeln oder in Gruppen erscheinenden runden oder ovalen Sporen entwickeln sich an den kurzen Verzweigungen der Mycelien.

Der erfindungsgemäss angewendete neue Stamm unterscheidet sich also von dem früher beschriebenen Stamm Streptomyces primycini unter anderem auch in den grundlegenden morphologischenEigenschaften, dass er grosse Mengen von Sporen erzeugt und an den von uns verwendeten Nährböden gut entwickelte Luftmycelien bildet. Das Mycel zeigt in seinen späteren Entwicklungsstufen - in Abhängigkeit vom angewendeten Nährboden - Neigung zur Lyse.

Der von uns isolierte Stamm Thermopolyspora galeriensis übertrifft mit seiner hohen Antibiotikumproduktion sämtliche Varianten des früher beschriebenen Streptomyces primycini, die im allgemeinen höchstens 250 bis 300 y/ml Primycin stabil erzeugen konnten. Dieser frühere Stamm lieferte zwar in einigen Fällen vor übergehend ebenfalls hervorragende Ausbeuten (so z. B.

der im ungarischen Patent Nr. 151 197 beschriebene Stamm auch 1100 y/ml), diese konnten unter betrieblichen Verhältnissen nicht stabil aufrechterhalten werden. Demgegenüber haben sich die aus dem neuen Stamm durch weitere mutagene Behandlung und Selektion gewonnenen Varianten mit einer stabilen Produktionsfähigkeit von 2000 bis 4000 r/ml als zur wirtschaftlichen betrieblichen Antibiotikumproduktion völlig geeignet erwiesen.

Der Stamm Thermopolyspora galeriensis zeigt an verschiedenen Nährböden weitgehend unterschiedliche Farben; es kann in Abhängigkeit teils von der Zusammensetzung des Nährbodens, teils von äusseren Einflüssen (Bestrahlung, chemische Mittel usw.) und auch vom Alter des Mycels vom schmutzig-weissen über den hellgelben und gelbbraunen bis zum dunkelgrünen fast jeder Farbton beobachtet werden.

Die Kolonien zeigen im allgemeinen - an optimalen Nährböden - eine runde, linsengrosse, sich hervorhebende kraterartige, radial gefurchte Form; es können aber, teils durch spontane Mutationen, teils durch verschiedene Einflüsse (z. B. durch Röntgenbestrahlung), auch konzentrisch gerippte oder unregelmässig geschrumpfte Kolonien erhalten werden. An unzureichenden Nährböden werden kleinere, sogar nur punktförmige Kolonien erhalten.

Wenn ein dickes, konzentriertes Inoculum angewendet wird, dann fliessen die Kolonien an optimalen Nährböden zu einem gefurchten dicken Belag zusammen.

Es werden aber ganz unabhängig von der Form, Grösse und Farbe der Kolonien an geeigneten Nährböden immer gleichmässig gute Fermentationsergebnisse erhalten. Für die Entwicklung dieser Pilze ist eine höhere Temperatur (37 C) noch günstiger als die bei Streptomyceten allgemein üblichen 27 C, man kann aber unter betrieblichen Verhältnissen auch bei 27 bis 28 C gute Ergebnisse erreichen.

Die Luftmycelien sind fein und dünn, es erscheinen daran schon verhältnismässig früh (nach 48 Stunden) die charakteristischen kleinen Sporen, deren Zahl später sehr erheblich wird. Die Mycelien können, in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Nährbodens und von der Temperatur, nach dem dritten oder vierten Tag Lyse erleiden.

Das Verhalten dieses neuen Thermopolyspora-Stammes wurde an 97 verschiedenen Nährböden untersucht.

Die Ergebnisse dieser Beobachtungen wurden in den nachstehenden Tabellen I-III zusammengefasst.

Die Tabelle I zeigt die an dem als Identifizierungsgrundlage international anerkannten sog. Waksmanschen Identifizierungsnährboden beobachtbaren charakteristischen Wachstumserscheinungen. In der ersten Spalte der Tabelle sind die Daten der weissen Variante von Thermopolyspora galeriensis, in der zweiten Spalte die Daten einer grünen Variante und in der dritten Spalte die Daten einer gelben Variante angegeben.

