CH512482A

CH512482A - Substd cobamides

Info

Publication number: CH512482A
Application number: CH1718768A
Authority: CH
Inventors: Lester Smith Ernest; Mervyn Leonhard; Malcolm Victor
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1961-12-11
Filing date: 1962-11-12
Publication date: 1971-09-15

Abstract

(A) Prepn. of cobamide derivs. (vitamin B12 and analogues with modified molecules) having gp. R attached to Co atom by condensing fully reduced cobamide under non-oxidising conditions with approp. agent to introduce R (e.g. R halides, mesylate, tosylate etc.). R = aliphatic hydrocarbon gp. opt. substd., acyl, or alkyl-, aralkyl- or aryl-sulphonyl. (B) Products of (A), except vitamin B12 coenzyme and the co-5'-deoxyadenosyl derivs. of other cobamides with same side chains on pyrrole ring as in vitamin B12. Vitamin B12 coenzyme antagonists (when adenosine moiety of coenzyme replaced by Et, uridine or inosine gp. or isopropylidine adenosine gp.); Me deriv. is coenzyme in Me transfer to homocysteine in methionine formation.

Description

  

  
 



  Verfahren zur Herstellung von Cobalticorrinoiden
Vitamin   B1.    spielt in vielen biochemischen Prozessen, besonders bei der Synthese von Nucleinsäuren, eine wichtige Rolle. Wahrscheinlich ist dieses Vitamin in manchen dieser Prozesse in Gestalt eines Adenosyl-Derivates wirksam, welches als Vitamin   Bl2-Coenzym    bezeichnet werden kann, und man hat schon die Verwendung dieses Coenzyms für die Behandlung der bösartigen Blutarmut (anaemia perniciosa) vorgeschlagen. Die genaue Funktion dieses Coenzyms im Metabolismus der Zellen bildet den Gegenstand emsiger Forschung, und es besteht ein Bedarf für ein synthetisches Verfahren zu dessen Herstellung aus dem leichter erhältlichen Vitamin   Ba2,    sowohl in normaler als auch in radioaktiver Form.

  Es ist zweckmässig, wenn man mit Hilfe eines solchen synthetischen Verfahrens auch andere Analoge dieses in der Natur vorkommenden Stoffes herstellen kann. Es sind verschiedene Verfahren für die Synthese von Vitamin B12-coenzym und auch von einigen analogen Verbindungen, z.B. der Coenzymform von 4-Vitamin B12 bekannt, aber diese Verfahren setzen langwierige Reinigungen voraus, und es konnten bisher keine anderen Nucleoside als Adenosin zur Bildung von Derivaten des Vitamins   B1    oder seiner Analogen gebracht werden, und man konnte auch keine Vitamin B12-Analoge mit modifizierten Seitenketten an den Pyrrolgruppen, welche eine anti-metabolische Wirkung ausüben, in die Coenzymform bringen.  



  Vitamin   B1o    hat die Formel
EMI2.1     
 und es hat sich herausgestellt, dass im Coenzym die -CN Gruppe durch die   5'-Deoxy-adenosylgruppe    ir
EMI2.2     
 ersetzt ist, welche mit dem 5'-Kohlenstoffatom des Ribosemoleküls am zentralen Kobaltatom hängt.



   Es sind viele Analoge von Vitamin B12 bekannt, in denen das Molekül an einer oder mehreren Stellen modifiziert ist. Es können z.B. verschiedene, Amide tragende Seitenketten modifiziert sein, z.B. durch Entfernen der NH2-Gruppen, wobei sich freie Säuren bilden, die man in andere Derivate umwandeln kann, z.B. in Ester oder andere Amide, z.B. Arylamide, usw. [E. Lester Smith  Vitamin   B12a,    (Methuen)]. Man kann den 5,6-Dimethyl -benziminazolrest des Moleküls durch andere heterocyclische Basen ersetzen, die zwei oder mehr Stickstoffatome im Ring haben, z.B. durch andere Benziminazole, wie Benziminazol, 5-Hydroxybenziminazol, Naphthiminazol, oder durch Purin- oder Pyrinimidinbasen, wie Adenin, Xanthin, Hypoxanthin, Guanin, 2-Methyladenin, 8 -Aza-adenin, 2,6-Diaminopurin usw. (Lester Smith, I.c.).



