DD202891A5 - Neue carcinostatische und immunostimulierende substanzen,verfahren zu ihrer herstellung und carcinostatische mittel mit einem gehalt derselben - Google Patents

Abstract

Es werden neue TF-2 Substanzen m. carcinostatischer u. immunostimulierender Wirkung beschrieben. Sie werden erhalten a. d. Kulturmasse o. der ueberstehenden Fluessigkeit, welche gewonnen wird durch Kultivierung eines Bakterienstamms der Gattung Fusobacterium. Die Substanzen sind brauchbar zur Behandlung von Krebserkrankungen bei Saeugetieren und Menschen. Die Beschreibung bezieht sich auf die Substanzen selbst sowie auf Verfahren zur Herstellung derselben und auf ein carcinostatisches Mittel mit einem Gehaltderselben.

Description

Neue carcinostatische und immunostimulierende Substanzen» Verfahren zur Herstellung derselben und carcinostatische Mittel mit einem Gehalt derselben

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Substanzen mit careinostatischer und immunostimulierender Aktivität. Bei diesem Verfahren werden Bakterien, welche zum Genus Fusobacterium gehören und die TF-2-Substanzen erzeugen, unter anaeroben Bedingungen kultiviert. Dabei erhält man aus der Kultur oder aus der überstehen-

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den Flüssigkeit neuartige Substanzen, welche mit TF-2 bezeichnet werden. Ferner bezieht sich die Erfindung auf die TF-2-Substanzen und insbesondere auf die Substanzen TF-210, 220, 230, 240, 250, 300 (310, 320, 330;, 340 und 350. Schließlich bezieht sich die Erfindung auch auf ein carcinostatisches Mittel mit einem Gehalt derselben.

Charakteristik der bekannten Lösungen:

Als Mittel zur Behandlung von Patienten mit verschiedenen Krebsarten werden in jüngster Zeit Mittel zur Steigerung ~-~ der immunologischen Funktion des Patienten intensiv un- ^K-'^J tersucht. Diese Mittel führen durch Unterstützung der immunologischen Funktion zu einem carcinostatischen Effekt. Derartige Antitumormittel werden aus verschiedensten Or-— ganismen, z.B. aus verschiedenen Bakterien oder aus den Kulturen verschiedener Bakterien, gewonnen oder sie liegen in Form von Polysacchariden vor, welche aus Fruchtkörpern von Basidiomycetes gewonnen werden oder aus kultivierten Funguskörpern derselben.

Die Erfinder haben die pharmakologische Wirksamkeit der überstehenden Flüssigkeit untersucht, welche erhalten wird bei der Kultivierung von Bakterien der Gattung Fusobacterium, und zwar nach Entfernung der Organismen von der Kulturbrühe. Es wurde festgestellt, daß eine spezifische Komponente in der überstehenden Flüssigkeit eine carcinostatische Wirkung entfaltet. Ferner wurde festgestellt, daß diese Komponente eine indirekte carcinostatische Wirkung zeitigt, und zwar durch Steigerung der Wirt-vermittelten Antitumoraktivitat oder der Immunität des Wirts. Somit wird die Wirkung der Immunität ausgenützt. Ferner wurde festgestellt, daß diese Komponente eine äußerst geringe Toxizität hat. Schließlich wurde festgestellt, daß diese Komponente durch Aufarbeitung der Kultur isoliert werden kann.

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Ziel der Erfindung:

Es ist Ziel der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, bei dem Bakterien der Gattung Fusobacterium kultiviert werden, und zwar unter anaeroben Bedingungen. Sodann isoliert man aus der erhaltenen Kultur oder aus der überstehenden Flüssigkeit Substanzen der Bezeichnung "TF-2" mit carcinostatischer und immunostimulierender Aktivität.

Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, die TF-2-Substanzen zu schaffen.

Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, ein carcinostatisches Mittel mit einem Gehalt der TF-2-Substanzen zu schaffen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Als Bakterien für die Gewinnung der TF-2-Substanzen der Erfindung kommen Bakterien der Gattung Fusobacterium in Frage, z.B. Fusobacterium nucleatum. Konkret wählt man am günstigsten Fusobacterium nucleatum TF-O31 (FERM 5077; ATCC 31647). Ferner eignen sich Stämme, welche aufgrund des allgemeinen Fachwissens der Mikrobiologie die gleichen Eigenschaften haben, nämlich spontane Mutanten und künstlich modifizierte Stämme.

Das Fusobacterium nucleatum TF-031 hat die folgenden bakteriologischen Eigenschaften: (I) Form

(1) Form der Zellen: spindelförmig (Fig. 1)

(2) Polymorphismus der Zellen: abwesend

(3) Motilität: abwesend

(4) Sporen: abwesend

(5) Gram-Färbung: gramnegativ

(6) Säurebeständigkeit: negativ

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(II) Wuchszustand im Kulturmedium

(1) TF-a Agarplatte und Schrägkulturmedien externe Form: runde Gestalt Größe: etwa 1 mm

Protuberanz: halbkugelföraiige Gestalt Struktur: tautropfenartig Oberfläche: glatt Kanten: glatt

Farbe: milchig gelblich-weiß Transparenz: opak

r~\ (2) TF-a Flüssigkulturmedium

Wachstumsgrad: heftig Turbidität: Koagulum Präzipitat: keines Oberflächenwachstum: keines; kein Wachstum bis zu

einer Tiefe von etwa 5 mm Gas: keines

(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Entwicklung von Schwefelwasserstoff: +

(2) Reduktion von Nitraten: -

(3) Produktion von Buttersäure: +

(4) Produktion von Indol: +

(5) Urease: -

( (6) Catalase: -

(7) Stärkehydrolyse: -

(8) Verhalten gegenüber Sauerstoff: anaerob

(9) Erzeugung von Ammoniak: +

(10) Erzeugung von Kohlendioxid: +

(11) Wachstumsbereich: pH 5,0 bis 8,5; 30° bis 45⁰C

(12) Produktion von Gas aus Sacchariden: L-Arabinose (-), D-Xylose (-), D-Glucose (-), D-Mannose. (-), D-Fructose (.-), D-Galactose (-), Malzzucker (-), Saccharose (-), Trehalose (-), Sorbit (-), Mannit (-), Inosit (-), Glycerin (-), Stärke (-)♦

Die neuen TF-2-Substanzen können z.B. auf folgende Weise hergestellt werden.

Kultur eines TF-2-Substanzen erzeugenden Bakterienstamms der Species Fusobacteriurn nucleatum

Kulturmasse oder überstehende Flüssigkeit

hydrophiles organisches Lösungsmittel lösliche Fraktion -4

Trennung

I Präzipitat

Fraktionierung nach dem pH-Wert

in der Nähe des pH 4 wasserunlösliche Fraktion

in der Nähe des pH 6 wasserunlösliche Fraktion

in der Nähe des pH 6 wasserlösliche,jedoch in der Nähe von pH 4 wasserunlösliche Fraktion ——-—

in der Nähe des pH 4 wasserlösliche, jedoch in der Nähe von pH 2 wasserunlösliche Fraktion — —

in der Nähe des pH 2 wasserlösliche Fraktion

TF-210

TF-220 +

TF_r23O

/TF-31O

TF-3OO

TF-240

I ⁺ TF-34O

TF-250

I₊

TF-350

TF-320

Deproteinisierung

TF-210 TF-220

TF-23O

TF-240 TF-250

cx> ο

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Das oben beschriebene Herstellungsverfahren soll im folgenden näher erläutert werden.

(1) Kultivierung des Bakterienstamms

Die Kultivierung des Bakterienstamms der Gattung Fusobacterium wird auf herkömmliche Weise, wie bei anaeroben Bakterien üblich, durchgeführt. Es wird ein Kulturmedium mit einem Gehalt einer Stickstoffquelle, wie Rinder-Hirn-Herz-Extrakt, verschiedene Peptone oder dergl., verwendet. Ferner enthält das Medium eine Vitaminquelle, wie Hefeextrakt oder dergl.; anorganische Salze, wie Natriumchlorid oder dergl.; eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Lactose oder dergl.; ein Reduktionsmittel, wie L-Cystin, Natriumsulfit, Thioglykolat oder dergl., und der pH-Wert wird auf 6 bis 8,5 und vorzugsweise auf 6,5 bis 7,5 eingestellt. Das Bakterium wird in das Kulturmedium eingeimpft. Danach erfolgt eine Fließgleichgewichtskultur unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42⁰C und vorzugsweise 32 bis 37⁰C während 1 bis 5 Tagen und vorzugsweise 24 bis 96 Stunden. Es ist insbesondere erwünscht, ein Kulturmedium gemäß Tabelle .1 zu verwenden. Dieses wird im folgenden als "TF-Kulturmedium" bezeichnet. Es ist jedoch nicht unbedingt ein Hirn-Herz-Infusionsmedium erforderlich (dabei handelt es sich um einen Rinder-Hirn-Herz-Extrakt) (als Kohlenstoff quelle) . Dieses Medium kann ersetzt werden durch ein Herzinfusionsmedium. Dabei handelt es sich um einen Rinderherzextrakt. Ferner kann man einen Rindfleischextrakt, einen Fischextrakt oder eine Maisquellflüssigkeit oder dergl. verwenden. Unter den verschiedenen Peptonen kommen Proteasepepton und Phytonpepton in Frage. Sie sind jedoch nicht stets erforderlich. Man kann das Trypticasepepton auch durch Polypepton ersetzen. Wenn kein Agar verwendet wird, so wird eine Rührkultur durchgeführt.

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Tabelle 1.

Bestandteile des KuI turmedi tuns (g/l)	TF-a	TF-b	TF-c	TF-d	TF-e	TF-f
Trypticasepepton	17	17	17	17	17	17
Phytonpepton	3	3		-	-	-
Proteosepepton	10	5	5	-	-	-
Hirn-Herz- Infusion	35	17,5	_,			_
Herzinfusion	-	-	25	20	10	15
Hefeextrakt	3	3	3	3	3	3
Natriumchlorid	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5
Glucose	6	6	6	12	12	12
Lactose	5	5	5	10	10	10
L-Cystin	0,25	0,5	0,5	-	-	-
Natriumsulfit	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Thioglykolat	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Agar	0 oder 0 od 0,7 0,7	. 0 od 0,7	. 0 od 0,7	. 0 od. 0,7	0 od. 0,7

(2) Abtrennung der überstehenden Flüssigkeit von der Kulturmasse (Entfernung der Organismen)

Die Organismen werden aus der erhaltenen Kultur entfernt, wobei die überstehende Flüssigkeit gewonnen wird. Zur Entfernung der Organismen eignen sich herkömmliche Methoden, z.B. Zentrifugierverfahren oder Fiiteryerfahren. Man kann dabei eine Filterhilfe verwenden, z.Ei/ Hyflo-Super-Cel. Das Zentrifugierverfahren ist bevorzugt vom Standpunkt der Arbeitsweise, der Gründlichkeit der Beseitigung der Organismen und der Ausbeute an überstehender Flüssigkeit.

(3) Gewinnung der carcinostatischen Substanz TF-2

(i)(a) Ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel wird der überstehenden Flüssigkeit oder der Kulturmasse zugesetzt und der Niederschlag wird abgetrennt. In dieser Stufe wird die überstehende Flüssigkeit oder die Kultur-

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masse vorzugsweise auf pH 1,5 "bis 7 eingestellt und bevorzugt auf einen pH in der Nähe von pH 2 (pH 1,5 "bis 2,5). Als hydrophile, organische Lösungsmittel kommen z.B. Alkohole in Frage, wie Äthanol, Methanol oder dergl.; Ketone, wie Aceton oder dergl., obwohl Alkohole und insbesondere Äthanol bevorzugt sind, da sie die besten Ergebnisse erbringen. Das hydrophile, organische Lösungsmittel wird vorzugsweise derart zugesetzt, daß seine Konzentration 30 bis 80 Vol-% und speziell 50 bis 80 Vol-# beträgt. Nach dem Zusatz des hydrophilen, organischen Lösungsmittels wird die erhaltene Mischung bei niedriger Temperatur stehengelassen, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 5°C, und zwar während mehrerer Stunden bis mehrerer Tage, bis zur beendeten Bildung des Präzipitats. Der gebildete Niederschlag wird mit herkömmlichen Verfahren abgetrennt, z.B. durch Dekantieren, Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl..

(b) Zu dem abgetrennten Niederschlag gibt man Wasser, und zwar im allgemeinen die 5- bis 2Ofache Menge des Niederschlags. Sodann wird der Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert. Dieses Verfahren wird im einzelnen wie folgt durchgeführt.

(b-1) Die Mischung des Niederschlags und des Wassers wird auf pH 7,5 bis 8 eingestellt. Falls erforderlich, werden unlösliche Bestandteile entfernt. Sodann wird die Mischung auf einen pH in der Nähe von pH 4 (3»5 bis 4,5) eingestellt. Die gebildeten, wasserunlöslichen und wasserlöslichen Bestandteile werden sodann voneinander getrennt, und zwar durch Verwendung herkömmlicher Verfahren, wie Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl.. Der wasserunlösliche Anteil (F-210) hat die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.

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(b-2) Sodann wird der in Stufe (a) erhaltene Niederschlag" gesondert mit Wasser versetzt, und zwar im allgemeinen mit der 5- bis 2Ofachen Menge des Niederschlags. Die Mischung wird auf pH 7,5 bis 8 eingestellt, Nachdem man erforderlichenfalls die unlöslichen Bestandteile entfernt hat, wird der pH in die Nähe von pH 6 gebracht (5,5 bis 6,5). Die erhaltenen, wasserunlöslichen und wasserlöslichen Bestandteile werden voneinander auf übliche Weise, z.B. durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl., getrennt. Der erhaltene, wasserlösliche Anteil (TF-220) hat die in Tabelle 2- angegebenen Eigenschaften.