Das Wachstum der Mikroorganismen wurde fortlaufend beobachtet, und die Beobachtungen wurden in verschiedenen Zeitintervallen, und zwar nach 72, 120, 168, 240 bzw. 336 Stunden Inkubation registriert.

Tabelle I
Das Verhalten von drei Varianten der Thermopolyspora galeriensis an verschiedenen Nährböden (Waksman-Reihe)
I = Th. galeriensis, weisse Variante
I/1 = Th. galeriensis, grüne Variante
I/2 = Th. galeriensis, gelbe Variante Nährboden
Ausmass des Wachstums
I 1/1 1/2 Czapek-Agar (+) (+) (+) Glucose-Asperagin- +++ +++ +++
Agar Glyzerin-Agar - Tyrosin-Agar + +++ ++ Fleisch-Pepton- ++++ ++++ ++++
Agar Glucose-Pepton- ++++ ++++ ++++ + +3++
Agar A.

Glucose-Pepton- ++++ ++++ ++++
Gelatine Fleisch-Pepton- (+) (+) (+)
Gelatine Pepton-Gelatine (+) (+) (+) Stärke-Agar mit (+) (+) (+) anorganischer
Stickstoffquelle Stärke-Agar mit + + +(+) organischer
Stickstoffquelle Eiweiss-Agar + (+) + Kartoffel-Agar ++++ ++++ ++++ Kartoffel-Glucose- ++++ ++++ ++++
Agar Stärke-NO3-Agar (+) + (+) Glucose-Bouillon (+) (+) (+) Nähr-Bouillon +++ + +++ Czapek-Lösung - - (+) Stärke-Lösung - (+) Hefeextrakt(A) + +++ +(+) Hefeextrakt(B) ++ ++ (Mg + Fe) Hefe-Glucose-Agar ++++ ++++ ++++ <RTI

ID=2.27> Emerson-Agar - - (+) Cornsteepliquor ++++ +(+) Sojamehl- ++++ ++++ ++++
Nährboden Synthetischer Lace- - tat-Nährboden Calciummalat- + +
Nährboden Cellulose-Digestion Lalunus-Milch koaguliert koaguliert koaguliert nicht nicht nicht schwache schwache schwache
Rotfärbung Rotfärbung Rotfärbung Pepton-Gelatine verflüssigt verflüssigt verflüssigt Nitrat-Nährboden (+) (+) + + Kartoffelschnitte ++++ +++ + Gelbe Rüben (+) (+) (+)
Schnitte Cystin-Nährboden keine H2S -Bildung ,Die Variante 1/1 produziert an Glücose-Pepton-Agar und an Kartoffelschnitten ein grünes

Pigment, während von der Variante I/2 an Tyrosin-Agar ein braunes Pigment erzeugt wird.

Zeichenerklärung
Sehr gutes Wachstum ++++
Gutes Wachstum +++ Mittelmässig gutes Wachstum + +(+)
Mittelmässiges Wachstum + +
Mittelmässig schwaches Wachstum +(+)
Schwaches Wachstum +
Sehr schwaches Wachstum (+)
Kein Wachstum
Der Einfluss von verschiedenen Stickstoffquellen auf das Wachstum von Thermopolyspora galeriensis wurde derart untersucht, dass in Czapek-Doxschen Nährböden das als anorganische Kohlenstoffquelle anwesende Stickstoffnitrat durch äquivalente Mengen (auf Stickstoff berechnet) der einzelnen organischen Stickstoffquellen ersetzt wurde.

In der nachstehenden Tabelle II wurden die an durch verschiedene organische Stickstoffquellen modifizierten Czapek-Doxschen Nährböden beobachteten Wachstums eigenschaften der drei Varianten von Thermopolyspora galeriensis zusammengefasst. Das Wachstum und die Pigmenterzeugung der Kolonien wurden in verschiedenen Zeitpunkten der Wachstumsperiode des Stammes (nach 72, 120, 168, 240 und 336 Stunden) registriert.