  Der Riboseteil des Moleküls kann an einem anderen Kohlenstoffatom an die Phosphorsäuregruppe gebunden sein und die mit der Phosphorsäuregruppe verbundene Isopropylaminogruppe kann durch andere Alkylaminoketten ersetzt werden [Heinrich, Friedrich und Riedel (1961), Biochem. Zeit. 334, 284]. Man kann auch die CN-Gruppe durch eine andere Gruppe ersetzen, z.B., eine Hydroxyl-,   Nitrit-,    Thiocyanat-, Sulfitgruppe. Eine weitere Möglichkeit ist die völlige Abwesenheit des Nucleotid Restes, z.B. im Faktor B oder Cobinamid (Armitage, Cannon, Johnson, Parker, Lester Smith, Stafford und Todd J.C.S. 1953, S. 3849).



   Der Einfachheit halber werden das Vitamin   Bis    und seine Analoge mit abgeändertem Molekül allgemein als    Cobalticorrinoide     bezeichnet. Diese Bezeichnung   um-    fasst aber nicht nur Moleküle mit Amidgruppen, sondern auch Analoge von Vitamin B12 mit ersetzten oder entfernten Amidgruppen.



   Die Cobalticorrinoide sind im allgemeinen rot oder orange gefärbt, wenn man sie aber z.B. mit einem Borhydrid reduziert, erhält man eine braungefärbte reduzierte   Form, in welches das Cobaltatom wahrscheinlich zweiwertig ist. Diese Reduktion ist reversibel und die reduzierten braunen Stoffe werden an der Luft leicht wieder oxydiert, in denen aber das an das Cobaltatom gebundene Anion im allgemeinen durch OH ersetzt ist, wenn die Oxydation in Gegenwart von Wasser erfolgt. Solche Verbindungen seien  reduzierte Cobalticorrinoide  genannt.



   Die Reduktion kann aber weiter geführt werden, wobei man graugrün gefärbte Produkte erhält Beavan und Johnson (1955), Nature, 176, 1264. Solche Verbindungen werden als  vollständig reduzierte Cobalticorrinoide  bezeichnet. Diese vollständig reduzierten Cobalticorrinoide sind ebenso wie die   braungefärbten       reduzierten     Cobalticorrinoide leicht oxydierbar in Gegenwart von Wasser, z.B. durch die Einwirkung von Luft, und liefern dabei die entsprechenden Hydroxocobalticorrinoide.



   Wie gezeigt wird, ist der Nucleosid-Rest im Vitamin   B,2-Coenzym    mit dem zentralen Cobaltatom durch eine Kohlenstoff-Cobaltbindung verbunden. Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens ist es möglich, solche Cobalticorrinoid-Derivate herzustellen in denen eine organische Gruppe mit dem zentralen Cobaltatom durch eine Kohlenstoff-Cobaltbindung verbunden ist, ähnlich wie beim Vitamin-B12-Coenzym, und das Verfahren ist auch anwendbar zur Herstellung dieses Coenzyms selbst aus Vitamin   Bl.    Das Verfahren ist aber auch zur Herstellung von analogen Verbindungen mit einer Schwefel-Cobaltbindung, z.B. von Sulfonylderivaten, anwendbar.



   Es hat sich gezeigt, dass man Cobalticorrinoid-Derivate herstellen kann durch Umsetzung von vollständig reduzierten Cobalticorrinoiden mit acylierenden oder ähnlichen Mitteln, wobei man eine die Carbonyl- oder Sulfonylgruppe enthaltende Acylgruppe beim Cobaltatom einführen kann. Solche Mittel umfassen insbesondere Verbindungen der Formel RX, in welcher X ein anionenbildender Substituent ist, z.B. ein Halogenatom, ein Sulfat-, Phosphat-, Sulfonat oder Oxalatrest, und R eine Acylgruppe einer Carbonsäure oder eine Alkylsulfonyl-, Arylsulfonyl- oder Aralkylsulfonylgruppe bedeutet.