(b-3) Der wasserlösliche Anteil der Stufe (b-2) wird auf einen pH in der Nähe von 4 (3,5 bis 4,5) gebracht. Der Niederschlag und der wasserlösliche Anteil werden voneinander auf übliche Weise durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl. getrennt. Der erhaltene Niederschlag (TF-230) hat die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften,

(b-4) Der in Stufe (b-1) oder (b-3) abgetrennte, wasserlösliche Anteil wird auf einen pH in der Nähe von pH 2 gebracht (1,5 bis 2,5), worauf ein Niederschlag gebildet wird. Dieser Niederschlag wird vom wasserlöslichen Anteil durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl. abgetrennt. Der erhaltene Niederschlag (TF-24O) hat die in. Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.

(b-5) Der in Stufe (a) erhaltene Niederschlag wird mit Wasser versetzt, und zwar mit der 5- bis 20fachen Wassermenge, bezogen auf die Menge an Niederschlag, worauf der pH der Mischung auf z.B. 7,5 bis 8 eingestellt wird. Dann wird der pH in die Nähe von pH 2 gebracht (1,5 bis 2,5). Zu dem so erhaltenen, wasserlöslichen Anteil oder zu dem in Stufe (b-4) abgetrennten, wasserlöslichen Anteil gibt man, falls erforderlich, nach dem Einengen der Menge des wasserlöslichen Anteils auf I/3 bis 1/7 ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zu, vorzugsweise einen Alkohol, so daß die Konzentration 20 bis 80 Vol-%

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und vorzugsweise 20 bis 60 Vol-% beträgt. Dabei wird ein Niederschlag gebildet, welcher mit TF-250 bezeichnet wird. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-250 hat die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.

Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220, TF-230, TF-240 und TF-250 können jeweils mehrmals der gleichen Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH-Wert unterzogen werden und auf diese Weise gereinigt werden. Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen können nach üblichen Verfahren in pharmazeutisch akzeptable Salze umgewandelt werden, z.B. in Alkalimetallsalze, wie Natriumsalze, Kaliumsalze und dergl., und in Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumsalze, Calciumsalze oder dergl..

(ii) Die Fraktionen mit carcinostatischer Aktivität, welche in Stufe (i) erhalten wurden, nämlich TF-210, TF-220, TF-230, TF-240 und TF-250, werden jeweils einer Deproteinisierungsbehandlung unterworfen. Diese erfolgt in üblicher Weise. Dabei erhält man die folgenden Substanzen: TF-300 (TF-31Q, TF-220 und TF-330), TF-340 und TF-350. Zur Deproteinisierungsbehandlung kann man bekannte Verfahren heranziehen, wobei Verfahren der Zersetzung mit proteoIytisehen Enzymen besonders bevorzugt sind. Wenn es erwünscht ist, die Deproteinisierung durch Behandlung mit einem proteolytischen Enzym durchzuführen, so reicht es aus, daß jede der Fraktionen mit carcinostatischer Aktivität der Stufe (i) in Wasser oder einer Pufferlösung aufgelöst oder suspendiert wird, worauf man ein Protein zersetzendes Enzym zur erhaltenen Lösung oder Suspension zusetzt und danach die Enzymbehandlung in üblicher Weise durchführt.

Als proteolytische Enzyme kann man z.B. Pronase, Papain, Trypsin,^Chymotrypsin oder dergl. verwenden. Pronase und

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Trypsin sind bevorzugt. Es ist insbesondere bevorzugt, vor oder während der EnzymbehandLung die wäßrige Lösung auf pH 7 bis 8 einzustellen und zu halten. Zu diesem Zweck kann man Natriumhydroxid» Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat oder dergl. verwenden. Zur Verhinderung einer Putrefaktion des Reaktionsgemisches während der Enzymbehandlung ist es erwünscht, eine geringe Menge eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, Toluol, oder dergl., zuzusetzen. Das Enzym wird gewöhnlich in einer Menge von 1 bis 2 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des der Enzymbehandlung zu unterwerfenden Pulvers (Festkörper), zugesetzt.

Die obige Enzymbehandlung erfolgt üblicherweise bei 30 bis 40⁰C innerhalb von 1 bis 72 Stunden und vorzugsweise 24 bis 48 Stunden. Sie kann auch durchgeführt werden, indem man zunächst z.B. etwa 1 Gew.% des Enzyms zum Pulver (Festkörper) gibt und sodann das Pulver (Festkörper) der Enzymbehandlung während 1 bis 24 Stunden aussetzt, worauf man nochmals etwa 1 Gew.% des Enzyms für zusätzliche Enzymbehandlung zugibt.

Nach der obigen Enzymbehandlung werden, falls erforderlich, unlösliche Bestandteile abzentrifugiert, filtriert oder dergl.. Sodann gewinnt man aus den wasserlöslichen Anteilen jeweils Fraktionen carcinostatischer Substanzen, nämlich TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350. Auf diese Weise gewinnt man TF-310 von TF-210; TF-. 320 von TF-220; TF-330 von TF-230; TF-340 von TF-240 und TF-350 von TF-250. Die Isolierung der Fraktionen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350 kann durchgeführt werden durch mindestens eine Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH-Wert sowie durch gesonderte Fällung mit einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, durch Fraktionierung mit einem Ionenaustauscher, durch Ultrafiltra-

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tion oder dergl.. Alternativ kann man auch eine oder mehrere dieser Operationen mehrmals wiederholen. Genau gesprochen werden die vorliegenden, carcinostatischen Substanzen, nämlich TF-300 (TF-31O, TF-320, TF-330), TF-34O und TF-350, erhalten durch Einstellen des pH-Wertes des obigen wasserlöslichen Anteils auf vorzugsweise einen pH von nicht mehr als 2,5, wobei man erforderlichenfalls Trichloressigsäure zusetzt. Dann wird der erhaltene Niederschlag abgetrennt. Nun gibt man zum löslichen Anteil ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel, wie Alkohol, so daß seine Konzentration 30 bis 80 Vol-% und vorzugsweise 60 bis 80 Vol-% beträgt. Dann wird der gebildete Niederschlag abgetrennt. Es handelt sich dabei um die Fraktion der angestrebten Verbindung. Nachfolgend kann, falls erforderlich, dieser Niederschlag mit einem starken Anionenaustauscherharz behandelt werden, z.B. mit Dowex 1 oder Amberlite IRA-400. Diese Behandlung kann mehrmals durchgeführt werden. Auf diese Weise isoliert man die nichtadsorbierten Fraktionen, und diese werden, falls erforderlich, einer Ultrafiltration unterworfen. Hierzu verwendet man z.B. ein Toyo Ultrafilter UK-50 mit einem nominellen Molekulargewichtsabbruch von 50 000 oder ein Toyo Ultrafilter UK-200 mit einem nominellen Molekulargewichtsabbruch von 200 000. Sodann werden die Substanzen weiteren Behandlungen unterzogen, wie einer Einengung, Entsalzung oder Aussalzung, Trocknung oder Ausfällung mit Hilfe eines hydrophilen, organischen Lösungsmittels oder dergl.. Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-33O)> TF-340 und TF-350 haben die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.

Die carcinostatischen Substanzen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350 können in pharmazeutisch akzeptable Salze umgewandelt, und zwar nach herkömmlichen

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Verfahren. Man kann z.B. Alkalimetallsalze, wie Natriumsalze oder Kaliumsalze, und Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumsalze, Calciumsalze oder dergl.,verwenden. Diese Salze sind pharmazeutisch akzeptabel.

Fraktion

Tabelle Eigens chaften

Aussehen

PharmakoIogis ehe Wirkung Löslichkeit

TF-21G	grauweißes bis hellbraunes Pulver
TF-220	η
TF-23Ö
TF-240
TF-250	n
TF-300	Il
TF-310	Il
TF-320	Il

Il

diese Fraktion inhibiert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen; es hat eine immunostimulierende Wirkung

Il H Il

Il Il

diese Fraktion inhibiert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor und Sarcoma 180 bei Mäusen; sie hat eine immunostimulierende Wirkung

diese Fraktion inhibiert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor bei Mäusen; sie hat eine immunostimulierende Wirkung

unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton» Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthylather

Il

löslich in Wasser; unlöslich in Methanol, Äthanol_A Aceton, Benzol, Chloroform, Athylacetat und Diäthyläther

Il

it η

CD

Fraktion

Tabelle 2 (Fortsetzung) Eigenschaften

Zersetzungspunkt

IR-Absorptionsspektrum (KBr-Methode);Absorptionsbanden in der Nähe von

Elementaranalyse

TF-210

TF-220 TF-23O TF-24O TF-25O TF-300

TF-310 TF-32O TF-330

diese Fraktion zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 160 bis 235⁰C

diese Fraktion zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 160-240 C

diese Fraktion zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 185-225 C

diese Fraktion zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 200-215 C

diese Fraktion zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 165-21O⁰C

diese Fraktion beginnt sich bei etwa 180⁰C und stark bei über 195⁰C zu zersetzen

ti Il

3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 und 1120-1020

Il Il

40-43 5-7

40-42

3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1520, 1410-1360, 1280-1210, 1060, 960 und 820

3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1410-1380, 1240-1210, 1150-1120, 1080-1020, 980 und

3500-3300, 2920, 2850,1660-1620, 1580-1540, 1460-1400, 1380-1360, 1120, 1080-1020, 970 und 820-800

5-7

9-10

7-9

42-45	5-7	10-11	3-5
35-38	4-5	12-14 ι	1-4
		_i VJl	1-4
30-33	3-5	1-4
38-47	5-7	1-4
38-47	5-7
38-47	5-7
38-47	5-7

4P C C

Tabelle 2 (Fortsetzung)

TF-340 diese Fraktion beginnt sich 3500-3300, 2920, 2850,1660-1640, 32-34 4-6 3-5

bei etwa 14O°C und stark bei 1580-1520, 1460-1440, 1410-1340,

über 200⁰C zu zersetzen 1250-1220, 1120-1030, 970 und 835

TF-350 diese Fraktion beginnt sich 3500-3300, 2920-2900, 1660-1630, 34-37 5-6 1-2

bei etwa 110°C und stark bei 1580-1520, 1460-1340, 1140-1100,

über 180°C zu zersetzen 1080-1020, 970 und 820-800

Tabelle 2 (Fortsetzung) Fraktion . Eigenschaften

Farbreaktionen

Ninhyürin- Moliscn- Fhenol-H2S04- Anthron-H2SO4- Indol-HCl- Lowry-Folin-Reaktion Reaktion Reaktion Reaktion Reaktion Reaktion

TF-210 . + · + ' + + +

TF-22Q + + + . + +

TF-23O + + + -i

TF-240 ..' '+ + + H

TF-250 + + + ^H

TF-3OO - : .'+ + + H

TF-31O - . ' +'+ + η

TF-320 - +. + + H

TF-330 - +..' ' + + H

ί,

TF-340 - + + ' + η

TF-350 - + + + ' ' H

Γ".

Fraktion

Tabelle 2 (Fortsetzung) Eigenschaften

UV-AbsorptionsSpektrum C Lösung bei pH 7,0); λ. _max an der Absorptionskante und in der Nähe von (nm)

Säccharidgehalx als Gluco- Proteingehalt als Rinderse,gemessen nach dem Phe- serumalbumin, gemessen nach no 1-H₂SO^-Verfahr en (%) dem Lowry-Folin-Verfahren(90

TF-210	248-265
TF-220	248-266
TF-230	249-264
TF-240	250-265
TF-250	248-269
TF-300	246-280
TF-310	Il
TF-320	It
TF-330	Il
TF-340	250-265
TF-350	245-264

ca.5 -	ca.	25	ca.	20 -	ca.	50	I
ca.5 -	ca.	20	VtI	ca.	10		—1 co
ca.5 -	ca.	25	ca.	30 -	ca.	60	I
ca.15	- ca	. 35	ca.	20 -	ca.	30
ca.60	- ca	. 80	ca.	5 -	ca.	20
ca.16	- ca	. 60	VII	ca.	10
	Il			Il
	Il			Il
	Il			ti
ca.20	- ca	.50		It
ca.80	- ca	. 95		1»

Die^Messung wurde an wasserlöslichen Fraktionen durchgeführt.

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Die pharmakologischen Aktivitäten der erfindungsgemäßen carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-3OO (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350 werden im folgenden erläutert. Bei den nachfolgenden pharmakologischen Tests wird die Testsubstanz TF-210 des Beispiels 1 eingesetzt sowie die Testsubstanz TF-220 des Beispiels 3, TF-230 des Beispiels 5, TF-240 des Beispiels 7, TF-250 des Beispiels 9, TF-310-1 des Beispiels 11(1), TF-310-2 des Beispiels 18, TF-320 des Beispiels 12, TF-330 des Beispiels 13, TF-340 des Beispiels 19, TF-350 des Beispiels 24"und TF-3OO der Beispiele 11 bis 18.

(1) Immunostimulierende Wirkung

Drei Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) werden in jeder Gruppe verwendet. Jede der Testsubstanzen wird in einer physiologischen Salzlösung aufgelöst und 0,2 ml einer jeden Lösung werden intraperitoneal verabreicht. 24 h nach der Verabreichung werden in den Schwanz der Maus 0,2 ml einer Kohlenstoffsuspension intravenös injiziert. Diese wird bereitet durch Vermischen von 1 ml Pelikan Zeichentusche Nr. 17, schwarz (Günther Wagner GmbH.) mit 2 ml einer physiologischen Salzlösung, enthaltend 3 Gew.% Gelatine. 1, 5, 10 und 15 min nach der Injektion werden *) 0,02 ml Blut gewonnen, wobei man eine Haematokritkapillare verwendet, die mit Heparin beschichtet ist. Das Blut wird sofort verdünnt und haemolysiert, und zwar mit 1,6 ml einer 0,1 Gew.% wäßrigen Natriumcarbonatlösung. Diese Lösung wird colorimetriert, und zwar bei 675 mn. Der Phagocytose-Index (K-Wert) wird aus der Gleichung von Halpern et al. ermittelt. Die Mäuse der Blindgruppe erhalten 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung. .*) aus der Orbita

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Tr _

log C_Q - loc C

C bezeichnet den Kohlenstoffpulvergehalt im Blut zum Zeitpunkt t ; C bezeichnet den Kohlenstoffpulvergehalt im Blut zum Zeitpunkt t. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 bis 5 aufgeführt.