Tabelle II
Das Wachstum Ider drei Varianten von Thermopolyspora galeriensis an verschiedene Stickstoffquellen enthaltenden Nährböden Stickstoffquelle
Ausmass des Wachstums
I 1/1 1/2 dl-Tyrosin +(+) ++(+) ++ Uracyl + (+) + dl-Glutamin +++ + ++ dl-Phenylalanin ++(+) + ++ Adenylsäure ++(+) ++ dl-Leucin ++(+) ++ ++ Citosin + (+) + Thymonucleinsäure (+) + ++ Hypoxantin + (+) + dl-Norleucan + + ++ dl-Valin ++(+) ++(+) ++(+) dl-Serin ++ ++(+) +++ l-Ornithin + ++(+) ++ l-Asparagin ++(+) ++ l-Cystein ++ + ++ Sarcosin (+) (+) (+) Citidin ++(+)

++ ++(+) d-Alanin + + dl-Prolin +(+) + l-Threonin + +(+) + +(+) ++ Glykokoll ++(+) ++(+) ++ l-Lysin ++ ++ + l-Arginin +(+) +(+) +(+) Uridin + + + l-Hystidin +(+) ++ l-Tryptofan + (+) l-Citrullin +(+) ++(+) +(+) dl-a-Amino-n- +(+) ++ buttersäure (NH4)2SO4 +++ +++ ++ Ribonucleinsäure + + + Zeichenerklärung siehe Tabelle I.

Der Stamm I produziert an l-Tryptophan enthaltenden Nährböden ein braunes Pigment.

Die Variante 1/1 erzeugt an mehreren verschiedenen Stickstoffquellen (dl-Tyrosin, dl-Phenylalanin, Citidin, l-Lysin, L-Arginin, Ammoniumsulfat etc.) ein grünes Pigment.

Die Variante I/2 erzeugt an l-Tryptophan enthaltenden Nährböden ein braunes Pigment.

Zur Ermittlung der Kohlenstoffverwertungsfähigkeit des neuen Stammes wurde ein anorganischen Stickstoff enthaltender Czapekscher Nährboden verwendet, dessen Kohlenstoffhydratgehalt durch gleiche Menge der in Tabelle III aufgezählten Kohlenstoffhydrate ersetzt wurde.

Das Wachstum der Mikroorganismen wurde nach Inkubation von 72, 120, 168, 240 und 336 Stunden beobachtet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefasst.

Tabelle HI
Wachstum der drei Varianten von Thermopolyspora galeriensis an verschiedenen Kohlenstoffquellen.

Kohlenstoffquelle
Ausmass des Wachstums
I 1/1 1/2 Saccharose + + Glucose + (+) + Mannit + + Galactose - (+) (+) Sorbose - - - Xylose - - - Ramnose +(+) + ++ Arabinose - - - Laktose - - Fruktose - - (+) Maltoe: Ribose - - Glycerin + + Natriumacetat (+) (+) Natriumzitrat - ¯ Natriumtartarat - (+) +(+) Natriumformiat (+) (+) (+) Zeichenerklärung siehe Tabelle I.

Da nach unseren Erfahrungen die anorganische Stickstoffquelle im allgemeinen nicht günstig für die Entwicklung von Thermopolyspora galeriensis ist, haben wir den Einfluss verschiedener Kohlenstoffhydrate auf das Wachstum dieses Stammes auch in der Anwesenheit einer organischen Stickstoffquelle (L-Asparagin) untersucht.

Als Nährboden wurde dabei ebenfalls der Czapek Doxsche Nährboden angewendet, dessen Natriumnitratgehalt aber durch eine äquivalente Menge von L-Asparagin und der Sacharosegehalt durch gleiche Menge der verschiedenen, in der Tabelle III aufgezählten Kohlenstoffhydrate ersetzt wurde.

Das Wachstum der Mikroorganismen wurde nach 72-, 120-, 168-, 240- bzw. 336stündigem Inkubieren bei 37 C beobachtet. Die erhaltenen Ergebnisse wurden in der nachstehenden Tabelle IV zusammengefasst.

Tabelle IV
Wachstum von Thermopolyspora galeriensis an verschiedenen Kohlenstoffquellen, in der Anwesenheit von organischer Stickstoffquelle (L-Asparagin).

Stickstoffquelle Ausmass des Wachstums Saccharose Glucose + + + + Mannit
Galactose ++ Sorbose Xylose Ramnose fSf+ Arabinose Laktose Fruktose Maltose + + Ribose Glycerin + + + + Natriumacetat +++ + Natriumzitrat Natriumformiat + Natriumtartarat + Zeichenerklärung siehe Tabelle I.