   Damit das Ausgangsmaterial nicht oxydiert wird, soll die Umsetzung unter nichtoxydierenden Bedingungen durchgeführt werden.



   Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Cobalticorrinoiden mit einer an das Cobaltatom gebundenen Gruppe R, die ein Acylrest einer Carbonsäure oder eine Alkylsulfonyl-, Aralkylsulfonyl- oder Arylsulfonylgruppe ist, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Cobalticorrinoid reduziert bis das Cobaltatom in einwertiger Form vorliegt und dann unter nichtoxydierenden Bedingungen die Gruppe R durch Umsetzung mit einem den Rest R abgebenden Mittel einführt.



   Der Substituent X im Mittel RX kann z.B. ein Chlor-, Brom- oder Jodatom sein. Die Gruppe R kann dabei eine Acylgruppe z.B. ein Acetyl-, Propionyl- oder Benzoylrest, sein.



   In Anhydriden kann R eine Acylgruppe sein, während X eine von einer Carbonsäure abgeleitete Acyloxygruppe darstellt.



   Die Reaktion zwischen der Verbindung RX und dem vollständig reduzierten Cobalticorrinoid wird vorzugsweise in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt, zweckmässig in einem polaren Lösungsmittel. Brauchbar sind Wasser, Alkanole, wie Methanol und   Äthynol,    und substituierte Amide, wie Dimethylformamid und Dimethylacetamid.



   Die nichtoxydierenden Bedingungen können erzielt werden, wenn man die Umsetzung in einer inerten Atmosphäre, z.B. unter Stickstoff, durchführt. Besonders zweckmässig ist es das Cobalticorrinoid z.B. mit einem Metallhydrid, wie Alkaliborhydrid, zu reduzieren und eventuell ohne Zerstörung oder Entfernung des überschüssigen Reduziermittels und ohne Isolierung des vollständig reduzierten Cobalticorrinoids den anderen Reaktionsteilnehmer unmittelbar der Lösung zuzusetzen. Man kann überschüssiges Borhydrid nach beendigter Reduktion des Cobalticorrinoids vor oder nach Zusetzen des anderen Reaktionsteilnehmers zersetzen, z.B. mit einer organischen Säure, wie Essigsäure. Andere brauchbare Reduktionsmittel sind Verbindungen mit niedrigwertigen Metallionen, z.B. Corm-II-acetat, Zink- und Essigsgure oder Wasserstoffgas in Gegenwart eines Katalysators, wie Platinoxyd.



   Als Cobalticorrinoid verwendet man zweckmässig ein Hydrocobalticorrinoid. Obwohl man Cyano- oder Sulfitocobalticorrinoide usw. auch verwenden kann, ist es im allgemeinen empfehlenswert, das freiwerdende HCN oder   50    vor der kondensierenden Einführung zu entfernen, weil diese ähnlich wirken wie das kondensierende Mittel und bilden das ursprüngliche Cobalticorrinoid wieder zurück. So säuert man z.B., wenn man von Cyanocobalamin ausgeht, die bei der Reduktion gebildete Lösung an und erwärmt sie unter vermindertem Druck, um das gebildete HCN zu entfernen.



   Die erfindungsgemäss erhältlichen Derivate von Vitamin B12 sind von besonderem Wert bei der experimentellen Untersuchung des Vitamin   B,2-Metabolismus    und bei der darauf gegründeten Therapie. Die Acylderivate sind besonders als Antimetabolite des natürlichen Coenzymes wertvoll, indem sie Prozesse hemmen, in welchen das Vitamin eine wesentliche Rolle spielt. Von grosser Brauchbarkeit sind insbesondere die Coenzym-Analoge, welche aus solchen   Vitamin-B, > -Analogen    gebildet werden, welche an sich antimetabolisch wirken.



   Beispiel I
Herstellung des Acetylanalogen.