Tabelle 5 Substanz

Dosis (mg/kg)

Durchs chni ttli eher K-Wert

TF-21O TF-220 TF-23O TF-24O TF-250

TF-310-1

TF-320 TF-330 Vergleich

1,5 3

5 10

5 10

5 10

0,1155 0,1198

+ 0,0273 + 0,0231

0,1087 + 0,0346 0,1292 + 0,0289

0,1028 0,1194

0,1109 0,1127

0,0865 0,1120

+ 0,0175 + 0,0334

+ 0,0250 +. 0,0496

+ 0,0131 + 0,0329

Vergleich	—	0,0348 + 0,0037	4
	Tabelle	Durchschnittlicher K-Wert .;
Substanz	Dosis (mg /kg)

0,1

0,1

0,1 1

0,0580 0,0776

0,0468 0,0715

0,0601 0,0965

0,0295

+ 0,0088 + 0,0168

+ 0,0123 + 0,0040

+ 0,0098 + 0,0102

+ 0,0007

Der Test wurde an einer aus vier Mäusen bestehenden Gruppe durchgeführt.

- 21 Tabelle 5

2374 80 0

Substanz Dosis Durchschnittlicher (mg/kg) K-Wert

TF-34O⁺ 5 0,1292 + 0,0229

10 0,1001 + 0,0295

TF-350 5 0,0817 + 0,0002

10 0,1453 + 0,0229

Vergleich - 0,0408 + 0,0016

Der Test wurde an einer aus vier Mäusen bestehenden Gruppe durchgeführt.

(2) Carclnostatische Wirkung

Antitumorwirkung gegen Ehrlich Ascites-Tumor

Ehrlich's Ascites-Tumorzellen werden intraperitoneal in Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 1 χ 10 Zellen/Maus eingeimpft. Nachfolgend wird jeweils die Testsubstanz, aufgelöst in einer physiologischen Salzlösung, in einer Menge von 0,2 ml intraperitoneal an die Mäuse verabreicht, und zwar einmal pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden Tagen vom ersten Tag nach der Einimpfung der Tumorzellen ab. Der Vergleichsgruppe gibt man 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, und zwar in gleicher Weise. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6 und 7 zusammengestellt.

Überlebenstage der Mäuse bei Verab- _ reichung der Testsubstänz _χ

Überlebenstage der Mäuse der Vergleichsgruppe.

Sub- Dosis (mg/kg x stanz Anzahl der Verabreichungen)

Durchschnittliche Überlebenstage (Tag:)

Tabelle 6

T/C Anteil der über- Anteil der voll- (%) lebenden Tiere ständigen Heilung nach 30 Tagen

TP-21O	0.7x7 3.5 x 7	>27.2 ±5.7 >26.8 ±4.9	>159	8/10 7/10	7/10 6/10
TF-220	0.3 χ 7 1.5 χ 7	>22.8 ±6.1 >29.1 ±2.3	>135 >173	COCO OJ C-	1/8 5/8
TP-230	1x7 5x7	>29.9 ± 0.3 >28.3 ± 4.6	>177 >168	COCO C-C-	CO CO C-C-
TP-240	1x7 5x7	>23.2 ± 5.6 >24.5 ± 7.5	>138 >146	COCO min	2/8 5/8
ΤΡ-250	/ 1x7 5x7	>20.3 ±6.4 >26.6 ± 5.5	>158	2/8 5/8	2/8 5/8
VergXi	- . - ·	16.8 ± 2.6	100	0/8	0/8

Substanz Dosis (mg/kg χ Anzahl der Ver abreichungen)

Tabelle 7

Durchschnittliche Überlebenstage (Tag)

T/C Anteil der (%) überleb.Tiere

Anteil der vollständigen Heilung

TF-310-1	0.1x7 1x7	>27.9 ± 4.5 >28.6 ± 2.3	>166 >170	4/8 6/8	4/8 6/8
TF-320	0.5 x 7 1 χ 7	>29.0 ± 2.6 >28.1 ± 4.9	>172 >167	7/8 7/8	COOO C-C-
TP-330	0.5 χ 7 1 χ 7	>29.8 ±0.6 >29.6 ± 0.9	C-VO c—c— r-f H Λ Λ	7/8 7/8	ODOD
TP-340	1x7 5x7	>28.3 ± 4.5 >24.0 ± 9.4	>168 >143	COCO c—in	CO OO LnLn
TP-350	1x7 5x7	19.6 ± 4.1 >30.0 ± 0.0	117 >17-9	0/8 8/8	0/8 8/8
Vergleich		16.8 ± 2.3	100	0/8	0/8

237 480 0

(ii) Antitumorwirkung gegen Sarcoma-180-Zellen

(a) Sarcoma 180-Zellen werden intraperitoneal transplantiert, und zwar in Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6-Wochen alt) in einer Menge von 1 χ 1Ο·³ Zellen/Maus. Nachfolgend wird eine jede der Testsubstanzen in einer physiologischen Salzlösung aufgelöst, und 0,2 ml einer jeden der erhaltenen Lösungen werden intraperitoneal verabreicht, und zwar einmal pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantation der Sarcoma-Zellen. Einer Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung in gleicher Weise verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellte

Substanz

Dosis (mg/kg χ Anzahl der Verabreichungen)

Tabelle 8

Durchschnittliche T/C Überlebenstage (%) (Tag)

Anteil der Anteil der vollüberleb. Tiere ständigen Heilung nach 30 Tagen

TF-210	3.5 x 7 7 x 7	>27.2 ±5.6 >30.0 ± 0.0	>183 >203	4/5 5/5	4/5 5/5
TF-220	0.3 x 7 1.5 x 7 ί	>26.3 ± 6.0 >30.0 ±0.0	>177 >203	Ul K) Ul Ul	Ul K) Ul Ul
TF-230	1x7 ; 5x7	>29.2 ± 1.6 >24.8 ± 9.9	>197 >168	U) J=" UlUl	4/5 2/5
TF-240	1x7 5 χ 7	>21.4 ± 7.3 >30.0 ±0.0	ν ν K) H O J=- U)UI	2/5 5/5	1/5 5/5
TF-25O	l χ 7 5x7	>29.0 ±2.0 >28.4 ± 3.2	>196 >192	4/5 4/5	KJ J=" UlUl
Vergleich	-	14.8 ± 2.3	100	0/5	0/5

_₂₆_ 237480 0

(b) Sarcoma 180-Zellen werden subkutan transplantiert, und zwar in die Achselhöhle von Mäusen des ICR-Stamms (weiblich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 1 χ 10 Zellen/Maus. Nachfolgend wird dne jede der Testsubstanzen, aufgelöst in einer physiologischen Salzlösung oder in einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung, verabreicht. Esverden jeweils 0,2 ml der erhaltenen Lösung intravenös (iv) oder intramuskulär (im) injiziert, und zwar einmal pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantation der Sarcoma-Zellen. Die Vergleichsgruppe erhält 0,2 ml einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder einer physiologischen Salzlösung, und zwar in gleicher Weise. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8-(2) zusammengestellt.

	Dosis(mg/kgx	Anz.d. Verabreich	iv	0.1x7	Flüssigkeit für	Tabelle 8-(2)	T/C (%)
Sub- \	stanz Route	im	0.1 χ 7	die Auflösung .) der Substanz	Tumorgewicht (g)
	TP-310-1	-	- -	Physiologische Salzlösung .		20
		iv	0.1 χ 7	... Il	0.29 ±0.15 :	60
	!Vergleich	im	0.1x7	•ι	0.86 ± 0.10	100
		0.1 χ 7	Il	1.45 ± 0.31	31
Γπτη QOfY	iv	0 .1 x 7	Il	1.54 ± 0.77	71
ir —idu	im		5%igewäßrige Glucoselösung	3-50 ± 0.45	34
		0.001x7	ι·	I.67 ± 0.58	48
Vergleich		0.005x7	.-,' ι·	2t38 ±0.42	1OQ
		0.01 x7	Il	4.94 ± 2.42	51
! - =-; ;."	iv	0.05 x7	Il	2.67 ± 0.20	46
TP-310-2		0.1 χ 7	Il	2.39 ± 0.56	44
		'-'	Il	2.33 ± 0.26	25
			It	1.31 ±0.26	20
Vergl.		' Il	1.05 ± 0.21	100
	5.24 ± 0.49

TP-310-2	im	0.1 χ 7	5%ige wäßrige Glucoselösung	1.68 ± 0.30	36
Vergleicl·	-	Il	4.68 ± 0.57	100

Die obigen Daten für TF-310-1 zeigen die Ergebnisse am 7. Tag nach der Transplantation der Sarcoma 180-Zellen. Die Daten für TF-J52O und TF-310-2 zeigen die Ergebnisse am 14. Tag nach der Transplantation der Sarcoma 180-Zellen.

237480 0

(iil) Antitumorwirkung gegenüber Ehrlich¹s solidem Tumor

Ehrlich Tumorzellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des ICR-Stamms (weiblich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 4 χ 10 Zellen/Maus transplantiert. Nachfolgend werden die jeweiligen Testsubstanzen in einer physiologischen Salzlösung oder einer 5#igen wäßrigen Glucoselösung aufgelöst. 0,2 ml einer jeden der Lösungen werden intraperitoneal den Mäusen verabreicht, und zwar einmal pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantation der Tumorzellen, oder einmal an jedem zweiten Tag an insgesamt 10 Tagen, beginnend am 8. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen. Der Vergleichsgruppe werden auf gleiche Weise 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung oder einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung verabreicht. Das Gewicht eines jeden Tumors wird ermittelt. Die Ermittlung des Tumorgewichts erfolgt durch Messen des großen Durchmessers (a mm) und des kleinen Durchmessers (b mm) mittels einer Schiebelehre. Die Werte werden für a..und b in der folgenden Gleichung eingesetzt:

2 Gewicht des Tumors = (^g)

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 9-(1) und 9-(2) aufgeführt.

Substanz Dosis (mg/kg χ Anzahl der Verabreichungen)

Tabelle 9-(D Verabreichungstag .

TF-210	3,5 7	X X	7 7
TF-220	3 6	X X	7 7
TF-230	10 20	X X	IStS
TF-240	10 20	X X	7 7
TF-250	10 20	X X	7 7

Vergleich

Tag 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7

Tag 14

Tumorgewicht(g j

1,96 + 0,7 2,62 + 1,9

T/C (96)

29 38

4,30 2,89	+ 2,1 + 1,2	62 42	I
2,63 2,04	+ 1,22 + 0,66	38 29	O I
4,07 4,02	+ 0,75 ± 1,66	59 59
3,10 3,19	+ 1,01 I 1,26	46 47
6,82	+ 1,14	100

Tabelle 9-(2)

Substanz	Dosis (mg/kg χ Anzahl	Verabreichungstag	Tag 15	J + 2,01 ) + 2,03	T/C (%)
	der Verabreichungen)		Tumorgewicht (g)		55 100
TF-310-1 Vergleich	1 χ 5	Tag 8, 10, 12, 14, 16	4,7* 8,7<

Bemerkungen: TF-2.10 bis TF-250 werden nach Auflösen in physiologischer Salzlösung

verwendet. TF-310-1 wird in einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung aufgelöst,

Es ist der Tag angegeben, an dem das Gewicht des Tumors gemessen wird.

_₃₂_ 237480 0

(iv) Antitumoraktivität gegen B-16 Melanom-Zellen

(a) B-16 Melanom-Zellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des BDF _Λ -Stamms (männlich, 7 Wochen alt) in einer Menge von 1 χ 10 Zellen/Maus transplantiert. Nachfolgend wird die jeweilige Testsubstanz in physiologischer Salzlösung aufgelöst und jeweils 0,2 ml der jeweiligen Lösung werden intraperitoneal verabreicht, und zwar einmal am Tag während sieben aufeinanderfolgender Tage, beginnend mit dem ersten Tag .nach der Transplantation der Tumorzellen. Die Vergleichsgruppe erhält in gleicher Weise 0,2 ml physiologische Salzlösung. Die Tumorgewichte werden am 17. oder 23. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen ermittelt. Die Bestimmungsmethode ist die gleiche wie im Testverfahren (iii). Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 aufgeführt.

	7	(mg/kg χ An- .Verabreich.	Tabelle 10	T/C (90
	,5 3	x 7	Durchs chni ttIi ehe s ) Tumorgewicht (g)	64
Sub- Dosis stanz zahl d	'5 10	x 7 x 7	3,07 + 0,7	82 77
TF-210	5 10	χ 7 χ 7	3,92 + 2,29 3,69 + 0,81	67 77
TF-220 1	5 10	χ 7 χ 7	3,21 + 0,64 3,71 + 1,08	79 84
TF-230		χ 7 x 7	3,78 + 1,26 4,00 + 1,36	62 58
TF-240	3	-	2,97 + 0,73 2,75 + 0,67	100
TF-250		x 7	4,76 ±0,68	63
Vergleich		-	2,53 + 1,61	100
TF-310-1	4,00 + 0,85
Vergleich

Bemerkungen: Durchschnittliche Tumorgewichte für TF-210 bis TF-250 werden am 17.Tag nach der Transplantation der Tumorzellen bestimmt. Durchschnittliche Tumorgewichte für TF-310-1 werden am 23. Tag nach der Transplantation der Tumorzeilen bestimmt.

237480

(b) B-16 Melanom-Zellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des BDF-}-Stamms (männlich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 1 χ 10° Zellen/Maus transplantsert. Nachfolgend wird die Testsubstanz in einer 5$igen wäßrigen Glucoselösung aufgelöst. 0,2 ml der gebildeten Lösung werden verabreicht, und zwar gleichzeitig intratumorös und intraperitoneal, und zwar einmal an jedem zweiten Tag an insgesamt 12 Tagen, beginnend mit dem 13. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen. Die Vergleichsgruppe erhält jeweils 0,2 ml einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung auf gleiche Weise. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10-(2) aufgeführt.

