Procédé et dispositif pour l'observation en microscopie à contraste de phase variable
La présente invention comprend un procédé pour l'observation en microscopie à contraste de phase variable; elle comprend également un dispositif optique pour la mise en oeuvre de ce procédé.
On a déjà proposé de nombreux dispositifs à contraste de phase variable qui comportent tous des moyens polariseurs et une lame de phase, mais ces dispositifs n'ont pas donné les résultats industriels qui en étaient espérés. Dans ces dispositifs connus pour l'observation en contraste de phase, le déphasage de base qui doit normalement être égal à +
2
est obtenu par mise en oeuvre d'un retard optique.
Dans ces conditions, c'est-à-dire lorsque l'on fait inter
venir un retard optique, la phase a s'exprime par:
2t
< p A
n
où le retard optique A est
Ao A
4
Ao est la longueur d'onde moyenne et A la longueur
d'onde considérée; il en résulte que 7r Ao
2 A ce qui explique pourquoi dans les dispositifs connus, où l'on utilise un retard optique, le déphasage n'est égal à
7r
2
que si A = Ao et le déphasage de base varie avec la lon
gueur d'onde.
Pour éviter les inconvénients des dispositifs connus,
qui exigent un double réglage, on a cherché à opérer
suivant un procédé permettant un réglage à commande
unique, de manière à bénéficier des avantages suivants:
d'une part cette commande unique peut être étalonnée
et fournit ainsi un moyen de mesure de l'épaisseur
optique de l'objet étudié, d'autre part ladite commande,
en agissant simultanément sur le déphasage et sur l'ab
sorption de la lame de phase, a pour effet qu'un objet
d'épaisseur optique quelconque non nécessairement
petite par rapport à la longueur d'onde, apparaît avec
un contraste égal à 1 c'est-à-dire que l'image du détail
étudié devient noire sur un fond clair. Ce dernier
phénomène sert de critère de parfaite compensation et
peut donc facilement être utilisé pour des mesures.
Partant de cette première idée de base de la présente
invention, on a réexaminé en détail les théories physi
ques et mathématiques établies sur l'observation à
contraste de phase. Si l'on examine, en se référant à la
fig. I des dessins et en supprimant les flèches désignant
les vecteurs afin de simplifier les écritures, les diagrammes vectoriels des phénomènes, avec l'amplitude objet (vecteur Vt [V1 = ei], on vont que le vecteur Vt est décomposé en deux vecteurs VO et V2, suivant l'équation vectorielle
Vt = VO + V2 (figure la).
Si l'on désire annuler la lumière à l'intérieur de l'objet, il faut et il suffit que le vecteur VO de module égal à 1 soit remplacé par le vecteur V3 = -V2.
Or, dans cette décomposition le vecteur VO représente la lumière dite directe, c'est-à-dire que pour éteindre I'objet, il faut déphaser V, de l'angle
EMI2.1
et diminuer son module de
< p
1 à 2 sin.
2
Ceci signifie que le réglage optimum du contraste de phase variable s'obtient en satisfaisant les deux conditions simultanées ci-après:
1. la transparence en énergie de la zone dite conjuguée de la lame de phase doit être ramenée à la valeur
< p 4 sans sin2= 2 (1 - cos )
2
2. le déphasage y) de ladite zone conjuguée doit être égal à ¯ +
2 2
Ces considérations ont été exposées en détail par divers auteurs (en particulier d'une part Bennett et autres (Phase microscopy. Principles and applications
John Wiley et Sons éditeurs New-York-1957) d'autre part Les contrastes de phase et le contraste par interférence (colloque de la Commission Internationale d'Optique 15-21 mars 1951 - Maurice Françon éditeurs
Editions de la Revue d'Optique).
Divers auteurs, par exemple H. Osterberg avec son système Polanret et le brevet des Etats-Unis d'Amérique 2 516 905 ont proposé de résoudre le problème exposé en constituant la lame de phase de deux polariseurs croisés suivis d'une lame biréfringente quartd'onde complétée par un compensateur variable, le tout étant disposé entre un polariseur et un analyseur.