Der Thermopolysporazgaleriensis-Stamm wird zur Primycinerzeugung zweckmässig an einem Nährboden gezüchtet, welcher Kohlenhydrate, wie Stärke oder Saccharose, als organische Kohlenstoffquelle, stickstoffhaltige organische Stoffe, wie Sojamehl, Hefezellen-Suspension usw., als Stickstoffquelle und teilweise als Schaumbekämpfungsmittel, teilweise aber als weitere Kohlenstoffquelle verschiedene tierische oder pflanzliche Öle und Fette bzw. deren Bestandteile, wie Palmöl, Sonnenblumenöl, Stearinsäure, Glycerin usw., und als anorganische Salze, in erster Linie Alkaliphosphate und Chloride, ferner Kalciumcarbonat enthält.

Die Fermentation kann vorteilhaft bei Temperaturen zwischen 27 und 40 OC durchgeführt werden; bei den höheren, bis etwa 37 OC steigenden Temperaturen ist das Wachstum der Pilze schneller, und die Fermentationszeit kann dadurch gekürzt werden, aber unter betrieblichen Umständen können auch bei Temperaturen um 27-28 qC sehr gute Ergebnisse und hohe Ausbeuten erreicht werden. Die Fermentation wird unter Rühren und Belüften durchgeführt.

Das von den Mikroorganismen erzeugte Primycin kann aus dem Fermentationsprodukt auch nach den üblichen Extraktionsmethoden, z. B. mit n-Butanol, isoliert werden. Bei dem gegenüber den bisher üblichen Fermentationsverfahren viel höhere Primycinkonzentrationen ergebenden erfindungsgemässen Verfahren ist aber die Anwendung der üblichen organischen Lösungsmittel ziemlich schwierig, da das Primycin in apolaren Lösungsmitteln unlöslich und in polaren Lösungsmitteln im allgemeinen schlecht löslich ist. Es wird daher zur Isolierung des erzeugten Primycins aus den Mycelien vorteilhafter ein binäres oder ternäres Gemisch von polaren Lösungsmitteln, zweckmässig z. B. wässriger, etwa 800obiger Methylalkohol, verwendet.

Dabei wird vorteilhaft folgendermassen vorgegangen:
Der Wirkstoffgehalt der Fermentationsflüssigkeit wird bei höherer Temperatur, etwa bei 70 bis 90 OC, aus schwach saurem Medium (pH = 5 bis 7), mit den Mycelien gefällt, das Antibiotikum wird dann aus dem erhaltenen feuchten Niederschlag durch Kochen mit einem polaren Lösungsmittelgemisch, zweckmässig mit einem wässrigen Alkohol, z. B. mit 800/oigem Methanol, extrahiert. Das rohe Produkt von grosser antibiotischer Aktivität kann Idann durch Einengen dieses Lösungsmittelgemisches isoliert werden. Das Primycin ist bekannterweise thermostabil, zeigt z.

B. in wässrigem Medium bei 10stündigem Kochen keinen Aktivitätsverlust; der Wirkstoff wird also beim Abkochen der Fermentationsflüssigkeit nicht zersetzt, scheidet sich vielmehr an den durch das Kochen denaturierten Mycelien und sonstigen anwesenden Eiweissstoffen adsorbiert ab. Der auf diese Weise erhaltene und das Antibiotikum in adsorbiertem Zustand enthaltende Niederschlag wird dann durch Filtrieren oder Zentrifugieren separiert. Die supernatante Flüssigkeit enthält nur belanglose Mengen (2 bis 20 y/ml) des Primyoins und kann verworfen werden. Das feuchte Mycelium wird dann vorteilhaft mit wässrigem Methanol aufgekocht, wobei fast der gesamte Wirkstoffgehalt in die Lösung übergeht.

Die vom Niederschlag getrennte Lösung wird dann in Vakuum eingeengt, wobei das rohe Primycin sich spontan abscheidet, während die wasserlöslichen Verunreinigungen grösstenteils in der wässrigen Mutterlauge verbleiben und durch Vakuumfiltration leicht vom abgeschiedenen Primycin getrennt werden können. In dieser Weise wird ein verhältnismässig reines Rohprodukt von hoher antibiotischer Aktivität (40 bis 70 /0 Primycingehalt) mit sehr guter Ausbeute (70 bis 900/0 der antibiotischen Aktivität der Fermentationsflüssigkeit) erhalten.