Tabelle 10-(2)

Sub- Dosis (mg/kg χ An- Route Tumorgewicht T/C stanz zahl d.Verabreich.) (g) (^Q

TF-310- 1,0 χ 6 ) 2,92+0,23 50

2 5,0 χ 6 } it 4,08 + 0,72 70

10,0 χ 6 ) 3,26 + 0,26 56 0,5 x 6 ) it 4,31 + 0,24 74 1,0 χ 6 ) + 1,92 +0,38 · 33

Vergleich - ) ^xp 5,83+0,80 100 Das Tumorgewicht wird am 23. Tag bestimmt.

(3) Akute ' Toxizität

LDcQ-Werte werden bei Mäusen (ICR-Stamm, weiblich, 6 Wochen alt, intravenöse Verabreichung) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengestellt.

237480 0

Substanz

TF-210 TF-22Q TF-230 TF-240 TF-250 TF-3OO TF-340 . TF-350 .

Tabelle 12	100
LD50 (mg/kg)	200
über	100
Il	200
It	200
Il	10
It	200
Il	200
It
Il

Man erkennt aus den obigen pharmakolog!sehen Experimenten, daß die TF-2-Substanzen der_ Erfindung__brauchbare carcinostatische Mittel sind. Es kann eine Wirksamkeit gegen verschiedenste Krebserkrankungen erwartet werden. Insbesondere kann eine beträchtliche Wirksamkeit gegen solide Tumoren erwartet werden. Alle TF-2-Substanzen der Erfindung zeigen ausgezeichnete Effekte.

Die TF-2-Substanzen der Erfindung können zu verschiedensten pharmazeutischen Darreichungsformen verarbeitet werden. Insbesondere können orale Mittel hergestellt werden ζ"_; oder Injektionsmittel oder Suppositorien oder dergl.. Bevorzugt sind Inaektionsmittel. Im Falle oraler Mittel können diese verschiedene Hilfsstoffe enthalten und in Form vin Kapseln, Tabletten, Pulvern oder Granulat vorliegen. Im Falle von Injektionsmitteln können diese für subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion und intravenöse Injektion vorgesehen sein. Es kann sich dabei um Suspensionen oder Lösungen handeln oder um Pulver, welche vor Gebrauch in einer Salzlösung oder einer Glucose oder ein Lokalanaesthetikum enthaltenden Lösung aufgelöst werden. Die Dosis der TF-2-Substanzen (TF-210, 220, 230, 240, 250, 300 [310, 320, 330], 340 und 350) kann je nach dem Zustand des Patienten ausgewählt werden. Es ist jedoch im

237480 0

allgemeinen erwünscht, einem Erwachsenen 0,005 "bis 50 mg/kg.einmal oder mehrmals am Tag zu verabreichen. Was die Verabreichungsmethode anbelangt, so ist die subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder die Injektion in den erkrankten Bereich bevorzugt.

Ausführungsbeispiele:

Im folgenden wird die Erfindung im einzelnen anhand von Beispielen und Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 eine mikroskopische Photographic der Form des Fusobacterium nucleatum TF-031;

Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-210 des Beispiels 1;

Fig. 3 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. k ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-220 des Beispiels 3;

Fig. 5 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 6 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-230 des Beispiels 5;

Fig. 7 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 8 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 7;

Fig. 9 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig.10 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 9;

Fig.11 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig.12 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-310 des Beispiels 11;

Fig.13 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

237480 0

Fig. 14 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz;

Fig. 15 ein Infrarot-Absorptionsspektrum, der carcinostatischen Substanz TF-32O des Beispiels 12 j

Fig, 16 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 17 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz; .

Fig. 18 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-330 gemäß Beispiel 135

Fig. 19 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 20 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz; -

Fig. 21 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-330 (gereinigt) des Beispiels

13;

Fig. 22 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 23 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-310 (gereinigt) des Beispiels 18;

Fig. 24 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 25 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz;

Fig. 26 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-340 des Beispiels 19;

Fig. 27 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 28 ein Hochleistungs-FlUssigchromatogramm dieser Substanz;

Fig. 29 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-350 des Beispiels 24;

237480 0

Fig. 30 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 31 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz.

Beispiel 1

(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß (Marubishi Rika Kenkyusho) gibt man 8 1 TF-e Kulturmedium, enthaltend 17 g Trypticasepepton, 10 g.Herzinfusion, 3 g Hefeextrakt, 7,5 g Natriumchlorid, 12 g Glucose, 10 g Lactose, 0,1 g Natriumsulfit und 0,5 g Natriumthioglykolat, und zwar pro Liter destilliertes Wasser. Das Kulturmedium wird 30 min bei 120⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wird Stickstoffgas während einer Stunde mit einem Durchsatz von 100 ml/min hindurchgeleitet. Nun wird das Kulturmedium mit 1 1 einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) geimpft, das zuvor hergestellt wurde durch Kultivierung in einem TF-e Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung. Die Zellen v/erden 3 Tage bei 37⁰C unter Rühren (30 U/min) kultiviert, wobei Stickstoffgas mit 65 ml/min hindurchgeleitet wird. Nach der Kultivierung wird die Kultur mit 160 g Celite und 80 g Cellulosepulver versetzt und die Mischung wird gerührt und unter vermindertem Druck abfiltriert. Man erhält 7,8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit der Kultur.

(2) Zu 7,8 1 der überstehenden Flüssigkeit gibt man 117 ml konz.Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Sodann gibt man 11,7 1 Äthanol hinzu, wobei eine öO^ige wäßrige Äthanollösung erhält. Diese wird sodann während 24 h bei 4°C stehengelassen. Nachfolgend wird die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und der verbleibende Anteil wird zentrifugiert (6 χ 10·^ U/min; 5 min), und zwar bei 4⁰C. Dabei wird der Niederschlag gewonnen. Das Präzi-

237480 0

pitat wird mit 400 ml einer 60^igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0 gewaschen sowie mit 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther in dieser Reihenfolge. Dann wird der Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 3,9 g eines Pulvers.

(3) Das Pulver der Stufe (2) wird in 25 ml Wasser suspendiert. Der pH-Wert der erhaltenen Suspension wird durch Zugabe von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt, und danach wird 30 min bei Zimmertemperatur gerührt und 1N Salzsäure wird zugegeben, um den pH auf 4,0 einzustellen. Sodann wird unter Eiskühlung während 2 h gerührt, und die Mischung wird mit 1 χ 10 U/min während 10 min zentrifugiert, um den Niederschlag von der

überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 10 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen und sodann wird der Niederschlag von der Waschflüssigkeit durch Zentrifugieren (1 χ 10 U/min; 10 min) abgetrennt. Die Waschflüssigkeit und die oben erwähnte überstehende Flüssigkeit werden kombiniert und der Behandlung gemäß Beispiel 9 unterworfen. Der Niederschlag wird mit 10 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,5 g der carcinostatischen Substanz TF-210. Die so erhaltene carcinostatische Substanz TF-210 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das Infrarot(IR)-Absorptionsspektrum und das Ultraviolett(UV)-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 2 bzw. 3 dargestellt.

Beispiel 2

(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß gibt man 8 1 eines TF-d Kulturmediums, enthaltend 17 g Trypticasepepton, 20 g Herzinfusion, 3 g Hefeextrakt, 7,5 g Natriumchlorid, 12 g Glucose, 10 g Lactose, 0,1 g Natriumsulfit und 0,5 g Natriumthioglykolat/1 1 destilliertes Wasser. Das Kulturmedium wird 30 min bei 120⁰C sterilisiert und nach dem Ab-

237480 0

kühlen wird Stickstoffgas während 1 h mit 100 ml/min durchgeleitet. In dieses Kulturmedium gibt man 1 1 einer Vorkultur lösung von Fusobacterium .nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647), welche zuvor bereitet wurde durch Kultivieren in einem TF-d Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung. Die Zellen werden 3 Tage bei 37°C unter Rühren mit 30 U/min kultiviert, wobei Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 65 ml/min hindurchgeleitet wird. Nach der Kultivierung wird der Ansatz mit 160 g CeIite und 80 g Cellulosepulver versetzt und das erhaltene Gemisch wird gerührt und filtriert (unter vermindertem Druck), wobei man 7,8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit erhält.

(2) Zu 7,8 1 der überstehenden Flüssigkeit gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Sodann gibt man 11,7 1 Äthanol zu der überstehenden Flüssigkeit, wobei eine 60%ige wäßrige Äthanollösung erhalten wird. Diese läßt man 24 h bei 4⁰C stehen. Nachfolgend wird die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und die Restmenge wird zentrifugiert (6 χ 10^ U/min; 5 min) bei 4⁰C, wobei der Niederschlag erhalten wird. Dieser wird mit 400 ml einer 60^igen wäßrigen Äthanollösung \^rom pH 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthylather in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 4,5 g eines Pulvers.

(3) Das Pulver wird der gleichen Behandlung wie in Beispiel 1(3) unterworfen, wobei man 1,6 g der carcinostatischen Substanz TF-210 erhält. Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-210 hat die in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften. Das IR-AbsorptionsSpektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind mit denjenigen des Beispiels 1 identisch.

- 237480 0

Bei spiel

(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß gibt man 8 1 eines TF-e Kulturmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1. Das Kulturmedium wird 30 min bei 120⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wird Stickstoff gas hindurchgeleitet, und zwar während 1 h mit einem Durchsatz von 100 ml/min. In dieses Kulturmedium gibt man nun 1 1 einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatura TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647), welche zuvor durch Kultivieren in TF-e Kulturmedium bereitet wurde. Die Zellen werden 5 Tage bei 37°C unter Rühren (30 U/min) kultiviert, und zwar unter Einleiten von Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 65 ml/min. Nach beendeter Kultivierung wird das Kulturmedium mit 160 g CeIite und 80 g Cellulosepulver versetzt und das erhaltene Gemisch wird gerührt und unter vermindertem Druck filtriert. Man erhält 7,8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit.

(2) Zu 7*8 1 der überstehenden Flüssigkeit der Stufe (1) gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH der überstehenden Flüssigkeit auf 2,0 einzustellen. Sodann werden 11,7 1 Äthanol zur überstehenden Flüssigkeit gegeben, wobei man eine 60%ige wäßrige Äthanollösung erhält. Diese läßt man nun während 24 h bei 4⁰C stehen. Sodann wird die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und die Restmenge wird bei 4⁰C zentrifugiert (6 χ 10^ U/min; 5 min); der dabei erhaltene Niederschlag wird mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthylather in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 4,9 g eines Pulvers erhält.

(3) Das Pulver der Stufe (2) wird in 49 ml Wasser suspendiert. Der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz von 1N wäßriger Nätriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,0 ein-

23 74 80 0

gestellt und 30 min bei Zimmertemperatur gerührt, worauf der pH der Suspension mit 1N Salzsäure auf 6,0 eingestellt wird. Nachfolgend wird die Suspension 2 h unter Eiskühlung gerührt5 worauf das Gemisch abzentrifugiert wird (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Das Präzipitat wird mit 5 ml Wasser vom pH 6,0 gewaschen. Nun wird der Niederschlag von der Waschflüssigkeit abzentrifugiert, und zwar während 10 min bei 1x10 U/min, und mit 10 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,8 g der carcinostatischen Substanz TF-220· Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-220 hat die Eigen-? schäften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 4 bzw. 5 gezeigt.

B eispiel 4

(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß gibt man 8 1 TF-d Kulturmedium der Zusammensetzung des Beispiels 2. Das Kulturmedium wird 30 min bei 120⁰C sterilisiert. Nach dein Abkühlen wird Stickstoffgas während 1 h mit 100 ml/min hindurchgeleitet. In dieses Kulturmedium gibt man 11 der Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647), welche zuvor im TF-d Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung bereitet wurde. Die Zellen werden 5 Tage bei 37⁰C unter Rühren (30 U/min) kultiviert, wobei Stickstoffgas mit 65 ml/min hindurchgeleitet wird. Nach der Kultivierung wird die Kulturlösung mit. 160 g Celite und 80 g Cellulosepulver versetzt und das erhaltene Gemisch wird gerührt und unter vermindertem Druck abfiltriert. Man erhält 7,8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit.

(2) Zu 7,8 1 der überstehenden Flüssigkeit gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Dann werden 11,7 1 Äthanol zugegeben, wobei die überste-

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hende Flüssigkeit zu einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung wird. Diese läßt man nun 24 h bei 4°C stehen. Nachfolgend wird ein Lösungsanteil durch Abdekantieren entfernt und der restliche Anteil wird bei 4⁰C zentrifugiert, und zwar 5 min bei 6 χ 1O^ U/min. Hierdurch wird der Niederschlag gewonnen. Er wird mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 5,07 g eines Pulvers.

(3) Das erhaltene Pulver wird gemäß Beispiel 3(3) behandelt, wobei man 1,9 g eier carcinostatischen Substanz TF-220 erhält. Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-220 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-AbsorptionsSpektrum und das ÜV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen identisch mit denjenigen des Beispiels 3·

Beispiel 5

(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß gibt man 8 1 TF-e Kulturmedium der Zusammensetzung des Beispiels 1. Dieses wird 30 min bei 120⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums läßt man Stickstoffgas während 1 h mit 100 ml/min hindurchperlen. Nun wird mit 1 1 einer Vorkultur lösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647), welche zuvor im TF-e Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung bereitet wurde, geimpft. Die. Zellen werden 2 Tage bei 37⁰C unter Rühren (30 U/min) unter Einleiten von Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 65 ml/min kultiviert. Sodann wird die Kulturlösung mit 160 g Celite und 80 g Cellulosepulver versetzt und das erhaltene Gemisch wird gerührt und unter vermindertem Druck abfiltriert, wobei man 7,8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit erhält.

