Procédé et dispositif pour l'observation en microscopie à contraste de phase variable
La présente invention comprend un procédé pour l'observation en microscopie à contraste de phase variable; elle comprend également un dispositif optique pour la mise en oeuvre de ce procédé.
On a déjà proposé de nombreux dispositifs à contraste de phase variable qui comportent tous des moyens polariseurs et une lame de phase, mais ces dispositifs n'ont pas donné les résultats industriels qui en étaient espérés. Dans ces dispositifs connus pour l'observation en contraste de phase, le déphasage de base qui doit normalement être égal à +
2
est obtenu par mise en oeuvre d'un retard optique.
Dans ces conditions, c'est-à-dire lorsque l'on fait inter
venir un retard optique, la phase a s'exprime par:
2t
< p A
n
où le retard optique A est
Ao A
4
Ao est la longueur d'onde moyenne et A la longueur
d'onde considérée; il en résulte que 7r Ao
2 A ce qui explique pourquoi dans les dispositifs connus, où l'on utilise un retard optique, le déphasage n'est égal à
7r
2
que si A = Ao et le déphasage de base varie avec la lon
gueur d'onde.
Pour éviter les inconvénients des dispositifs connus,
qui exigent un double réglage, on a cherché à opérer
suivant un procédé permettant un réglage à commande
unique, de manière à bénéficier des avantages suivants:
d'une part cette commande unique peut être étalonnée
et fournit ainsi un moyen de mesure de l'épaisseur
optique de l'objet étudié, d'autre part ladite commande,
en agissant simultanément sur le déphasage et sur l'ab
sorption de la lame de phase, a pour effet qu'un objet
d'épaisseur optique quelconque non nécessairement
petite par rapport à la longueur d'onde, apparaît avec
un contraste égal à 1 c'est-à-dire que l'image du détail
étudié devient noire sur un fond clair. Ce dernier
phénomène sert de critère de parfaite compensation et
peut donc facilement être utilisé pour des mesures.
Partant de cette première idée de base de la présente
invention, on a réexaminé en détail les théories physi
ques et mathématiques établies sur l'observation à
contraste de phase. Si l'on examine, en se référant à la
fig. I des dessins et en supprimant les flèches désignant
les vecteurs afin de simplifier les écritures, les diagrammes vectoriels des phénomènes, avec l'amplitude objet (vecteur Vt [V1 = ei], on vont que le vecteur Vt est décomposé en deux vecteurs VO et V2, suivant l'équation vectorielle
Vt = VO + V2 (figure la).
Si l'on désire annuler la lumière à l'intérieur de l'objet, il faut et il suffit que le vecteur VO de module égal à 1 soit remplacé par le vecteur V3 = -V2.
Or, dans cette décomposition le vecteur VO représente la lumière dite directe, c'est-à-dire que pour éteindre I'objet, il faut déphaser V, de l'angle
EMI2.1
et diminuer son module de
< p
1 à 2 sin.
2
Ceci signifie que le réglage optimum du contraste de phase variable s'obtient en satisfaisant les deux conditions simultanées ci-après:
1. la transparence en énergie de la zone dite conjuguée de la lame de phase doit être ramenée à la valeur
< p 4 sans sin2= 2 (1 - cos )
2
2. le déphasage y) de ladite zone conjuguée doit être égal à ¯ +
2 2
Ces considérations ont été exposées en détail par divers auteurs (en particulier d'une part Bennett et autres (Phase microscopy. Principles and applications
John Wiley et Sons éditeurs New-York-1957) d'autre part Les contrastes de phase et le contraste par interférence (colloque de la Commission Internationale d'Optique 15-21 mars 1951 - Maurice Françon éditeurs
Editions de la Revue d'Optique).
Divers auteurs, par exemple H. Osterberg avec son système Polanret et le brevet des Etats-Unis d'Amérique 2 516 905 ont proposé de résoudre le problème exposé en constituant la lame de phase de deux polariseurs croisés suivis d'une lame biréfringente quartd'onde complétée par un compensateur variable, le tout étant disposé entre un polariseur et un analyseur.