Die weitere Reinigung des in obiger Weise erhaltenen rohen Produktes und die Gewinnung des Primycins in 1000/oiger Reinheit kann nach der in den ungarischen Patentschriften Nr. 146 332 (1958) und Nr. 151 197 (1963, Zusatzpatent zum ungarischen Patent 146 332) beschriebenen Methode durchgeführt werden. Nach dieser Methode wird das Primycin in wässrig-alkoholischer Lösung von den alkohollöslichen Eiweissstoffen durch Fällung mit Bleisalzen befreit, die noch anwesenden pigmentartigen Verunreinigungen mit Hilfe eines Gemisches von Aktivkohle mit einem chemisch indifferenten festen Lockerungsmittel von grosser spezifischer Oberfläche (Cellulosepulver, Hyflio Filtermittel, gefälltes Kalciumcarbonat usw.) adsorbiert und das Primycin aus der nunmehr reinen Lösung in bekannter Weise isoliert.

Die erfindungsgemässe Herstellung von Primycin durch Fermentation des neuen Mikroorganismenstammes und die Isolierung des rohen Primycins aus der Fermentationsflüssigkeit wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht.

Beispiel 1
Fermentation von Thermopolyspora galeriensis im Laboratorium
Zur Erzeugung des Inoculuins wird der folgende Nährboden verwendet:
Sojamehl 2,0 /o
Kartoffelstärke 2,0 /o
Kalciumcarbonat 0,5 O/o
Natriumchlorid 0,3 Olo
Kaliumdihydrophosphat 0,1 /o
Palmöl 0,5 /o pH vor der Sterilisierung 8,5
Der in obiger Zusammensetzung hergestellte Nährboden wird in Autoklaven unter 1,5 Atm 24 Minuten erhitzt, dann werden in 500 ml Erlenmeyerkolben je 100 ml des Nährbodens mit einer Sporen- bzw.

Myceliensuspension des Stammes Thermopolyspora galeriensis eingeimpft und bei 27 OC an einem Schütteltisch von 5 cm Hublänge 48 bis 60 Stunden geschüttelt.

Mit dem auf diese Weise hergestellten Inoculum wird dann ein Produktionsnährboden der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:
Sojamehl 4,0 O/o
Kartoffelstärke 4,0 Olo
Kalciumcarbonat 0,5 /o
Natriumchlorid 0,3 /o
Kaliumdihydrophosphat 0,1 /o
Palmöl 0,5 /o
Stearinsäure 0,3 O/o pH vor der Sterilisierung 8,8
Der in obiger Zusammensetzung hergestellte Nährboden wird in Autoklaven unter 1,5 Atm 25 Minuten erhitzt, dann in Mengen von 30 bis 35 ml in 500 ml Erlenmeyerkolben verteilt und mit 1 bis 5 0/0 des in obiger Weise erhaltenen Inoculums versetzt. Die Kolben werden bei 28 "C 97 bis 120 Stunden geschüttelt.

Der Primycingehalt des erhaltenen Fermentationsproduktes kann durch biologische Wertmessung bestimmt werden.

Beispiel 2
Betriebsfermentation mit Thermopolyspora galeriensis
Es wird zunächst ein Vorinoculum hergestellt, auf einem Nährboden Ider folgenden Zusammensetzung:
Sojamehl 4,0 O/o
Kartoffelstärke 4,0 O/o
Kalciumcarbonat 0,5 O/o
Natriumchlorid 0,3 O/o
Kaliumdihydrophosphat 0,1 O/o
Palmöl 0,5 O/o pH vor Ider Sterilisierung 8,5
Der Nährboden wird in Autoklaven unter 1,5 Atm 25 Minuten sterilisiert, dann in Portionen von 100 ml in Erlenmeyerkolben verteilt, mit einer Sporen- oder Myceliumsuspension des Stammes Thermopolyspora galeriensis eingeimpft und bei 27 OC 48 bis 60 Stunden geschüttelt.