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(2) Zu 7,8 g der überstehenden Flüssigkeit der Stufe (1) gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Sodann werden 11,7 1 Äthanol zu der überstehenden Flüssigkeit unter Bildung einer 60%±gen wäßrigen Äthanollösung zugegeben, die man anschließend 24 h bei 4⁰C stehenläßt, bis sich der Niederschlag vollständig abgeschieden hat. Nachfolgend wird die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und der restliche Anteil wird während 5 min mit 6 χ 10 .U/min bei 4⁰C zentrifugiert. Sodann wird der Niederschlag mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthylather in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet; man erhält 2,73 g eines Pulvers. .-—.-—,-- - —

(3) Das in Stufe (2) erhaltene Pulver wird in 25 ml Wasser suspendiert. Der pH der erhaltenen Suspension wird durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt. Die Suspension wird 30 min bei Zimmertemperatur gerührt, worauf 1N Salzsäure zugesetzt wird, um den pH auf 6,0 einzustellen. Nachfolgend wird die Suspension 2 h unter Eiskühlung gerührt und sodann während 10 min bei 1 χ 10 U/rain zentrifugiert. Auf diese Weise wird der Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt. Der Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 6,0 gewaschen. Sodann wird der Niederschlag von der Waschflüssigkeit abzentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min). Die Waschflüssigkeit und die überstehende Flüssigkeit werden kombiniert, und die erhaltene Lösung wird mit 1N Salzsäure auf pH 4,0 eingestellt und sodann 12 h bei einer Temperatur von nicht mehr als 5°C stehengelassen und sodann während 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert, um den Niederschlag abzutrennen. Dieser wird nun mit 15 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen und dann wird der Niederschlag von der Waschflüssigkeit abgetrennt, und zwar während 10 min

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mit 1 χ 10 U/min. Nun wird der Niederschlag wiederum mit 10 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,58 g der carcinostatischen Substanz TF-230, die die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften hat. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 6 bzw. 7 dargestellt.

B e i s ρ i e 1 6

(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß gibt man 8 1 TF-d Kulturmedium der Zusammensetzung des Beispiels 2. Dieses wird 30 min bei 120⁰C sterilisiert. Nach dem Kühlen des Kulturmediums wird Stickstoffgas während 1 h mit einem Durchsatz von 100 ml/min hindurchgeleitet. Nun wird das Kulturmedium mit 1 1 einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) geimpft, die zuvor in dem gleichen Kulturmedium bereitet wurde. Die Zellen werden 2 Tage bei 37⁰C unter Rühren (30 U/min) kultiviert, wobei Stickstoffgas mit 65 ml/min eingeleitet wird. Nach der Kultivierung wird die Kulturlösung mit 1βΟ g Celite und 80 g Cellulösepulver versetzt; das erhaltene Gemisch wird gerührt und unter vermindertem Druck filtriert. Man erhält 7,8-1 einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit.

(2) . Zu 7,8 1 der überstehenden Flüssigkeit der Stufe (1) gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Dann werden 11,7 1 Äthanol zu der überstehenden Flüssigkeit unter Bildung einer 6O96igen wäßrigen Äthanollösung zugegeben, die dann 24 h bei 4⁰C stehengelassen wird. Die überstehende Flüssigkeit wird nun abdekantiert und die verbleibende Restmenge wird bei 4°C während 5 min bei 6 χ 10·⁵ U/min zentrifugiert, um den Niederschlag zu gewinnen. Dieser wird nun mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthylather in dieser Reihen-

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folge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 3,15 g eines Pulvers.

(3) Das in Stufe (2) erhaltene Pulver wird gemäß Beispiel 5(3) behandelt. Man erhält 0,8 g der carcinostatischen Substanz TF-23O mit den in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 5 identisch.

B e i -sr ρ i e 1 7 ·

(1) In 25 ml Wasser werden 3,9 g des Pulvers suspendiert, welches in gleicher Weise erhalten wie in Beispiel 1(1) und (2). Durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung wird der pH der entstehenden Suspension auf 7»5 bis 8,0 eingestellt, und nach dem Rühren der Suspension bei Zimmertemperatur während 30 min wird der pH wiederum durch Zusatz von 1N Salzsäure auf 6,0 eingestellt. Nach 2stündigem Rühren unter Eiskühlung wird die Suspension 10 min mit 1 χ 10 U/min abzentrifugiert; der abgetrennte Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 6,0 gewaschen und nun wird der Niederschlag während 10 min mit 1 χ 10 U/ min von der Waschflüssigkeit abzentrifugiert. Die Waschflüssigkeit und die obige, überstehende Flüssigkeit werden kombiniert und der nachfolgenden Stufe (2) unterworfen. Der Niederschlag wird mit 10 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,06 g der carcinostatischen Substanz TF-220 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 3 identisch.

(2) Zu der kombinierten Lösung der überstehenden Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der Stufe (1) gibt man 1N Salzsäure, um den pH auf 4,0 einzustellen. Dann wird

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das Gemisch 12h bei nicht mehr als 5°C stehengelassen. Nachfolgend wird die Mischung 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert, um den Niederschlag abzutrennen. Dieser wird mit 5 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen. Der Niederschlag und die Waschflüssigkeit werden 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit wird mit der obigen überstehenden Flüssigkeit kombiniert und die kombinierte Lösung wird der Behandlung der nachfolgenden Stufe (3) unterzogen. Der Niederschlag wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,48 g der carcinostatischen Substanz TF-2J5O mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 5 identisch.

(3) Die kombinierte Lösung, bestehend aus der überstehenden Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der Stufe (2), wird mit. 1N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 versetzt. Dann läßt man das Gemisch 2 h unter Eiskühlung stehen. Die Mischung wird 10 min mit 6 χ 10^ U/min zentrifugiert, wobei der Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit getrennt wird. Das Präzipitat wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 gewaschen. Das Präziptat und die Waschflüssigkeit werden 10 min bei 6 χ 10^ U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit wird nun mit der obigen überstehenden Flüssigkeit kombiniert und die kombinierte Lösung wird der im folgenden beschriebenen Stufe (4) unterzogen. Der Niederschlag wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,10 g der carcinostatisehen Substanz TF-240 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-AbsorptionsSpektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 8 bzw. 9 gezeigt.

(4) Äthanol wird zu der kombinierten Lösung der überstehenden Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der Stufe

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(3) unter Bildung einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung zugesetzt. Die wäßrige Äthanollösung wird 12 h bei nicht mehr als 5°C stehengelassen. Dann wird die abgeschiedene Substanz- während 10 min mit β χ 10 U/min zentrifugiert und der Niederschlag wird mit 10 ml einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 10 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 2,08 g der carcinostatischen Substanz TF-250 mit den in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen identisch mit denjenigen des Beispiels 9.

Beispiel 8

In 45 ml Wasser werden 4,5 g eines Pulvers suspendiert, das auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2(1) und (2) hergestellt wurde. Durch Zusatz einer 1N wäßrigen Natriumhydroxidlösung wird der pH der Suspension auf 7,5 bis 8,0 eingestellt, worauf 30 min bei Zimmertemperatur gerührt wird. Dann wird der pH wiederum mit 1N Salzsäure auf 4,0 eingestellt. Die Suspension wird 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert und der Niederschlag wird von der überstehenden Flüssigkeit getrennt. Der Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen und der Niederschlag und die Waschflüssigkeit werden 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit und die überstehende Flüssigkeit werden kombiniert und der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz von 1N Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Danach wird die Lösung 2 h unter Kühlung mit Eis-Wasser stehengelassen und schließlich 10 min mit 6 χ 10* U/min zentrifugiert. Hierdurch wird der Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit getrennt. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 gewaschen und sodann werden der Niederschlag und die Waschflüssigkeit 10 min mit 6 χ 10^ U/min zentrifugiert. Der Niederschlag

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wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,12 g der carcinostatischen Substanz TF-240 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen identisch mit denjenigen des Beispiels 7.

Beispiel 9

(1) Zu der kombinierten Lösung aus überstehender Flüssigkeit und Waschflüssigkeit des Beispiels 1(3) gibt man 1N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 und läßt das Gemisch 2 h unter Eiskühlung stehen. Anschließend wird das Gemisch 10 min mit β χ 10^ U/min zentrifugiert, um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 gewaschen. Das Präzipitat und die Waschflüssigkeit werden 1 10 min mit 6 χ 10 U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit wird mit der obigen überstehenden Flüssigkeit vereinigt und die kombinierte Lösung wird der in der folgenden Stufe (2) beschriebenen Behandlung unterzogen. Das Präzipitat wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,11 g der carcinostatischen Substanz TF-240 mit den in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 7 identisch.

(2) Äthanol wird zu der Lösung, bestehend aus der überstehenden Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der obigen Stufe (1) zugesetzt, um eine 80&Lge wäßrige Äthanollösung zu bilden, die 12 h bei nicht mehr als -5⁰C stehengelassen wird. Die abgeschiedene Substanz wird 10 min mit β χ 10^ U/min zentrifugiert und der Niederschlag mit 10 ml einer 80%igen wäßrigen ÄthanoTLösung und 10 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 2,1 g der careinostatischen Sub-

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stanz TF-250 mit den in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 10 bzw. 11 gezeigt.

Beispiel 10

In 45 ml Wasser werden 4,5 g eines Pulvers suspendiert, das auf gleiche Weise wie in dem Beispiel 2(1) und (2) erhalten wurde. Durch Zugabe von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung wird der pH der Suspension auf 7,5 bis 8,0 eingestellt. Dann rührt man 30 min bei Zimmertemperatur und stellt den pH erneut durch Zusatz von 1N Salzsäure auf 2,0 ein. Das Gemisch wird 10 min mit 6 χ 10^ U/min zentrifugiert, um das Präzipitat von der überstehenden Lösung abzutrennen=, Der Niederschlag wird mit 10 ml Wasser vom pH 2,0 gewaschen, und das Präzipitat und die Waschflüssigkeit werden 10 min mit 6 χ 10^ U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit und die überstehende Flüssigkeit werden kombiniert und diese Lösung wird mit Äthanol unter Bildung einer 80?aigen wäßrigen Äthanollösung versetzt. Die Lösung wird 12h bei nicht mehr als 5°C stehengelassen und dann 10 min mit 6 χ 10 U/min zentrifugiert, wobei man einen Niederschlag erhält. Dieser wird mit 10 ml einer SO^igen wäßrigen Äthanollösung und 10 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 2,68 g der carcinostatischen Substanz TF-250 mit den in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 9 identisch.

Beispiel 11

(1) In 15 ml Wasser werden 1,5 g der carcinostatischen Substanz TF-210 des Beispiels 1 suspendiert. Zu der resultierenden Suspension gibt man unter Rühren eine 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung, um den pH auf 7,8 einzustellen. Die

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Suspension wird auf 37°C erhitzt und mit 15 mg Pronase E (Warenzeichen der Kaken Kagaku; 1 000 000 Tyrosin-Einheiten/g) und einigen Tropfen Toluol versetzt. Unter Schütteln wird die Mischung 24 h einer Enzymbehandlung bei pH 7,8 bis 8,0 und einer Temperatur von 37 bis 4O⁰C unterzogen. Nach der Behandlung wird die Mischung 10 min mit 4000 U/min zentrifugiert, um das Präzipitat von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Zu dem Niederschlag gibt man 3 ml Wasser vom pH 8,0 und zentrifugiert die Mischung 10 min bei 4000 U/min zur Abtrennung des Präzipitats aus der Waschflüssigkeit. Die Waschflüssigkeit und die obige überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und mit 1N Salzsäure versetzt, um den pH auf 2,0 einzustellen, worauf sich ein Niederschlag bildet. Diese Mischung wird ~ 12 h bei 5⁰C stehengelassen und dann 10 min mit 1x10 U/ min zur Abtrennung des Präzipitats aus der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Das Präzipitat wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 versetzt und die Mischung wird 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert, um das Präzipitat von der Waschflüssigkeit abzutrennen. Die Waschflüssigkeit und die überstehende Flüssigkeit werden vereinigt, und die Lösung wird mit Äthanol zur Bildung einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung versetzt. Die wäßrige Äthanollösung wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und dann 10 min mit 4000 U/min zur Abtrennung des Niederschlags aus der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Das Präzipitat wird mit 5 ml einer 8O96igen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 327 mg der carcinostatischen Substanz TF-310-Fraktion.

In 5 ml Wasser werden 327 mg dieses Pulvers aufgelöst, und der pH der Lösung wird durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Die so bereitete Lösung wird in eine mit 45 ml Amberlite IRA-400 (Rohm and

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Haas) gepackte Säule gegeben, welche zuvor auf den OH-Typ eingestellt wurde, und zwar mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung. Nachfolgend gibt man 200 ml Wasser durch die Säule. Alle Eluate werden vereinigt und der pH derselben wird mit 1N Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Diese Lösung wird nun unter vermindertem Druck eingeengt und über Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3/um (Japan Millipore Ltd.) filtriert und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 210 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-310. Die so gewonnene, carcinostatische Substanz TF-310 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 20 bis 60%, ausgedrückt als Glucose. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm einer typischen Probe sind in den Fig. 12, 13 bzw. 14 dargestellt.

(2) In 50 ml Wasser werden 140 mg der carcinostatischen Substanz TF-310 aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird auf die 10Ofache Konzentration, bezogen auf die anfängliche Konzentration, eingeengt. Hierzu wird ein Ultrafilter UK-50 (Ultrafiltermembran der Toyo Roshi Kabushiki Kaisha; nomineller Molekulargewichtsabbruch: 50 000). verwendet. Dieses Konzentrat wird nun über ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2yum filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 88 mg der gereinigten, gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-310. Diese gereinigte, carcinostatische Substanz TF-310 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 16 bis 30%, ausgedrückt als Glucose.