   50 mg Hydrocobalamin werden mit Chromacetat in 7,5 ml EDTA-Puffer bei pH 10 in Stickstoffatmosphäre zu einem graugrünen Stoff reduziert. Nach Zugabe von   0,25    ml Acetylchlorid schlägt die Lösung fast augenblicklich in orangerot um. Nach 45 Minuten bei Zimmertemperatur wird die Mischung weiterverarbeitet. Etwa verbliebenes reduziertes Vitamin   B12    kann durch Luftzutritt bei Zimmertemperatur oxydiert und abgetrennt werden.



  Das erhaltene Produkt kann weiter aufgearbeitet werden, indem man die alkalische Lösung mit verdünnter Salzsäure neutralisiert und mit Phenol/Tetrachlorkohlenstoff (3 :1) in kleinen Anteilen extrahiert, bis die wässrige Schicht beinahe farblos ist. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, mit ungefähr 10 Teilen Tetrachlorkohlenstoff/Aceton (10:1) gemischt und mit kleinen Anteilen Wasser geschüttelt, bis die rote Farbe gänzlich verschwunden ist.

 

   Durch Chromatographie wird das Produkt an Säulen von CMC (Carboxymethyl)-cellulose (150 X 25 mm) und Entwicklung mit Wasser, gereinigt.



   Der aus der CMC-Säule austretende Stoff ist etwas stärker orangefarbig als das Coenzym und hat ein Absorptionsmaximum bei 510   mp    anstatt bei 520   mull.    Ausserdem ist die Umwandlung zu gelber Farbe in Säurelösung bei pH 3,5   beendet, -während    das Coenzym ein An säuren auf pH 2 erfordert, bevor die Umwandlung   bet    endet ist. Sonst ähnelt das Spektrum dem des Coenzyms.  



  Die spektroskopisch ermittelte Ausbeute beträgt 31 mg.



  Das Produkt kristallisiert aus wässrigem Aceton in langen roten Nadeln (Ausbeute 27 mg). Es hemmt das natürliche Coenzym im Enzymversuch in bedeutendem Masse.



   Beispiel 2    Herstelltç7zg    des   p-Tollrolsulfonyl-(Tosyl)-A nalogen   
Hydroxocobalamin wird mit Chromacetat in einem EDTA-Puffer hei pH 10 in einer Stickstoffatmosphäre vollständig reduziert. Man gibt einen beträchtlichen Überschuss an p-Toluolsulfonylchlorid, gelöst in Äthanol, zu.



  Die Farbe ändert sich von fast schwarz sofort zu rot. Man verarbeitet das Reaktionsgemisch weiter durch Phenolextraktion und stellt fest, dass nach Waschen mit verdünnter Salzsäure der Phenolextrakt grün und nach Waschen mit Wasser dunkelrot wird. Die wässrige Lösung wird mittels Hindurchleitens durch Säulen von DEAE- und CM-Cellulose gereinigt, welch letztere sehr wenig Farbe zurückhalten. Das Tosylanaloge läuft mit nur geringer Verzögerung hindurch. Das ausstretende Material wird konzentriert und nach Zugabe von Aceton in fast schwarzen Nadeln kristallisiert. Das Absorptionsspektrum liegt zwischen dem des Cobalamins und des Coenzyms. Es zeigt eine Spitze im sichtbaren Bereich bei 520   myS,    eine Beugung bei 365   mp    und eine schwache Spitze bei 351 mtl.



  Das Intensitätsverhältnis bei 350 und 520   mll    ist 2,8 verglichen mit 3,4 für Hydroxycobalamin und 1,75 für das Coenzym.



   Beispiel 3    Alerstelllmg    des   A cetyianalogen   
100 mg Hydrocobalamin werden mit Natriumborhvdrid zu einem grünlich-schwarzen Stoff reduziert. Dann setzt man überschüssiges   Äthylaceiat    zu, das sich jedoch nicht umsetzt, wie die unveränderte Farbe nach 15 Minuten beweist. Darauf gibt man Essigsäureanhydrid zu, wodurch sich die Farbe sofort in orangerot ändert. Das Re   tktionsgemisch    wird über Phenol /Tetrachlorkohlenstoff weiterverarbeitet und in Säulen von DEAE- und CM-Cellulose gereinigt. Es wird aus wässrigem Aceton kristallisiert. Nach Papierchromatographie hat das Produkt einen   R-Wert    gegenüber B12 von 1,40, den gleichen wie das Produkt nach Beispiel 1.