Dans ce cas, la lame quart-d'onde réalise le déphasage principal égal à
+
2 le compensateur permettant d'ajouter le petit déphasage égal à
< p
2
La transmission de la zone conjuguée est alors réglée par rotation de l'analyseur. On voit immédiatement que cette solution, utilisée dans les dispositifs connus précités, présente les deux inconvénients déjà cités que l'invention permet d'éviter comme on le verra plus loin et qui sont que
1. le réglage optimum doit être réalisé en agissant pour les ajuster, sur deux paramètres indépendants;
2. le déphasage principal de
2 est obtenu par le moyen d'un retard de
rZ
4 qui est essentiellement chromatique puisqu'il dépend de la longueur d'onde de la lumière d'éclairage.
C'est alors que reprenant les conclusions tirées du diagramme vectoriel de la fig. 1a7 on a constaté que la solution des problèmes posés pouvait être obtenue en traitant le vecteur VO sans le soumettre à la rotation w et à la diminution de grandeur décrites au sujet de la fig. la Si, comme représenté à la fig.
1b, on ajoute au vecteur VO le vecteur (-V1) on obtient un vecteur Vs défini par V3 = Vo - Vt c'est-à-dire l-eir. Ceci signifie que l'on peut obtenir le contraste correspondant à l'annulation de la lumière à l'intérieur de l'objet en opposant au vecteur VO, représentant le fond cohérent, un vecteur opposé au vecteur Vl représentant l'objet.
Le résultat qui correspond aux conditions idéales d'observation d'un objet de phase , peut être atteint en conférant à la zone conjuguée (représentée par le vecteur Vs = l-ei) de la lame, la transmission d'amplitude complexe l-e- et à la zone complémentaire (vecteur V, = 1), la transmission égale à 1.
Le procédé objet de l'invention pour l'observation en microscopie à contraste de phase variable, mettant en oeuvre un déphasage de
2 et un déphasage variable est caractérisé en ce qu'il consiste à décomposer la lame de phase en deux zones dites respectivement conjugée et complémentaire, et à polariser le faisceau lumineux suivant deux directions inclinées à 45" l'une sur l'autre, l'une des polarisations intéressant la zone conjuguée et l'autre la zone complémentaire, sans retard de chemin optique.
Le dispositif objet de l'invention, pour la mise en oeuvre du procédé ci-dessus défini est caractérisé en ce qu'il comporte une lame de phase constituée de deux polariseurs tournés entre eux de 45 , occupant respectivement la zone conjuguée et la zone complémentaire de ladite lame, un polariseur étant disposé en avant de cette lame de manière telle qu'il recouvre les deux dites zones et qu'il soit parallèle à celui qui occupe la zone conjuguée de la lame, un ensemble composé d'un compensateur biréfringent et d'un analyseur étant monté en arrière de la lame, dans le sens de propagation de la lumière, de manière telle que la transmission des amplitudes complexes de la zone conjuguée soit égale à l-eiz et celle de la zone complémentaire soit égale à 1.
Les polariseurs sont avantageusement réunis par collage entre deux lames de verre, les polariseurs formant la lame de phase présentant des zones où l'action polarisante est supprimée par tout traitement photochimique approprié connu, lesdites zones couvrant respectivement la zone conjuguée et la zone complémentaire.
Le compensateur peut être du type Senarmont connu en soi et comporter des repères angulaires per mettant d'effectuer des mesures des objets de phase.
La lame de phase est de préférence placée dans un plan conjugué du plan focal de l'objectif par rapport à un véhicule optique de grandissement égal à -t de préférence.
La zone conjuguée de la lame de phase a de préférence une zone annulaire dont la surface relative n'excède pas 12 /o de la surface correspondant à l'image de la pupille de sortie de l'objectif utilisé et projetée sur la lame de phase.