Das in dieser Weise erhaltene Vorinoculum wird dann auf einen Inoculum-Nährboden der folgenden Zusammensetzung übertragen:
Sojamehl 4,0 /o
Kartoffelstärke 4,0 O/o
Kalciumcarbonat 0,5 O/o
Natriumchlorid 0,3 /o Kaliumdihydrogersphosphat 0,1 /o
Palmöl 1,00/o pH vor der Sterilisierung 8,8
Nach einstündigem Sterilisieren bei 1,3 bis 1,5 Atm wird der obige Nährboden in einem Vermentor von 100 Litern nützlichem Rauminhalt mit 1 bis 5 Vol.- /o des obigen Vorinoculums versetzt und bei 27 OC 48 bis 60 Stunden unter Rühren mit 250 U/min und Belüften inkubiert.

Die auf diese Weise erhaltene Kultur wird dann als Inoculum für die Produktionsfermentation verwendet.

Diese wird in einem Fermentor aus Eisen oder aus rostfreiem Stahl mit 1 m3 nützlichem Rauminhalt durchgeführt. In diesem Fermentor wird ein Nährboden der folgenden Zusammensetzung eingebracht:
Sojamehl 4,0 /o
Kartoffelstärke 4,0 O/o
Kalciumcarbonat 0,5 O/o
Natriumchlorid 0,3 O/o
Kaliumdihydrogenphosphat 0,1 /o
Palmöl 0,6 /o
Stearinsäure 0,3 O/o pH vor der Sterilisierung 8,8-9,0
Der obige Nährboden wird 1 Stunde bei 1,3 bis 1,5 Atm sterilisiert, dann mit 10 Vol.-O/o des obigen Inoku lmns versetzt. Die Fermentation wird bei 27 OC 96 bis 120 Stunden, unter stetigem Rühren (wenigstens 250 U/min) und Belüften mindestens 1:1) fortgesetzt.

Beispiel 3
Gewinnung des rohen Primycins aus dem im
Laboratorium erhaltenen Fermentationsprodukt
Die nach Beispiel 1 erhaltene Fermentationsflüssigkeit, deren durch Titrieren ermittelter Wirkstoffgehalt 520 bis 530 ylml war (dieser Wirkstoffgehalt entspricht auf 10 Liter Schüttelkultur berechnet einem gesamten reinen Primycingehalt von 5,2 g) wurde mit 1 N H2SO4 auf pH 5 bis 6 eingestellt und zum Denaturieren der Mycelien auf 70 "C erhitzt. Die abgeschiedenen Mycelien, welche auch die überwiegende Menge des Wirkstoffgehaltes adsorbiert enthielten, wurden durch Zentrifugieren abgetrennt. Die supernatanta Flüssigkeit enthielt nur 11 y/ml Antibiotikum (2,1 o/o der produzierten gesamten antibiotischen Aktivität) und konnte daher verworfen werden.

Der feuchte Niederschlag wurde sechsmal mit je 1,5 Liter 800/oigem Methanol je 1 Stunde am Wasserbad erhitzt und durch Zentrifugieren wieder separiert.

Dabei wurde das Antibiotikum in die methanolischen Phasen extrahiert; die vereinigten methanolischen Extrakte (von denen die zwei letzten, Primycin kaum mehr enthaltenden Extrakte ohne wesentlichen Wirkstoffverlust verworfen werden können) wurden im Vakuum auf ein Gesamtvolumen 1,25 Liter eingeimpft, das abgeschiedene rohe Produkt abgenutscht und im Vakuum bei 40 C getrocknet. Es wurden 10,6 g rohes Primycin erhalten; das rohe Produkt zeigte bei der biologischen Wertmessung 41 /0 antibiotische Aktivität, enthielt also 4,35 g reines Primycin. Die auf den gesamten 5,2 g Primycingehalt des Fermentationsproduktes berechnete Ausbeute war also 84 O/o. Die Mutterlauge zeigte noch 5 O/o Primycingehalt.

Beispiel 4
Gewinnung des rohen Primycins aus dem Betriebsfermentationsprodukt
Die nach Beispiel 2 erhaltene gesamte 1 m3 Fermentationsflüssigkeit, deren durch Titrieren ermittelte Primycingehalt 1600 r/ml war, wurde auf 80 bis 90 OC erhitzt, dann bei pH=6 bis 7 warm filtriert. Das nur unerhebliche antibiotische Aktivität (10 7/mm) zeigende Filtrat wurde verworfen, und die 70 O/o Feuchtigkeit ent haltende Mycelienmasse von 124,6 kg Gesamtgewicht und 1,6 kg Prymicin-Gesamtgehalt wurde in zwei Portionen weiterverarbeitet.