 

   Beispiel 4    Herstei!nrlg    des   MetSlanslllfonyl-(Mesyl)-AsTalogen   
Man reduziert 100 mg Hydroxocobalamin mit 50 mg Chromacetat in   10    ml EDTA-Puffer bei pH 10. Nach 15 Minuten werden 0,25 ml Methansulfonylchlorid zugegeben. Die Farbe schlägt sofort von dunkelgrün in rot um. Nach 15 Minuten wird extrahiert und gereinigt, wie in früheren Beispielen beschrrieben. Die Ausbeute an purpur-schwarzen Kristallen beträgt 50 mg.



   Das Absorptionsspektrum zeigt Spitzen bei 363 und   52f >  und ist dem Spektrum der in Beispiel 1 beschrie-    benen   Tosylverbindung    sehr ähnlich. Nach Papierchroma   tographie    ist der   R-Wert    gegenüber   B15    0,70. 



  
 



  Process for the preparation of cobalticorrinoids
Vitamin B1. plays an important role in many biochemical processes, especially in the synthesis of nucleic acids. This vitamin is probably active in some of these processes in the form of an adenosyl derivative, which can be referred to as vitamin B12 coenzyme, and the use of this coenzyme for the treatment of malignant anemia (anemia perniciosa) has already been proposed. The exact function of this coenzyme in the metabolism of cells is the subject of diligent research, and there is a need for a synthetic process for its production from the more readily available vitamin Ba2, both in normal and in radioactive form.

  It is useful if one can produce other analogues of this naturally occurring substance with the help of such a synthetic process. Various methods are available for the synthesis of vitamin B12 coenzyme and also some analogous compounds, e.g. The coenzyme form of 4-vitamin B12 is known, but these processes require lengthy purifications, and so far no nucleosides other than adenosine have been made to form derivatives of vitamin B1 or its analogues, and no vitamin B12 analogues have been modified with it Bring side chains on the pyrrole groups, which have an anti-metabolic effect, into the coenzyme form.



  Vitamin B1o has the formula
EMI2.1
 and it has been found that in the coenzyme the -CN group is replaced by the 5'-deoxy-adenosyl group ir
EMI2.2
 which is attached to the 5'-carbon atom of the ribose molecule on the central cobalt atom.



   Many analogues of vitamin B12 are known in which the molecule is modified in one or more places. E.g. various amide-bearing side chains may be modified, e.g. by removing the NH2 groups, forming free acids which can be converted into other derivatives, e.g. into esters or other amides, e.g. Aryl amides, etc. [E. Lester Smith Vitamin B12a, (Methuen)]. The 5,6-dimethylbenziminazole radical of the molecule can be replaced by other heterocyclic bases having two or more nitrogen atoms in the ring, e.g. by other benziminazole, such as benziminazole, 5-hydroxybenziminazole, naphthiminazole, or by purine or pyrinimidine bases, such as adenine, xanthine, hypoxanthine, guanine, 2-methyladenine, 8-aza-adenine, 2,6-diaminopurine, etc. (Lester Smith, Ic).



  The ribose part of the molecule can be attached to the phosphoric acid group at a different carbon atom and the isopropylamino group attached to the phosphoric acid group can be replaced by other alkylamino chains [Heinrich, Friedrich and Riedel (1961), Biochem. Time. 334, 284]. The CN group can also be replaced by another group, e.g. a hydroxyl, nitrite, thiocyanate, sulfite group. Another possibility is the complete absence of the nucleotide residue, e.g. im factor B or cobinamide (Armitage, Cannon, Johnson, Parker, Lester Smith, Stafford and Todd J.C.S. 1953, p. 3849).



   For the sake of simplicity, the vitamin Bis and its modified molecule analogues are commonly referred to as cobalticorrinoids. This designation does not only include molecules with amide groups, but also analogues of vitamin B12 with replaced or removed amide groups.