23 7 Λ 8 O O

Beispiel 12

(1) In 10 ml suspendiert man 1 g der carcinostatischen Substanz TF-220 des Beispiels 7(1). Zu der erhaltenen Suspension gibt man 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung unter Rühren, um den pH auf 7,8 einzustellen. Die. Mischung wird auf 37⁰C erwärmt und mit 15 mg Pronase E und mit mehreren Tropfen Toluol versetzt. Unter Schütteln wird die Mischung der Enzymbehandlung bei 37 bis 40°C während 24 h und bei pH 7,8 bis 8,0 unterzogen. Nach der Behandlung wird die Mischung während 10 min bei 4000 U/min zentrifugiert, um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 8,0 versetzt und die Mischung wird sodann 10 min bei .4000 U/min zentrifugiert, um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden kombiniert und die erhaltene Lösung wird mit 1N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 versetzt, wobei sich ein Niederschlag bildet. Die Mischung wird 12h bei 5⁰C stehengelassen und sodann 10 min bei 1 χ 10 U/min zentrifugiert, um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Zum Niederschlag gibt man nun 3 ml Wasser vom pH 2,0 und zentrifugiert die Mischung 10 min mit 1 χ 10 U/min, um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden kombiniert, und die Lösung wird zur Bildung einer 80%igen wäßrigen Athanollösung mit Äthanol versetzt. Die wäßrige Äthanollösung wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und sodann zentrifugiert (4000 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Der Niederschlag wird mit 5 ml einer 80%igen wäßrigen Athanollösung und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 163 mg der carcino-

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statischen Substanz TF-320-Fraktion.

In 5 ml Wasser werden 150 mg dieses Pulvers aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Die so bereitete Lösung wird in eine Säule gegossen, welche mit 25 ml Amberlite IRA-400 gepackt ist. Dieses wurde zuvor mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf den OH-Typ eingestellt. Nachfolgend läßt man 100 ml Wasser durch die Säule laufen. Alle Eluate werden vereinigt und IN Salzsäure wird zur Einstellung des pH auf 7,0 zugesetzt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt, sodann über ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3/um filtriert und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 110 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-320. Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-320 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 20 bis 60%, ausgedrückt als Glucose. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm einer typischen Probe sind in den Fig. 15» 16 bzw. 17 dargestellt.

(2) In 50 ml Wasser werden 100 mg der carcinostatischen Substanz TF-320 aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird auf das 100fache der anfänglichen Konzentration eingeengt. Hierzu verwendet man das Ultrafilter UK-50. Das Konzentrat wird über ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2/um filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 72 mg der gereinigten, gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-320. Die gereinigte, carcinostatische Substanz TF-320 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 16 bis 3O?6, ausgedrückt als Glucose.

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Beispiel 13

(1) In 5 ml Wasser werden 0,48 g der carcinostatischen Substanz TF-230 des Beispiels 7(2) suspendiert, Zu der Suspension gibt man 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung unter Rühren zur Einstellung des pH auf 7,8. Die Mischung wird auf 37°C erwärmt und mit 5,0 mg Pronase E sowie mit mehreren Tropfen Toluol versetzt. Unter Schütteln wird die Mischung 24 h bei pH 7,8 bis 8,0 und bei 37 bis 4O⁰C der Enzymbehandlung unterzogen. Nach dieser Behandlung wird das Gemisch zentrifugiert (4000 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Zu dem Niederschlag gibt man 3 ml Wasser vom pH 8,0. Die Mischung wird zentrifugiert (4000 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und die erhaltene Lösung wird mit 1N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 versetzt, worauf sich ein Präzipitat bildest. Diese Mischung wird 12h bei 5⁰C stehengelassen und dann zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 versetzt und die Mischung zur Abtrennung des Präzipitats aus der Waschflüssigkeit zentrifugiert (1 χ 10 U/min). Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und Äthanol wird zugesetzt, um eine 80%ige wäßrige Äthanollösung zu erhalten. Die wäßrige Äthanollösung wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und dann zentrifugiert (4000 U/ min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 5 ml einer 80&Lgen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 100 mg der carcinostatischen Substanz TF-330-Fraktion.

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In 5 ml Wasser werden 100 mg des vorerwähnten Pulvers aufgelöst und der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz von 1N wäiBriger Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule gegeben, welche mit 15 ml Amberlite IRA-400 gepackt ist. Dieses wurde zuvor mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf den OH-Typ eingestellt. Nachfolgend läßt man 60 ml Wasser durch die Säule laufen. Alle Eluate werden vereinigt und durch Zusatz von 1N Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt. Diese Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und über ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3/um filtriert und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 70 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-330 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-AbsorptionsSpektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm typischer Proben sind in den Fig. 18, 19 bzw. 20 dargestellt.

(2) In 50 ml Wasser werden 70 mg der carcinostatischen Substanz TF-330 aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird auf die 10Ofache Konzentration, bezogen auf die Anfangskonzentration, eingeengt, und zwar durch Verwendung des Ultrafilters UK-50. Das Konzentrat wird über Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2/um filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 49 rag gereinigte, gefriergetrocknete, carcinostatische Substanz TF-330. Die gereinigte, carcinostatische Substanz TF-330 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 16 bis 3094, ausgedrückt als Glucose. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum einer typischen TF-330-Probe sind in den Fig. 21 bzw. 22 dargestellt.

237 480 0

Beispiel 14

(1) Gemäß Beispiel 2(3), 7(1) oder 7(2) wird die Behandlung von 4,5 g der jeweiligen Substanz des Beispiels 2(1) und (2) durchgeführt, wobei man die carcinostatische Substanz TF-210, TF-220 bzw. TF-23O erhält.

(2) Die carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220 oder TF-230 werden nun weiterbehandelt, und zwar gemäß den Beispielen 11(1), 12(1) oder 13(1), wobei man gefriergetrocknete, carcinostatische Substanz TF-31O, TF-320 oder TF-330 in Mengen von 220, 120 bzw. 75 mg erhält. Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 haben die Eigenschaften der Tabelle 2. die IR-AbsorptionsSpektren, die UV-Absorptionsspektren und die Hochleistungs-Flüssigchromatogramme sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele 11, 12 bzw. 13 identisch.

4P

Beispiel 15

Nach dem Verfahren des Beispiels 11 werden 1,5 g der carcinostatischen Substanz TF-210 des Beispiels 1 behandelt, wobei man jedoch (a) 15 mg Trypsin (Difco) anstelle der Pronase E bei der Enzymbehandlung einsetzt und (b) eine 60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 80&Lgen wäßrigen Äthanollösung bereitet, wenn man den Niederschlag von dem wasserlöslichen Anteil mit einem pH von 2 nach der Enzymbehandlung abtrennt. Man erhält 200 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-310.

In ähnlicher Weise werden die folgenden gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanzen TF-320 und TF-330 erhalten.

237 4 80 0

Carcinostatische Trypsin Gefriergetrocknete, carci-

Substanz nostatische Substanz

TF-220 1g 15 mg TF-32O 100 mg

TF-230 0,48 g 5 mg TF-330 65 mg

Die obigen carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 haben die Eigenschaften der Tabelle 2. Die IR-Ab-Sorptionsspektren, die UV-Absorptionsspektren und die Hochlei stungs -Flüs sigchromatogramme sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele 11, 12 bzw. 13(1) identisch.

Beispiel 16

Die carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220 und TF-230 der Beispiele 1, 7(1) bzw. 7(2) werden nach den Verfahren der Beispiele 11(1), 12(1) bzw. 13(1) behandelt, mit der Ausnahme, daß nach der Enzymbehandlung eine 60$ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 8O?6igen wäßrigen Äthanollösung bereitet wird, wenn der Niederschlag aus dem wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 abgetrennt wird. Man erhält die gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 in Mengen von 190, 98 bzw. 66 mg. Die erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 haben die Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Die IR-Absorptionsspektren, die UV-Absorptionsspektren und die Hochleistungs-Flüssigchromatogramme sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele 11, 12 bzw. 13(1) identisch.

B e i s pi el 17

Die carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220 und TF-230 der Beispiele 1, 7(1) bzw. 7(2) werden nach den Verfahren der Beispiele 11(1), 12(1) bzw. 13(1) behandelt, wobei jedoch nach der Enzymbehandlung beim Abtrennen des Niederschlags vom wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 eine

23 7 4 8 0 0

60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 8O96igen wäßrigen Äthanollösung bereitet wird. Im übrigen wird die gleiche Nachbehandlung wie bei den entsprechenden Beispielen durchgeführt, wobei man 192 mg, 102 mg bzw» 65 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 erhält. Die erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 haben die Eigenschaften der Tabelle 2. Die IR-Absorptionsspektren, die UV-Absorptionsspektren und die Hochleistungs-Flussigchromatogramme sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele 11, 12 bzw. 13(1) identisch.

Beispiel 18 .

(1) In ein 90 1 Fermentationsgefäß -(MSJ-U₂-TyP; Marubishi Rika Kenkyusho) gibt man TF-f Kulturmedium. Dieses wurde dadurch bereitet, daß man 70 1 destilliertes Wasser mit 119Og Trypticasepepton, 1050 g Herzinfusion, 210 g Hefeextrakt, 525 g Natriumchlorid, 840 g Glucose, 700 g Lactose, 7 g Natriumsulfit, 35 g Natriumthioglykolat und 175 g Kalium-sek.-phosphat versetzt. Das Kulturmedium wird 15 min bei 118⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen leitet man während 1 h Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 250 ml/min hindurch.

Dieses Kulturmedium wird nun mit etwa 900 ml einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM- . 5077, ATCC-31647) geimpft. Diese wurde zuvor bereitet durch Kultivierung in einem TF-f Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung. Die Zellen werden 4 Tage bei etwa 33⁰C unter Rühren (90 U/min) kultiviert, wobei man Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 250 ml/min einleitet. Nach dem Kultivieren wird die KuItürlösung mit 10 g/l Celite . und 5 g/l Cellulosepulver versetzt und die Mischung wird gerührt und unter vermindertem Druck filtriert, wobei man

237480

etwa 65 1 einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit erhält.

(2) Zu 7,5 1 der überstehenden Flüssigkeit gibt man 113 ml konz.Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0. Sodann gibt man 11,4 1 Äthanol zur überstehenden Flüssigkeit, um eine 6O?6ige wäßrige Äthanollösung zu erhalten. Diese läßt man nun 24 h bei 4⁰C stehen. Nachfolgend wird der Lösungsanteil abdekantiert und der verbleibende Anteil wird bei 4⁰C während 10 min mit 4 χ 1O^ U/min zur Gewinnung des Niederschlags zentrifugiert. Dieser wird mit zwei 100 ml-Portionen einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, einer 150 ml-Portion Äthanol, einer 150 ml-Portion Methanol und schließlich einer 150 ml-Portion Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen und dann wird das Pulver an der Luft getrocknet. Man erhält 3,0 g des Pulvers.

(3) Das Pulver der Stufe (2) wird in 30 ml Wasser suspendiert. Der pH der erhaltenen Suspension'wird mit 4N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt. Dann rührt man 15 min bei Zimmertemperatur und stellt erneut den pH durch Zusatz von 4N Salzsäure auf 4,0 ein. Nachfolgend läßt man die Suspension 2 h unter Eiskühlung stehen. Das Gemisch wird 10 min mit 1 χ 10 U/min zur Abtrennung des Niederschlags aus der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Zum abgetrennten Niederschlag gibt man 6 ml Wasser als Waschflüssigkeit. Hierdurch wird eine Suspension gebildet, welche man mit einer 4N wäßrigen Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH auf 7,5 bis 8,0 versetzt. Die Suspension wird 15 min bei Zimmertemperatur gerührt, worauf man 4N Salzsäure zusetzt, um den pH auf 4,0 einzustellen. Nun läßt man die Suspension 2 h unter Eiskühlung stehen. Sodann wird die Suspension 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert, wobei der Niederschlag gewonnen wird. Dieser wird mit 4 ml Wasser vom pH

237480

4,0 gewaschen und dann wiederum zentrifugiert (1 χ 10 U/ min; 10 min). Man erhält 6,2 g (Naßgewicht) eines Niederschlags (TF-210) gewinnt. Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-210 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 1 identisch.

(4) 6,2 g (Naßgewicht) des Niederschlags der Stufe (3) werden in 6 ml Wasser suspendiert. Zur Suspension gibt man unter Rühren eine gesättigte, wäßrige Ammoniumcarbonatlösung, um den pH der Suspension auf 7,8 einzustellen. Die Suspension wird auf 37⁰C erwärmt und mit 21 mg Pronase E und mehreren Tropfen Toluol versetzt. Das erhaltene Gemisch~wlrd unter Schütteln einer Enzymbehandlung unterworfen, und zwar während 24 h bei 37 bis 40⁰C und bei einem pH von 7,8 bis 8,0. Der pH der erhaltenen Mischung wird unter Zusatz von 4N Salzsäure auf 1,0 einstellt, worauf der Niederschlag gebildet wird. Die Suspension wird nun 2 h unter Eiskühlung stehengelassen und sodann zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um die überstehende Flüssigkeit zu gewinnen. Diese überstehende Flüssigkeit wird mit 29 ml Äthanol unter Bildung einer öO^igen wäßrigen Äthanollösung versetzt, worauf sich ein Niederschlag bildet. Man läßt die Aufschlämmung 2 h unter Eiskühlung stehen. Sie wird sodann zentrifugiert (6 χ 1θ' U/min; 10 min), um den Niederschlag abzutrennen. Dieser wird mit 5 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung, 10 ml Äthanol und 10 ml Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen und sodann an der Luft getrocknet. Man erhält 315 mg rohe Kristalle der carcinostatischen Substanz TF-310.

Die rohen Kristalle (315 mg) werden in 30 ml Wasser aufgelöst und eine 4N wäßrige Natriumhydroxidlösung wird zur Einstellung des pH auf 8,0 zugesetzt. Die erhaltene

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Lösung wird auf eine Säule gegossen, welche mit 30 ml Dowex 1x4 gepackt ist, das auf den Cl-Typ eingestellt wurde. Nachfolgend läßt man 100 ml Wasser durch die Säule laufen. Alle Eluate werden vereinigt und der pH wird auf 6,5 bis 7,0 eingestellt. Sodann wird die Lösung über Ultrafilter UK-50 filtriert, worauf das Filtrat auf die 10Ofache Konzentration der ursprünglichen Konzentration eingeengt wird. Das Konzentrat wird über Millipore-Fiiter mit einem Porendurchmesser von 0,3 /um filtriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 230 mg der gefriergetrockneten, gereinigten, carcinostatischen Substanz TF-310. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-310 hat die Eigenschaften gemäß Tabelle 2; ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 16 bis 30%, ausgedrückt als Glucose. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm typischer Proben sind in den Fig. 23, 24 bzw. 25 dargestellt.