On a décrit ci-après, à titre d'exemple en se référant aux figures du dessin annexé diverses formes de réalisation d'un dispositif selon l'invention.
Fig. 2 est une vue schématique d'une premiere forme de réalisation.
Fig. 3 est une vue analogue d'une variante.
Fig. 4 et 5 représentent les diagrammes représentatifs des phénomènes survenant dans les zones conjuguée et complémentaire;
Fig. 6 et fig. 7 sont des vues respectivement en coupe et en plan du premier polariseur et de la lame de phase;
Fig. 8 est un diagramme d'après lequel on peut déterminer la transmission en énergie T et le déphasage q, de la zone conjuguée de la lame de phase en fonction de la phase .
Dans le cas de la fig. 2, une source quasi ponctuelle 1 envoie à travers un condenseur 2 un faisceau parallèle sur l'objet de phase Q. A la sortie de l'objet Q, le faisceau est décomposé en un faisceau direct qui après la traversée de l'objectif 3 traverse un polariseur 4, focalisé sur la partie centrale de la lame de phase 5 dite zone conjuguée et en un faisceau diffracté qui traverse toute la lame de phase 5 en étant principalement affecté par la transmission de la partie qui entoure la zone conjuguée et dénommée zone complémentaire .
Le polariseur 4 est du type non divisé. La lame de phase 5 proprement dite est constituée d'un polariseur 6 ayant la même orientation que le polariseur 4, situé dans la zone conjuguée et d'un polariseur 7 orienté à 450 du polariseur 4 et occupant la zone complémentaire (voir fig. 6 et 7). La lame de phase 5 qui, dans l'exemple, est placée dans le plan focal F' de l'objectif 3 est conjuguée de la source 1 par rapport à l'ensemble: condenseur 2 plus objectif 3. Le dispositif comporte, après la lame 5, un compensateur biréfringent 8 symbolisé par une lame biréfringente d'épaisseur variable et qui introduit une différence de phase 0 entre les deux ondes polarisées à 900 l'une par rapport à l'autre. Les lignes neutres de ce compensateur sont orientées à + 450 du polariseur 4.
Enfin un analyseur 9 croisé avec le polariseur 4 termine le montage. L'image réelle de l'objet est projetée au-delà du dessin et n'est pas représentée.
Aux fig. 4 et 5, on a représenté l'évolution que subissent respectivement les amplitudes complexes de l'onde directe et de l'onde diffractée à travers les éléments constitutifs du dispositif.
Pour la lumière directe, la lumière polarisée par le polariseur 4 ne subit pas de modification par l'effet du polariseur 6 mais elle est décomposée par le compensateur 8 en deux vibrations perpendiculaires dont les deux amplitudes complexes sont
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L'analyseur 9 ne transmet que deux composantes antiparallèles d'amplitudes
1 1
et- eiç
2 2
Pour la lumière diffractée, on voit que le polariseur 7 de la zone complémentaire ne transmet qu'une composante dirigée à +45 .
Le compensateur 8 ne modifie en rien son amplitude qui reste égale à 1/1/2; enfin l'analyseur 9 transmet une composante perpendiculaire au polariseur 4 d'amplitude 1/2.
En définitvie on obtient une transmission d'amplitude complexe de la lumière directe dans la zone conjuguée egale à une constante près à 1-eiç et celle de la lumière diffractée dans la zone complémentaire égale à 1.
En amenant alors le déphasage 0 du compensateur 8 à la valeur 97 du déphasage local objet Q, on obtient une image optima du détail étudié de l'objet.
On voit bien que dans les conditions décrites, le seul paramètre variable est ici la valeur 0 qui est réglable au moyen du compensateur biréfringent 8 de type connu.
Au lieu du compensateur représenté à la fig. 2, on peut utiliser avantageusement un compensateur de
Senarmont, à cause de sa simplicité et de sa linéarité; comme représenté en fig. 3, un tel compensateur est composé d'une lame quart d'onde 10 généralement en mica, dont l'axe lent est parallèle au polariseur et d'un analyseur tournant 9. On obtient un déphasage di en tournant l'analyseur de l'angle 0/2.