   The cobalticorrinoids are generally red or orange in color, but when they are e.g. reduced with a borohydride, a brown-colored reduced form is obtained, in which the cobalt atom is probably divalent. This reduction is reversible and the reduced brown substances are easily re-oxidized in air, but in which the anion bound to the cobalt atom is generally replaced by OH if the oxidation takes place in the presence of water. Such compounds may be called reduced cobalticorrinoids.



   The reduction can, however, be continued, giving gray-green colored products Beavan and Johnson (1955), Nature, 176, 1264. Such compounds are referred to as completely reduced cobalticorrinoids. These fully reduced cobalticorrinoids, like the brown-colored reduced cobalticorrinoids, are easily oxidizable in the presence of water, e.g. by the action of air, and thereby deliver the corresponding hydroxocobalticorrinoids.



   As shown, the nucleoside residue in vitamin B, 2-coenzyme is linked to the central cobalt atom by a carbon-cobalt bond. With the aid of the process according to the invention it is possible to produce cobalticorrinoid derivatives in which an organic group is connected to the central cobalt atom by a carbon-cobalt bond, similar to the vitamin B12 coenzyme, and the process can also be used for the production of this coenzyme even from vitamin Bl. The process is also suitable for the production of analogous compounds with a sulfur-cobalt bond, eg of sulfonyl derivatives.



   It has been shown that cobalticorrinoid derivatives can be prepared by reacting completely reduced cobalticorrinoids with acylating or similar agents, it being possible to introduce an acyl group containing the carbonyl or sulfonyl group at the cobalt atom. Such agents particularly include compounds of the formula RX in which X is an anion-forming substituent, e.g. represents a halogen atom, a sulfate, phosphate, sulfonate or oxalate radical, and R represents an acyl group of a carboxylic acid or an alkylsulfonyl, arylsulfonyl or aralkylsulfonyl group.



   So that the starting material is not oxidized, the reaction should be carried out under non-oxidizing conditions.



   The invention therefore relates to a process for the preparation of cobalticorrinoids with a group R bonded to the cobalt atom, which is an acyl radical of a carboxylic acid or an alkylsulfonyl, aralkylsulfonyl or arylsulfonyl group, which is characterized in that a cobalticorrinoid is reduced until the cobalt atom is monovalent Form is present and then introduces the group R by reaction with an agent releasing the radical R under non-oxidizing conditions.



   The substituent X in the mean RX can e.g. be a chlorine, bromine or iodine atom. The group R can be an acyl group e.g. an acetyl, propionyl or benzoyl radical.



   In anhydrides, R can be an acyl group, while X is an acyloxy group derived from a carboxylic acid.



   The reaction between the compound RX and the completely reduced cobalticorrinoid is preferably carried out in an inert solvent, expediently in a polar solvent. Water, alkanols such as methanol and ethynol, and substituted amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide can be used.



   The non-oxidizing conditions can be achieved if the reaction is carried out in an inert atmosphere, e.g. under nitrogen. It is particularly useful the cobalticorrinoid e.g. with a metal hydride, such as alkali borohydride, and possibly to add the other reactants directly to the solution without destroying or removing the excess reducing agent and without isolating the completely reduced cobalticorrinoid. Excess borohydride can be decomposed after the reduction of the cobalticorrinoid is complete before or after the addition of the other reactant, e.g. with an organic acid such as acetic acid. Other useful reducing agents are compounds with low valent metal ions, e.g. Corm II acetate, zinc and acetic acid or hydrogen gas in the presence of a catalyst such as platinum oxide.



   A hydrocobalticorrinoid is expediently used as the cobalticorrinoid. Although cyano- or sulfitocobalticorrinoids etc. can also be used, it is generally advisable to remove the released HCN or 50 prior to the condensing introduction, because these act similarly to the condensing agent and restore the original cobalticorrinoid. For example, starting from cyanocobalamin, the solution formed during the reduction is acidified and heated under reduced pressure in order to remove the HCN formed.