Beispiel 19

In 10 ml Wasser werden 0,9g der carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) suspendiert und der pH wird unter Rühren durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung zur erhaltenen Suspension auf 7,8 eingestellt. Nach der Erwärmung auf 37⁰C gibt man zur Suspension 9 mg Pronase E sowie mehrere Tropfen Toluol in dieser Reihenfolge. Das erhaltene Gemisch wird unter Schütteln einer Enzymbehandlung während 24 h bei 37 bis 40°C und bei einem pH von 7,8 bis 8,0 unterzogen. Die behandelte Mischung wird sodann zentrifugiert (4000 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Zu dem Niederschlag gibt man 3 ml Wasser vom pH 8,0 und zentrifugiert die erhaltene Suspension (4000 U/minj 10 min) zur Abtrennung des Niederschlags von der Waschflüssigkeit. Die Waschflüssigkeit und

237480 0

die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und durch Zusatz von 1N Salzsäure wird der pH auf 2,0 eingestellt. Dabei wird ein Niederschlag gebildet. Die erhaltene Aufschlämmung wird 12 h bei 5⁰C stehengelassen und sodann zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Der Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 2,0 versetzt, und die erhaltene Suspension wird zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und zu der vereinigten Lösung wird Äthanol zur Bildung einer 8O5£igen wäßrigen Äthanollösung gegeben. Die wäßrige Äthanollösung wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und sodann zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Der Niederschlag wird mit 5 ml einer 80&Lgen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und bei vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 170 mg der carcinostatischen Substanz TF-34-O-Fraktion.

In 5 ml Wasser werden 150 mg dieses Pulvers aufgelöst und der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz einer 1N wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Die Lösung wird sodann auf eine Säule gegeben, die mit 25 ml Amberlite IRA-400 gepackt ist. Dieses wurde zuvor mit einer 1N wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf den OH-Typ eingestellt. Sodann läßt man 100 ml Wasser durch die Säule laufen. Alle Eluate werden vereinigt und der pH wird durch Zusatz von 1N Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und über Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3 /um filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 110 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340.

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Die erhaltene, careinostatische Substanz TF-340 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum und das Hoehleistungs-Flüssigchfomatogramm sind in den Fig. 26, 27 bzw, 28 gezeigt.

Beispiel 20

Gemäß dem Verfahren des Beispiels 19 werden 0,9 g der carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 8 behandelt. Man erhält 115 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-340 hat die Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 19 identisch.

Beispiel 21

Gemäß dem Verfahren des Beispiels 19 werden 0,9 g der carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) behandelt, wobei man aber (a)die Enzymbehandlung unter Verwendung von 9 mg Trypsin (Difco) anstelle der Pronase E durchführt und (b) nach der Enzymbehandlung den Niederschlag vom wasserlöslichen Anteil vom pH.2,0 abtrennt und eine 60%ige wäßrige Ithanollösung anstelle einer 80%igen wäßrigen Äthanollosung bereitet. Man erhält 105 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340. Dieses Produkt hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit "-denjenigen des Beispiels 19 identisch.

Beispiel 22 .--^: ' '' ' " \ ·. : '' .... \ ' . '. . .

Die carcinostatische Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) wird gemäß Beispiel 19 behandelt, wobei jedoch nach der Enzymbehandlung beim Sammeln des Niederschlags aus dem

237480 0

wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 eine 60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 8O?6igen wäßrigen Äthanollösung bildet. Man erhält 101 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-340 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 19 identisch.

Beispiel 25

Die carcinostatische Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) wird der Enzymbehandlung des Beispiels 19 unterzogen, worauf man anstelle der Abtrennung des Niederschlags vom wasserlöslichen Anteil mit pH 2,0 den Niederschlag durch Zusatz von 40%iger Trichloressigsäurelösung bis zu einer Trichloressigsäure-Konzentration von 10$ abtrennt und den gebildeten, wasserlöslichen Anteil in eine 80%ige wäßrige Äthanollösung umwandelt, worauf sich die Behandlungsstufen des Beispiels 19 anschließen.' Man erhält 99 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340. Diese hat die Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 19 identisch.

B e i s ρ ie I 24

In 10 ml Wasser werden 0,82 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 7(4) suspendiert und eine 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung 'wird unter Rühren zur Einstellung des pH auf 7,8 zugesetzt. Nach dem Erwärmen auf 37°C gibt man 8 mg Pronase E und mehrere Tropfen Toluol in dieser Reihenfolge zur Suspension. Die erhaltene Mischung wird sodann unter Schütteln der Enzymbehandlung, und zwar bei pH 7,8 bis 8,0 bei 37 bis 40⁰C während 24 h.

-«- 237 4 80 0

Die behandelte Mischung wird zur Abtrennung des Niederschlags von der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert (4000U/min; 10 min). Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 8,0 versetzt und die erhaltene Suspension wird zur Abtrennung des Niederschlags von der Waschflüssigkeit zentrifugiert (4000 U/min; 10 min). Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und zur Einstellung des pH auf 2,0 mit 1N Salzsäure versetzt, worauf sich ein Niederschlag bildet. Die erhaltene Aufschlämmung wird 12 h bei 5⁰C stehengelassen und zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Zu dem Niederschlag gibt man 5 ml Wasser vom pH 2,0 und zentrifugiert die erhaltene Suspension (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und zu dieser Lösung gibt man Äthanol zur Bildung einer 80&Lgen wäßrigen Äthanollösung. Diese wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und sodann 10 min mit 1 χ 10 U/min zur Abtrennung des Niederschlags von der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit 5 ml einer 80%lgen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 430 mg der carcinostatischen Substanz TF-350-Fraktion.

In 5 ml Wasser werden 300 mg des Pulvers aufgelöst. Zu der erhaltenen Lösung gibt man 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung, um den pH auf 7,0 einzustellen. Die Lösung wird auf eine Säule gegossen, welche mit 45 ml Amberlite IRA-400 gepackt ist. Dieses wurde zuvor mit 1N wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf den OH-Typ eingestellt. Sodann gibt man 200 ml Wasser durch die Säule. Alle Eluate werden nun vereinigt und der pH wird durch Zusatz von 1N Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird unter

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vermindertem Druck eingeengt und über Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3/um filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 260 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350« Diese hat die Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind in den Fig. 29, 30 bzw. 31 dargestellt.

B e i s ρ i e 1 25 :

Gemäß Beispiel 24 werden 0,85 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 9 der Enzymbehandlung unter Verwendung von 8 mg Pronase E unterworfen. Man erhält 265 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350 mit den EigenschaftenTder Tabelle""2TTlDaS IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.

Beispiel 26

Gemäß Beispiel 24 werden 0,80 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 10 der Enzymbehandlung unter Verwendung von 8 mg Pronase E unterzogen. Man erhält 253 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350. Diese hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.

Beispiel 27

Gemäß Beispiel 24 werden 0,85 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 7(4) behandelt, mit der Ausnahme, daß (a) die Enzymbehandlung unter Verwendung von 8 mg Trypsin (Difco) anstelle von Pronase E durchge-

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führt wird und (b) nach der Enzymbehandlung bei der Gewinnung des Niederschlags von dem wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 eine 60$ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 80^igen wäßrigen Äthanollösung bereitet wird« Man erhält 247 mg der gefriergetrockneten, careinostatischen Substanz TF-350. Die erhaltene, careinostatische Substanz TF-350 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Fiüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.

Beispiel 28

0,85 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 7(4) werden gemäß Beispiel 24 behandelt, mit der Ausnahme, daß nach der Enzymbehandlung bei der Gewinnung des Niederschlags aus dem wasserlöslichen Anteil mit pH 2,0 eine öO^ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 80#igen wäßrigen Äthanollösung hergestellt wird. Man erhält 242 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.

Beispiel 29

0,8 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 7(4) werden der Enzymbehandlung gemäß Beispiel unterzogen, worauf man bei der Abtrennung des Niederschlags von dem wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 diese Abtrennung derart vornimmt, daß man eine 40#ige Trichloressigsäure bis zu einer Trichloressigsäure-Konzentration von 10% zusetzt und aus dem dabei erhaltenen, wasserlöslichen Anteil eine 80%ige wäßrige Äthanollösung bereitet und nachfolgend die Behandlungsstufen des Beispiels 24 durchführt. Man erhält 238 mg der gefriergetrockneten,

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carcinostatischen Substanz TF-350 mit den Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.

Präparat 1

Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird mit 3 bis 4 mg der careinestatischen Substanz TF-210 (Pulver) versetzt, wobei eine Lösung mit einem pH von 7,0 bis 7,5 gebildet wird. Der wasserlösliche Anteil der erhaltenen Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt wird vor Gebrauch in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst und die dabei erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 2

Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird zu 2 bis 3 mg der carcinostatischen Substanz TF-220 (Pulver) unter Bildung einer Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 gegeben. Der wasserlösliche Anteil der erhaltenen Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Vor Gebrauch wird das Pulver mit einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%±gen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst und die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Präparat 3 .

Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird zu 1 mg der carcinostatischen Substanz TF-230 (Pulver) unter Bildung einer Lösung mit einem pH von 7,0 bis 7,5 gegeben. Diese Lösung wird in eine Ampulle gegeben und ge-

237 4 80

friergetrocknet. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Prä-parat 4

Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird mit .1 mg der carcinostatischen Substanz TF-240 (Pulver) unter Bildung einer Lösung mit einem pH von 7,0 bis 7,5 versetzt. Die Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Vor Gebrauch wird dieses Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5^igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. gelöst. Die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Präparat 5

Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird mit 1 mg.der carcinostatischen Substanz TF-25O (Pulver)unter Bildung einer Lösung mit einem pH von 7,0 bis 7,5 versetzt. Die Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5$igen Lidocainlösung, einer 5&Lgen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit verwendet.

Präparat 6

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-310-1 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-310 erhält, und zwar als 0,5 mg Einheit oder

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1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 7

Eine wäßrige Lösung von pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-310-2 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein ge- ; " friergetrocknetes Präparat der careinostatischen Substanz TF-310, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5/^igen Lidocainlösung, einer 5?6igen ".wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 8

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-320 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein ge- (-' friergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-320, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektions- : zwecke verwendet.

Präparat 9

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-330 wird in eine Ampulle, gegeben und gefriergetrocknet:. Man,erhält ein ge-

23 7 4 80 0

friergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-330, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5#igen Lidocainlösung, einer 5^igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 10 ' .

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-340 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-34-0, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl, aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 11

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7»5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-350 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-350, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5$igen Lidocainlösung, einer 5%±gen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Claims (42)

1. 237480

   1. Verfahren zur Herstellung einer carcinostatischen Substanz TF-2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen TF-2 erzeugenden Bakterienstamm der Gattung Fusobacterium kultiviert und die gebildete Substanz TF-2 aus der Kulturmasse oder der überstehenden Flüssigkeit isoliert.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den TF-2 erzeugenden Bakterienstamm der Gattung Fusobacterium kultiviert, ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zur erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit gibt und die carcinostatische Substanz TF-2 aus dem gebildeten Niederschlag isoliert.
3. 3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen TF-2 erzeugenden Bakterienstamm der Gattung Fusobacterium kultiviert, ein,hydrophiles, organisches Lösungsmittel zur erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit gibt und den gebildeten Niederschlag abtrennt und in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und die verschiedenen, carcinostatischen Substanzen abtrennt.
4. 4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und eine bei pH 3,5 bis 4,5 in Wasser unlösliche Fraktion abtrennt.
5. 5. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren, bei dem der Niederschlag in Abhängigkeit vom pH-Wert fraktioniert wird, derart durchführt, daß man Wasser zum Niederschlag gibt, den pH-Wert auf 3,5 bis 4,5 einstellt und den gebildeten, wasserunlöslichen Anteil isoliert.

   _₇₃_ 2374 80 O
6. 6. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und eine bei pH 5,5 bis 6,5 in Wasser unlösliche Fraktion isoliert.
7. 7. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und eine bei pH 5,5 bis 6,5 in Wasser lösliche, jedoch bei pH 3,5 bis 4,5 in Wasser unlösliche Fraktion isoliert.
8. 8. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und eine bei pH 3,5 bis 4,5 in Wasser lösliche, jedoch bei pH 1,5 bis 2,5 in Wasser unlösliche Fraktion isoliert.
9. 9. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und eine bei pH 1,5 bis 2,5 in Wasser lösliche Fraktion isoliert.
10. 10. - Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Deproteinisierungsbehandlung durchführt mit der Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche aus der Kulturmasse oder überstehenden Flüssigkeit gewonnen wurde, die durch Kultivierung einer die carcinostatische . Substanz TF-2 erzeugenden Bakterienart der Gattung Fusobacterium gewonnen wurde.