a) Der erste, 61,2 kg Gesamtgewicht zeigende Teil des feuchten Niederschlages wurde mit 250 Liter 80ozon igem Methanol versetzt, aufgekocht und 3 Stunden gerührt. Die flüssige Phase wurde dann durch Filtrieren getrennt; das erhaltene Filtrat (240 Liter) zeigte eine biologische Aktivität von 2860 y/ml, entsprechend einem Primycingehalt von 287 g reinem Primycin (43 O/o der gesamten Aktivität der Ausgangsflüssigkeit).

b) Der zweite, 63,4 kg Gesamtgewicht zeigende Teil der obigen feuchten Mycelienmasse wurde mit der unter a) erhaltenen, schon extrahierten und abfiltrierten Mycelienmasse vereinigt und in ähnlicher Weise, aber durch Aufkochen mit 400 Liter 800/obigem Methanol extrahiert. Die durch Filtrieren getrennte, 430 Liter methanolische Lösung zeigte eine antibiotische Aktivität von 2000 ,/mol, also einen Gesamtgehalt von 860 g reinem Primycin (54 O/o).

c) Der nach der zweiten Extraktion zurückgebliebene 80 kg feuchte Niederschlag wurde mit weiteren 400 Litern 800/obigem Methanol nochmals aufgekocht. Dlas erhaltene 300-Liter-Filtrat hatte 50 rlml antibiotische Aktivität, enthielt also nur mehr 16,5 g reines Primycin (1,03 O/o). In diesen drei Extrakten wurde also 98 O/o der gesamten antibiotischen Aktivität des Ausgangsproduktes erhalten; der dritte, in der Extraktion c) erhaltene methanolische Extrakt konnte aber wegen seines niedrigen Antibiotikumgehaltes schon verworfen werden.

Die Extrakte a) und b) wurden vereinigt, und die so erhaltene, 670 wässrig-methanolische Lösung wurde im Vakuum bei 40 bis 45 OC auf ein Volumen von 91 Liter eingeengt, auf +6 OC abgekühlt und 20 Stunden stehen gelassen. Das abgeschiedene rohe Primycin wurde im Vakuum abgenutscht. Diese Mutterlauge zeigte eine antibiotische Aktivität von nur 40 y/ml.

Das abfiltrierte rohe Produkt wurde im Vakuum bei 40 oC bei konstantem Gewicht getrocknet. Es wurden 1,93 g rohes Primycin erhalten, dessen durch biologische Wertmessung bestimmte Aktivität einem Gehalt von 1,25 kg reinem Primycin entsprach. Die auf die antibiotische Aktivität des unmittelbaren Fermentationspro duktes berechnete Ausbeute war also 78,3 O/o.

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur Herstellung von Primycin, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen des Stammes Thermopolyspora galeriensis oder deren Abkömmlinge, Varianten bzw. Mutanten an einem organische Kohlenstoffquellen, organische Stickstoffquellen, anorganische Salze und natürliche und/oder synthetische Fette, Öle, Fettalkohole bzw. Fettsäuren enthaltenden Nährboden, in gerührter und belüfteter Kultur züchtet und nach Erreichung einer entsprechenden Wirkstoffkonzentration das erzeugte rohe Primycin aus dem Fermentationsmedium isoliert.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man im zur Primycinproduktion verwendeten Nährboden Kohlenhydrate, vorteilhaft Stärke und/ oder Zucker als Kohlenstoffquelle, stickstoffhaltige natürliche oder synthetische Stoffe, vorteilhaft Aminosäuren, organische Basen, Säureamide, Sojamehl, Maisquellwasser als Stickstoffquellen und Phosphate, Nitrate, Chloride und/oder Carbonate als anorganische Salze verwendet.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Nährboden Palmöl und/ oder Stearinsäure zusetzt.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentation bei 27 bis 40 C bei pH-Werten von 6 bis 9 durchführt.

4. Verfahren nach Patentanspruch und Unteransprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das erzeugte Primycin mit den Mycelien, bei pH = 5 bis 7 durch Erwärmen der Fermentationsflüssigkeit fällt und das Antibiotikum durch Aufkochen der feuchten Mycelienmasse mit einem Gemisch von polaren Lösungsmitteln, vorteilhaft mit wässrigem Methanol, extrahiert.