Aux fig. 6 et 7, on a représenté démontée une forme de réalisation avantageuse d'une lame de phase composée de trois polariseurs 4, 6 et 7, assemblés par collage de trois feuilles polarisantes entre deux lames de verre. La première feuille 4 est à l'état non divisé, tandis que les feuilles 6 et 7 présentent des zones non polarisantes (6' et 7') qui se complètent mutuellement.
La forme de la zone conjuguée ainsi que celle de la source peut avantageusement être annulaire, comme il est bien connu.
Il n'est matériellement pas toujours possible de placer l'ensemble qui constitue la lame de phase 4, 6, 7 dans le plan focal F' de l'objectif 3. On peut alors recourir à un véhicule optique de tout type connu en soi et qui reproduit plus loin l'image réelle de ce plan focal qui en général n'est pas accessible dans un objectif de microscope usuel.
En fig. 8 on a représenté un diagramme permettant de déterminer la transmission T en fonction de la phase g (courbe cosinusoïdale) et le déphasage y, en fonction de la même phase ç (courbe en dent de scie tiretée);
T=t2 = 2 (1- cos )
-sinç
tgu=
i-cos < p
Method and device for observation in variable phase contrast microscopy
The present invention comprises a method for observation in variable phase contrast microscopy; it also comprises an optical device for implementing this method.
Numerous variable phase contrast devices have already been proposed which all include polarizing means and a phase plate, but these devices have not given the industrial results which were hoped for. In these devices known for observation in phase contrast, the base phase shift which should normally be equal to +
2
is obtained by implementing an optical delay.
Under these conditions, that is to say when we make inter
come an optical delay, phase a is expressed by:
2t
<p A
not
where the optical delay A is
Ao A
4
Ao is the mean wavelength and A is the length
wave considered; it follows that 7r Ao
2 This explains why in the known devices, where an optical delay is used, the phase shift is not equal to
7r
2
that if A = Ao and the base phase shift varies with the lon
waveform.
To avoid the drawbacks of known devices,
which require a double adjustment, we tried to operate
according to a process allowing a controlled adjustment
unique, so as to benefit from the following advantages:
on the one hand this single command can be calibrated
and thus provides a means of measuring the thickness
optics of the studied object, on the other hand said command,
by acting simultaneously on the phase shift and on the ab
sorption of the phase plate, has the effect that an object
of any optical thickness not necessarily
small compared to the wavelength, appears with
a contrast equal to 1, i.e. the image of the detail
studied turns black on a light background. This last
phenomenon serves as a criterion of perfect compensation and
can therefore easily be used for measurements.
Starting from this first basic idea of the present
invention, the physiological theories were reviewed in detail.
ques and mathematics based on observation
phase contrast. If we examine, referring to the
fig. I of the drawings and deleting the arrows designating
the vectors in order to simplify the writings, the vector diagrams of the phenomena, with the object amplitude (vector Vt [V1 = ei], we go that the vector Vt is decomposed into two vectors VO and V2, according to the vector equation
Vt = VO + V2 (figure la).
If one wishes to cancel the light inside the object, it is necessary and sufficient that the vector VO of modulus equal to 1 is replaced by the vector V3 = -V2.
Now, in this decomposition the vector VO represents the so-called direct light, that is to say that to extinguish the object, it is necessary to phase out V, by the angle
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and decrease its modulus of
<p
1 to 2 sin.
2
This means that the optimum adjustment of the variable phase contrast is obtained by satisfying the two following conditions simultaneously:
1.the energy transparency of the so-called conjugate zone of the phase plate must be brought back to the value
<p 4 without sin2 = 2 (1 - cos)
2
2.the phase shift y) of said conjugate zone must be equal to ¯ +
2 2
These considerations have been explained in detail by various authors (in particular on the one hand Bennett and others (Phase microscopy. Principles and applications
John Wiley and Sons publishers New-York-1957) on the other hand Phase contrasts and contrast by interference (conference of the Commission Internationale d'Optique March 15-21, 1951 - Maurice Françon publishers
Editions de la Revue d'Optique).