    2374 80 j
11. 11. Verfahren nach Punkt 2 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, die durch Kultivierung eines TF-2 erzeugenden Bakterienstamms der Gattung Fusobacterium erhalten wurde, worauf man den gebildeten Niederschlag oder eine darauf gewonnene Fraktion mit carcinostatischer Aktivität einer Deproteinisierungsbehandlung unterzieht.
12. 12. Verfahren nach Punkt 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Deproteinisierungsbehandlung als Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym durchführt.
13. 13. Verfahren nach Punkt 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, welche erhalten wird bei Kultivierung des TF-2 erzeugenden Bakterienstamms der Gattung Fusobacterium, worauf man die erhaltene Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche vom gebildeten Niederschlag gewonnen wurde, einer Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym unterwirft.
14. 14. Verfahren nach Punkt 13, dadurch gekennzeichnet, daß man einen TF-2 erzeugenden Bakterienstamm der Gattung Fusobacterium kultiviert, das hydrophile, organische Lösungsmittel der gebildeten, überstehenden Flüssigkeit zusetzt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert, eine Fraktion mit carcinostatischer Aktivität einer Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym unterwirft und nachfolgend die Fraktion der carcinostatischen Substanz isoliert.
15. 15. Verfahren nach Punkt 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche der Enzymbehandlung mit dem proteolytischen Enzym

    237 Λ 80 0

    zu unterwerfen ist, eine Fraktion verwendet, welche in Wasser bei pH 3,5 bis 4,5 unlöslich ist.
16. 16. Verfahren nach Punkt 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche erhalten wurde durch Zusatz des hydrophilen, organischen Lösungsmittels zur überstehenden Flüssigkeit und nachfolgende Fraktionierung des gebildeten Niederschlags in Abhängigkeit vom pH, ein wasserunlöslicher Anteil ist, welcher erhalten wurde durch Zusatz von Wasser zum Niederschlag und nachfolgende Einstellung des pH-Werts auf 3,5 bis 4,5.
17. 17. Verfahren nach Punkt 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche der Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym zu unterwerfen ist, eine in Wasser bei 5,5 bis 6,5 unlösliche Fraktion ist.
18. 18. Verfahren nach Punkt 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche der Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym zu unterwerfen ist, eine in V/asser bei pH 5,5 bis 6,5 löslich, jedoch in Wasser bei pH 3,5 bis 4,5 unlösliche Fraktion ist.
19. 19. - Verfahren nach Punkt 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche der Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym zu unterwerfen ist, eine in Wasser bei pH 3,5 bis 4,5 löslich, jedoch in Wasser bei pH 1,5 bis 2,5 unlösliche Fraktion ist.
20. 20. Verfahren nach Punkt 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit carcinostatischer?-,;Aktivität,

    -ye- 23 74 8 0 0

    welche der Enzym"behandlung mit einem proteolytischen Enzym zu unterwerfen ist, eine in Wasser bei pH 1,5 bis 2,5 lösliche Fraktion ist.
21. 21. Verfahren nach einem der Punkte 12 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das proteolytische Enzym Pronase oder Trypsin ist.
22. 22. Verfahren nach einem der Punkte 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung der Fraktionen der carcinostatischen Substanz nach der Enzymbehandlung nach mindestens einem der folgenden Verfahren durchführt: Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH, gesonderte Ausfällung aus einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, Ultrafiltrationsverfahren, Fraktionieren mit einem Ionenaustauscher, und daß man sodann die Fraktionen der carcinostatischen Substanz isoliert.
23. 23. Verfahren nach Punkt 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gewinnung der Fraktionen der carcinostatischen Substanz nach der Enzymbehandlung durchführt durch Fraktionierung des wasserlöslichen Anteils nach der Enzymbehandlung mit einem· proteolytischen Enzym, Ein-

    ('. stellung des pH-Werts des wasserlöslichen Anteils auf 2,5 oder weniger, Zusatz des hydrophilen, organischen Lösungsmittels zum wasserlöslichen Anteil, Behandlung des gebildeten Niederschlags mit einem Ionenaustauscher und Abtrennung der nichtadsorbierten Fraktion.
24. 24. Verfahren nach Punkt 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung der Fraktionen der carcinostatischen Substanz nach der Enzymbehandlung derart durchführt, daß man den in Wasser löslichen Anteil nach der Enzymbehandlung in Abhängigkeit vom pH fraktioniert; den pH auf 2,5 oder weniger einstellt, ein hydrophiles,

    2374 80

    organisches Lösungsmittel zu einer effektiven Menge des so erhaltenen, wasserlöslichen Anteils gibt, den gebildeten Niederschlag mit einem Ionenaustauscher behandelt und sodann die nichtadsorbierte Fraktion einer Ultrafiltration unterwirft.
25. 25. Verfahren nach einem der Punkte 2 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit einer auf pH 1,5 bis 2,5 eingestellten Kultur gibt.
26. 26. Verfahren nach einem der Punkte 2 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile, organische Lösungsmittel, welches der überstehenden Flüssigkeit der Kultur zugesetzt wird, ein Alkohol ist.
27. 27. Verfahren nach einem der Punkte 2 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile, organische Lösungsmittel, welches der überstehenden Flüssigkeit der Kultur zugesetzt wird, zu einer Konzentration des Lösungsmittels in der gebildeten Lösung von 30 bis 80 Vol-% führt,
28. 28. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium für die Kultivierung des Bakterienstamms Stickstoffquellen, Kohlenstoff quellen, Vitaminquellen, Reduktionsmittel und anorganische Salze sowie gegebenenfalls Agar enthält.
29. 29. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium für die Kultivierung des Bakterienstamms Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion) , Hefeextrakt, Natriumchlorid, Gluocse, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält oder die obigen acht Komponenten und Agar oder die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteose-

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    pepton und L-Cystin oder die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar.
30. 30. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei 30 bis 42⁰C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium mit einem pH von 6,0 bis 8,5 durchführt.
31. 31. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei 32 bis 37⁰C während 1 bis 4 Tagen in einem Kulturmedium mit einem pH von 6,5 bis 7»5 durchführt.
32. 32. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterienstamm der Gattung Fusobacterium einen Bakterienstamm der Species Fusobacterium nucleatum verwendet.
33. 33. Verfahren "nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42⁰C während'' 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, welches Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und.Thioglykolat enthält,oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH derselben auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß die Konzentration desselben in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, "Wasser zum

    .237480 0

    Niederschlag gibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 3,5 bis 4,5 einstellt und den gebildeten Niederschlag abtrennt und, falls erforderlich, nochmals in Abhängigkeit vom pH fraktioniert, wobei man eine carcinostatische Substanz erhält.
34. 34. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42⁰C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, welches Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin oder Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt; den pH derselben auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß die Konzentration desselben in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zum Niederschlag gibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 5,5 bis 6,5 einstellt und den gebildeten Niederschlag abtrennt und, falls erforderlich, nochmals in Abhängigkeit vom pH fraktioniert, wobei man eine carcinostatische Substanz erhält.
35. 35. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42°C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, welches Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat

    237480 0

    enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L~Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH derselben auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß die Konzentration desselben in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vo1-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zum Niederschlag gibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 5,5 bis 6,5 einstellt, die überstehende Flüssigkeit sammelt, den pH der überstehenden Flüssigkeit auf 3,5 bis 4,5 einstellt, den gebildeten Niederschlag abtrennt und, falls erforderlich, nochmals in Abhängigkeit vom pH fraktioniert, wobei man eine carcinostatische Substanz erhält.
36. 36. Verfahren nach Punkt 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42°C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticasepepton, Hirn-Herz- · Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystein und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH derselben auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß die Konzentration desselben in der gebildeten Lösung 50

    237480 0

    bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, V/asser zum Niederschlag gibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 3,5 bis 4,5 einstellt, die überstehende Flüssigkeit entnimmt, deren pH auf 1,5 bis 2,5 einstellt, den gebildeten Niederschlag abtrennt und, falls erförderlich, nochmals in Abhängigkeit vom pH fraktion!er% wobei man eine carcinostatische Substanz erhält.
37. 37. Verfahren nach Punkt ; 9» dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42⁰C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfat und Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH derselben auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß die Konzentration desselben in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zu dem Niederschlag gibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 1,5 bis 2,5 einstellt, die überstehende Flüssigkeit entnimmt, einen Alkohol zu der überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 20 bis 80 Vol-% beträgt, und den gebildeten Niederschlag abtrennt, wobei die carcinostatische Substanz erhalten wird.
38. 38. Verfahren nach Punkt 16, dadurch gekennzeichnet, daß. man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Be-

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    dingungen bei 30 bis 42°C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thiogiykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH der überstehenden Flüssigkeit auf 1,5 Ms 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten-Niederschlag abtrennt, Wasser zu dem Präzipitat zusetzt, den pH des Gemisches auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 3»5 bis 4,5 einstellt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, falls erforderlich, nochmals in Abhängigkeit vom pH fraktioniert, Wasser zu dem erhaltenen Niederschlag zusetzt, den pH auf 7 bis 8 einstellt, danach Pronase oder Trypsin zugibt, das Gemisch 1 bis 72 Stunden bei 30 bis 40⁰C einer Enzymbehandlung unterwirft, den pH der behandelten Mischung auf 2,5 oder weniger einstellt, die erhaltene, überstehende Flüssigkeit abtrennt, einen Alkohol zu der überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß die Alkoholkonzentration in der kombinierten Lösung 30 bis 80 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag gewinnt oder, falls erforderlich, das obige Präziptat mit einem starken Anionenaustauscherharz behandelt, die nichtadsorbierte Fraktion einer Ultrafiltration unterwirft, diese Ultrafiltration erforderlichenfalls wiederholt, das Produkt über ein Millipore-Filter filtriert und gefriertrocknet, wobei man die carcinostatische Substanz erhält.

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39. 39. Verfahren nach Punkt 17, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42⁰C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium,das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH der überstehenden Flüssigkeit auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zu diesem Niederschlag zusetzt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 5,5 bis 6,5 einstellt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, erforderlichenfalls diese Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH wiederholt, Wasser zu dem erhaltenen Niederschlag zugibt, den pH auf 7 bis 8 einstellt, Pronase oder Trypsin zusetzt, die Mischung einer Enzymbehandlung bei 30 bis 40⁰C während 1 bis 72 Stunden unterwirft, den pH der behandelten Mischung auf 2,5 oder weniger einstellt, die erhaltene, überstehende Flüssigkeit abtrennt, einen Alkohol zu dieser überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß die Alkoholkonzentration in der kombinierten Lösung 30 bis 80 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt oder, falls erforderlich den vorerwähnten Niederschlag mit einem starken Anionenaustauscherharz behandelt, seine nichtadsorbierte Fraktion der Ultrafiltration unterzieht, wobei diese Ultrafiltration erforderlichenfalls wiederholt werden kann, dann über ein Millipore-

    -<*- 2374 80 0

    Filter filtriert und gefriertrocknet, wobei man die carcinostatische Substanz erhält.
40. 40. Verfahren nach Punkt 18, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42⁰C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticasepepton, Hirn-Herzinfusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entimmt, den pH der überstehenden Flüssigkeit auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zu diesem Niederschlag zusetzt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 5,5 bis 6,5 einstellt, die überstehende Flüssigkeit abtrennt, deren pH auf 3»5 bis 4,5 einstellt, das ("' ; gebildete Präzipitat abtrennt, diese Fraktionierung erforderlichenfalls in Abhängigkeit vom pH wiederholt, Wasser zu dem erhaltenen Niederschlag zugibt, den pH auf 7 bis 8 einstellt, Pronase oder Trypsin zusetzt, das Gemisch einer Enzymbehandlung während 1 bis 72 Stunden bei 30 bis 40⁰C unterzieht, die behandelte Mischung auf einen pH von 2,5 oder weniger einstellt, die erhaltene, überstehende Flüssigkeit abtrennt, einen Alkohol zu der überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß die Alkoholkonzen-V tration in der kombinierten Lösung 30 bis 80 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt oder, falls erforderlich, den obigen Niederschlag mit einem starken

    - 237 480 0

    Anionenaustauscherharζ behandelt, seine nichtadsorbierte Fraktion der Ultrafiltration unterwirft, wobei diese Ultrafiltration erforderlichenfalls wiederholt werden kann, das Produkt über Millipore-Filter filtriert und gefriertrocknet, wobei man die carcinostatische Substanz erhält.
41. 41. Verfahren nach Punkt 19, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42⁰C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert,, das Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält, öder^in"'einem Kürtürme"diüm7~da's die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, deren pH auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 50 bis 70 VoI-^ beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zu diesem Niederschlag zusetzt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 3»5 bis 4,5 einstellt, die überstehende Flüssigkeit gewinnt, deren pH auf 1,5 bis 2,5 einstellt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, diese Fraktionierung erforderlichenfalls in Abhängigkeit vom pH wiederholt, Wasser zu dem erhaltenen Niederschlag zusetzt, den pH auf 7 bis 8 einstellt, dann Pronase oder Trypsin zugibt, die Mischung einer Enzymbehandlung bei 30 bis 40⁰C während 1 bis 72 Stunden unterwirft, den pH der behandelten Mischung auf 2,5 oder weniger einstellt, die erhaltene, überstehende Flüssigkeit abtrennt, einen Alkohol zu der überstehenden Flüssigkeit zugibt, so daß die

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    Alkoholkonzentration in der kombinierten Lösung 30 bis 80 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt oder erforderlichenfalls den vorerwähnten Niederschlag mit einem starken Anionenaustauscherharz behandelt, seine nichtadsorbierte Fraktion der Ultrafiltration unterwirft, wobei diese Ultrafiltration erforderlichenfalls wiederholt werden kann, denn durch Millipore-Filter filtriert und das Produkt gefriertrocknet, wobei man eine careinostatische Substanz erhält/
42. 42. Verfahren nach Punkt -20, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42°C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticase, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit oder Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH der überste- ;'"'.. henden Flüssigkeit auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alko- '.. hol zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-96 beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zu diesem Niederschlag zugibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach ; den pH auf 1,5 bis 2,5 einstellt, die überstehende Flüssig- ; keit entnimmt, einen Alkohol zu dieser überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß die Alkoholkonzentration in der gebildeten Lösung 20 bis 80 VoI-^ beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, erforderlichenfalls diese Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH wiederholt, Wasser zu dem erhaltenen Niederschlag zugibt, den pH auf 7 bis

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    einstellt, Pronase oder Trypsin zufügt, die Mischung bei 30 bis 40⁰C während 1 bis 72 Stunden einer Enzymbehandlung unterwirft, den pH der behandelten Mischung auf 2,5 " oder weniger einstellt, die erhaltene, überstehende Flüssigkeit abtrennt, einen Alkohol zu der überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß die Alkoholkonzentration in der kombinierten Lösung 30 bis 80 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt oder erforderlichenfalls den vorerwähnten Niederschlag mit einem starken Anionenaustauscherharz behandelt, seine nichtadsorbierte Fraktion einer Ultrafiltration unterzieht, wobei diese Ultrafiltration erforderlichenfalls wiederholt werden kann, und das Produkt über Millipore-Filter filtriert und gefriertrocknet, wobei man die carcinostatische Substanz erhält.

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