Dans ce cas, la lame quart-d'onde réalise le déphasage principal égal à
+
2 le compensateur permettant d'ajouter le petit déphasage égal à
< p
2
La transmission de la zone conjuguée est alors réglée par rotation de l'analyseur. On voit immédiatement que cette solution, utilisée dans les dispositifs connus précités, présente les deux inconvénients déjà cités que l'invention permet d'éviter comme on le verra plus loin et qui sont que
1. le réglage optimum doit être réalisé en agissant pour les ajuster, sur deux paramètres indépendants;
2. le déphasage principal de
2 est obtenu par le moyen d'un retard de
rZ
4 qui est essentiellement chromatique puisqu'il dépend de la longueur d'onde de la lumière d'éclairage.
C'est alors que reprenant les conclusions tirées du diagramme vectoriel de la fig. 1a7 on a constaté que la solution des problèmes posés pouvait être obtenue en traitant le vecteur VO sans le soumettre à la rotation w et à la diminution de grandeur décrites au sujet de la fig. la Si, comme représenté à la fig.
1b, on ajoute au vecteur VO le vecteur (-V1) on obtient un vecteur Vs défini par V3 = Vo - Vt c'est-à-dire l-eir. Ceci signifie que l'on peut obtenir le contraste correspondant à l'annulation de la lumière à l'intérieur de l'objet en opposant au vecteur VO, représentant le fond cohérent, un vecteur opposé au vecteur Vl représentant l'objet.
Le résultat qui correspond aux conditions idéales d'observation d'un objet de phase , peut être atteint en conférant à la zone conjuguée (représentée par le vecteur Vs = l-ei) de la lame, la transmission d'amplitude complexe l-e- et à la zone complémentaire (vecteur V, = 1), la transmission égale à 1.
Le procédé objet de l'invention pour l'observation en microscopie à contraste de phase variable, mettant en oeuvre un déphasage de
2 et un déphasage variable est caractérisé en ce qu'il consiste à décomposer la lame de phase en deux zones dites respectivement conjugée et complémentaire, et à polariser le faisceau lumineux suivant deux directions inclinées à 45" l'une sur l'autre, l'une des polarisations intéressant la zone conjuguée et l'autre la zone complémentaire, sans retard de chemin optique.
Le dispositif objet de l'invention, pour la mise en oeuvre du procédé ci-dessus défini est caractérisé en ce qu'il comporte une lame de phase constituée de deux polariseurs tournés entre eux de 45 , occupant respectivement la zone conjuguée et la zone complémentaire de ladite lame, un polariseur étant disposé en avant de cette lame de manière telle qu'il recouvre les deux dites zones et qu'il soit parallèle à celui qui occupe la zone conjuguée de la lame, un ensemble composé d'un compensateur biréfringent et d'un analyseur étant monté en arrière de la lame, dans le sens de propagation de la lumière, de manière telle que la transmission des amplitudes complexes de la zone conjuguée soit égale à l-eiz et celle de la zone complémentaire soit égale à 1.
Les polariseurs sont avantageusement réunis par collage entre deux lames de verre, les polariseurs formant la lame de phase présentant des zones où l'action polarisante est supprimée par tout traitement photochimique approprié connu, lesdites zones couvrant respectivement la zone conjuguée et la zone complémentaire.
Le compensateur peut être du type Senarmont connu en soi et comporter des repères angulaires per mettant d'effectuer des mesures des objets de phase.
La lame de phase est de préférence placée dans un plan conjugué du plan focal de l'objectif par rapport à un véhicule optique de grandissement égal à -t de préférence.
La zone conjuguée de la lame de phase a de préférence une zone annulaire dont la surface relative n'excède pas 12 /o de la surface correspondant à l'image de la pupille de sortie de l'objectif utilisé et projetée sur la lame de phase.
On a décrit ci-après, à titre d'exemple en se référant aux figures du dessin annexé diverses formes de réalisation d'un dispositif selon l'invention.
Fig. 2 est une vue schématique d'une premiere forme de réalisation.
Fig. 3 est une vue analogue d'une variante.
Fig. 4 et 5 représentent les diagrammes représentatifs des phénomènes survenant dans les zones conjuguée et complémentaire;
Fig. 6 et fig. 7 sont des vues respectivement en coupe et en plan du premier polariseur et de la lame de phase;
Fig. 8 est un diagramme d'après lequel on peut déterminer la transmission en énergie T et le déphasage q, de la zone conjuguée de la lame de phase en fonction de la phase .