Various authors, for example H. Osterberg with his Polanret system and the patent of the United States of America 2,516,905 have proposed to solve the problem exposed by constituting the phase plate of two crossed polarizers followed by a quarter-birefringent plate. wave completed by a variable compensator, the whole being arranged between a polarizer and an analyzer.
In this case, the quarter-wave plate achieves the main phase shift equal to
+
2 the compensator allowing to add the small phase shift equal to
<p
2
The transmission of the conjugate zone is then adjusted by rotating the analyzer. It can be seen immediately that this solution, used in the aforementioned known devices, has the two drawbacks already mentioned which the invention makes it possible to avoid, as will be seen below and which are that
1. the optimum adjustment must be achieved by acting to adjust them, on two independent parameters;
2.the main phase shift of
2 is obtained by means of a delay of
rZ
4 which is essentially chromatic since it depends on the wavelength of the illuminating light.
It is then that, taking the conclusions drawn from the vector diagram of FIG. 1a7 it was found that the solution of the problems posed could be obtained by treating the vector VO without subjecting it to the rotation w and to the reduction in magnitude described in connection with FIG. the If, as shown in FIG.
1b, we add to the vector VO the vector (-V1) we obtain a vector Vs defined by V3 = Vo - Vt that is to say l-eir. This means that one can obtain the contrast corresponding to the cancellation of the light inside the object by opposing the vector V0, representing the coherent background, a vector opposite to the vector V1 representing the object.
The result, which corresponds to the ideal conditions for observing a phase object, can be achieved by giving the conjugate zone (represented by the vector Vs = l-ei) of the plate, the complex amplitude transmission le- and at the complementary zone (vector V, = 1), the transmission equal to 1.
The method which is the subject of the invention for observation by variable phase contrast microscopy, implementing a phase shift of
2 and a variable phase shift is characterized in that it consists in breaking down the phase plate into two zones called respectively conjugated and complementary, and in polarizing the light beam in two directions inclined at 45 "to one another, the one of the polarizations involving the conjugate zone and the other the complementary zone, without optical path delay.
The device which is the subject of the invention, for the implementation of the method defined above, is characterized in that it comprises a phase plate consisting of two polarizers rotated between them by 45, respectively occupying the conjugate zone and the complementary zone of said plate, a polarizer being arranged in front of this plate in such a way that it covers the two said zones and that it is parallel to that which occupies the conjugate zone of the plate, an assembly composed of a birefringent compensator and an analyzer being mounted behind the slide, in the direction of propagation of the light, in such a way that the transmission of the complex amplitudes of the conjugate zone is equal to l-eiz and that of the complementary zone is equal to 1 .
The polarizers are advantageously joined by bonding between two glass plates, the polarizers forming the phase plate having zones where the polarizing action is eliminated by any known suitable photochemical treatment, said zones respectively covering the conjugate zone and the complementary zone.
The compensator may be of the Senarmont type known per se and include angular reference marks making it possible to carry out measurements of the phase objects.
The phase plate is preferably placed in a plane conjugate of the focal plane of the objective with respect to an optical vehicle of magnification preferably equal to -t.
The conjugate zone of the phase plate preferably has an annular zone whose relative area does not exceed 12 / o of the area corresponding to the image of the exit pupil of the objective used and projected onto the phase plate .
Various embodiments of a device according to the invention have been described below by way of example with reference to the figures of the appended drawing.
Fig. 2 is a schematic view of a first embodiment.
Fig. 3 is a similar view of a variant.