Dans le cas de la fig. 2, une source quasi ponctuelle 1 envoie à travers un condenseur 2 un faisceau parallèle sur l'objet de phase Q. A la sortie de l'objet Q, le faisceau est décomposé en un faisceau direct qui après la traversée de l'objectif 3 traverse un polariseur 4, focalisé sur la partie centrale de la lame de phase 5 dite zone conjuguée et en un faisceau diffracté qui traverse toute la lame de phase 5 en étant principalement affecté par la transmission de la partie qui entoure la zone conjuguée et dénommée zone complémentaire .
Le polariseur 4 est du type non divisé. La lame de phase 5 proprement dite est constituée d'un polariseur 6 ayant la même orientation que le polariseur 4, situé dans la zone conjuguée et d'un polariseur 7 orienté à 450 du polariseur 4 et occupant la zone complémentaire (voir fig. 6 et 7). La lame de phase 5 qui, dans l'exemple, est placée dans le plan focal F' de l'objectif 3 est conjuguée de la source 1 par rapport à l'ensemble: condenseur 2 plus objectif 3. Le dispositif comporte, après la lame 5, un compensateur biréfringent 8 symbolisé par une lame biréfringente d'épaisseur variable et qui introduit une différence de phase 0 entre les deux ondes polarisées à 900 l'une par rapport à l'autre. Les lignes neutres de ce compensateur sont orientées à + 450 du polariseur 4.
Enfin un analyseur 9 croisé avec le polariseur 4 termine le montage. L'image réelle de l'objet est projetée au-delà du dessin et n'est pas représentée.
Aux fig. 4 et 5, on a représenté l'évolution que subissent respectivement les amplitudes complexes de l'onde directe et de l'onde diffractée à travers les éléments constitutifs du dispositif.
Pour la lumière directe, la lumière polarisée par le polariseur 4 ne subit pas de modification par l'effet du polariseur 6 mais elle est décomposée par le compensateur 8 en deux vibrations perpendiculaires dont les deux amplitudes complexes sont
EMI3.1
L'analyseur 9 ne transmet que deux composantes antiparallèles d'amplitudes
1 1
et- eiç
2 2
Pour la lumière diffractée, on voit que le polariseur 7 de la zone complémentaire ne transmet qu'une composante dirigée à +45 .
Le compensateur 8 ne modifie en rien son amplitude qui reste égale à 1/1/2; enfin l'analyseur 9 transmet une composante perpendiculaire au polariseur 4 d'amplitude 1/2.
En définitvie on obtient une transmission d'amplitude complexe de la lumière directe dans la zone conjuguée egale à une constante près à 1-eiç et celle de la lumière diffractée dans la zone complémentaire égale à 1.
En amenant alors le déphasage 0 du compensateur 8 à la valeur 97 du déphasage local objet Q, on obtient une image optima du détail étudié de l'objet.
On voit bien que dans les conditions décrites, le seul paramètre variable est ici la valeur 0 qui est réglable au moyen du compensateur biréfringent 8 de type connu.
Au lieu du compensateur représenté à la fig. 2, on peut utiliser avantageusement un compensateur de
Senarmont, à cause de sa simplicité et de sa linéarité; comme représenté en fig. 3, un tel compensateur est composé d'une lame quart d'onde 10 généralement en mica, dont l'axe lent est parallèle au polariseur et d'un analyseur tournant 9. On obtient un déphasage di en tournant l'analyseur de l'angle 0/2.
Aux fig. 6 et 7, on a représenté démontée une forme de réalisation avantageuse d'une lame de phase composée de trois polariseurs 4, 6 et 7, assemblés par collage de trois feuilles polarisantes entre deux lames de verre. La première feuille 4 est à l'état non divisé, tandis que les feuilles 6 et 7 présentent des zones non polarisantes (6' et 7') qui se complètent mutuellement.
La forme de la zone conjuguée ainsi que celle de la source peut avantageusement être annulaire, comme il est bien connu.
Il n'est matériellement pas toujours possible de placer l'ensemble qui constitue la lame de phase 4, 6, 7 dans le plan focal F' de l'objectif 3. On peut alors recourir à un véhicule optique de tout type connu en soi et qui reproduit plus loin l'image réelle de ce plan focal qui en général n'est pas accessible dans un objectif de microscope usuel.
En fig. 8 on a représenté un diagramme permettant de déterminer la transmission T en fonction de la phase g (courbe cosinusoïdale) et le déphasage y, en fonction de la même phase ç (courbe en dent de scie tiretée);
T=t2 = 2 (1- cos )
-sinç
tgu=
i-cos < p