Fig. 4 and 5 represent the diagrams representative of the phenomena occurring in the conjugate and complementary zones;
Fig. 6 and fig. 7 are respectively sectional and plan views of the first polarizer and of the phase plate;
Fig. 8 is a diagram from which one can determine the energy transmission T and the phase shift q, of the conjugate zone of the phase plate as a function of the phase.
In the case of fig. 2, a quasi-point source 1 sends through a condenser 2 a parallel beam on the phase object Q. At the exit of the object Q, the beam is decomposed into a direct beam which, after passing through the objective 3 passes through a polarizer 4, focused on the central part of the phase plate 5 known as the conjugated zone and in a diffracted beam which crosses the entire phase plate 5, being mainly affected by the transmission of the part which surrounds the conjugated zone and called the zone complementary .
The polarizer 4 is of the undivided type. The phase plate 5 proper consists of a polarizer 6 having the same orientation as the polarizer 4, located in the conjugate zone and a polarizer 7 oriented at 450 from the polarizer 4 and occupying the complementary zone (see fig. 6). and 7). The phase plate 5 which, in the example, is placed in the focal plane F 'of the objective 3 is conjugated from the source 1 with respect to the assembly: condenser 2 plus objective 3. The device comprises, after the plate 5, a birefringent compensator 8 symbolized by a birefringent plate of variable thickness and which introduces a phase difference 0 between the two waves polarized at 900 with respect to each other. The neutral lines of this compensator are oriented at + 450 from polarizer 4.
Finally, an analyzer 9 crossed with the polarizer 4 completes the assembly. The actual image of the object is projected beyond the drawing and is not shown.
In fig. 4 and 5, the evolution which the complex amplitudes of the direct wave and of the diffracted wave undergo respectively through the constituent elements of the device has been shown.
For direct light, the light polarized by the polarizer 4 does not undergo any modification by the effect of the polarizer 6 but it is broken down by the compensator 8 into two perpendicular vibrations, the two complex amplitudes of which are
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Analyzer 9 transmits only two antiparallel amplitude components
1 1
and- eiç
2 2
For diffracted light, it can be seen that the polarizer 7 of the complementary zone transmits only a component directed at +45.
The compensator 8 in no way modifies its amplitude which remains equal to 1/1/2; finally the analyzer 9 transmits a component perpendicular to the polarizer 4 of amplitude 1/2.
In the end, we obtain a transmission of complex amplitude of the direct light in the conjugated zone equal to a constant near to 1-eiç and that of the diffracted light in the complementary zone equal to 1.
By then bringing the phase shift 0 of the compensator 8 to the value 97 of the local object phase shift Q, an optimum image of the studied detail of the object is obtained.
It can be seen that under the conditions described, the only variable parameter here is the value 0 which is adjustable by means of the birefringent compensator 8 of known type.
Instead of the compensator shown in fig. 2, one can advantageously use a compensator of
Senarmont, because of its simplicity and linearity; as shown in fig. 3, such a compensator is composed of a quarter-wave plate 10 generally made of mica, the slow axis of which is parallel to the polarizer and of a rotating analyzer 9. A phase shift di is obtained by rotating the analyzer of the. angle 0/2.
In fig. 6 and 7, an advantageous embodiment of a phase plate composed of three polarizers 4, 6 and 7, assembled by gluing three polarizing sheets between two glass plates, has been shown dismantled. The first sheet 4 is in the undivided state, while the sheets 6 and 7 have non-polarizing areas (6 'and 7') which complement each other.
The shape of the conjugate zone as well as that of the source can advantageously be annular, as is well known.
It is not always possible to place the assembly which constitutes the phase plate 4, 6, 7 in the focal plane F 'of the objective 3. It is then possible to use an optical vehicle of any type known per se. and which further reproduces the real image of this focal plane which in general is not accessible in a conventional microscope objective.
In fig. 8 there is shown a diagram making it possible to determine the transmission T as a function of phase g (cosine curve) and the phase shift y, as a function of the same phase ç (dashed sawtooth curve);
T = t2 = 2 (1- cos)
-sinç
tgu =
i-cos <p