   The vitamin B12 derivatives obtainable according to the invention are of particular value in the experimental investigation of the vitamin B, 2 metabolism and in the therapy based thereon. The acyl derivatives are particularly valuable as antimetabolites of the natural coenzyme, as they inhibit processes in which the vitamin plays an essential role. The coenzyme analogs, which are formed from those vitamin B,> analogs which per se have an antimetabolic effect, are particularly useful.



   Example I.
Preparation of the acetyl analog.



   50 mg of hydrocobalamin are reduced with chromium acetate in 7.5 ml of EDTA buffer at pH 10 in a nitrogen atmosphere to a gray-green substance. After adding 0.25 ml of acetyl chloride, the solution turned orange-red almost immediately. After 45 minutes at room temperature, the mixture is processed further. Any remaining reduced vitamin B12 can be oxidized and separated by admitting air at room temperature.



  The product obtained can be worked up further by neutralizing the alkaline solution with dilute hydrochloric acid and extracting it with phenol / carbon tetrachloride (3: 1) in small portions until the aqueous layer is almost colorless. The combined extracts are washed with water, mixed with approximately 10 parts carbon tetrachloride / acetone (10: 1) and shaken with small amounts of water until the red color has completely disappeared.

 

   The product is purified by chromatography on columns of CMC (carboxymethyl) cellulose (150 X 25 mm) and development with water.



   The substance emerging from the CMC column is slightly more orange in color than the coenzyme and has an absorption maximum at 510 mp instead of 520 mull. In addition, the conversion to yellow color in acid solution is complete at pH 3.5, while the coenzyme requires an acid to pH 2 before the conversion is complete. Otherwise the spectrum is similar to that of the coenzyme.



  The yield determined by spectroscopy is 31 mg.



  The product crystallizes from aqueous acetone in long red needles (yield 27 mg). It inhibits the natural coenzyme to a significant extent in the enzyme experiment.



   Example 2 Manufacture of the p-Tollrolsulfonyl (tosyl) analog
Hydroxocobalamin is completely reduced with chromium acetate in an EDTA buffer at pH 10 in a nitrogen atmosphere. A considerable excess of p-toluenesulfonyl chloride, dissolved in ethanol, is added.



  The color changes from almost black to red immediately. The reaction mixture is processed further by phenol extraction and it is found that the phenol extract turns green after washing with dilute hydrochloric acid and dark red after washing with water. The aqueous solution is purified by passing it through columns of DEAE and CM cellulose, the latter of which retain very little color. The tosyl analog passes through with only a slight delay. The emerging material is concentrated and, after adding acetone, crystallizes in almost black needles. The absorption spectrum lies between that of the cobalamin and the coenzyme. It shows a peak in the visible range at 520 myS, a diffraction at 365 mp and a weak peak at 351 months.



  The intensity ratio at 350 and 520 ml is 2.8 compared to 3.4 for hydroxycobalamin and 1.75 for the coenzyme.



   Example 3 Preparation of the acetyian analog
100 mg of hydrocobalamin are reduced to a greenish-black substance with sodium borohydride. Then you add excess ethyl acetate, but this does not convert, as the unchanged color after 15 minutes shows. Acetic anhydride is then added, which immediately changes the color to orange-red. The reaction mixture is processed further using phenol / carbon tetrachloride and purified from DEAE and CM cellulose in columns. It is crystallized from aqueous acetone. According to paper chromatography, the product has an R value for B12 of 1.40, the same as the product according to Example 1.

 

   Example 4 Manufacture of MetSlanslllfonyl- (Mesyl) -AsTalogen
100 mg of hydroxocobalamin are reduced with 50 mg of chromium acetate in 10 ml of EDTA buffer at pH 10. After 15 minutes, 0.25 ml of methanesulfonyl chloride are added. The color changes immediately from dark green to red. After 15 minutes, extraction and purification are carried out as described in previous examples. The yield of purple-black crystals is 50 mg.



   The absorption spectrum shows peaks at 363 and 52f> and is very similar to the spectrum of the tosyl compound described in Example 1. According to paper chromatography, the R value compared to B15 is 0.70.

Claims

PATENT CLAIM

Process for the preparation of cobalticorrinoids with a group R bonded to the cobalt atom, which is an acyl radical of a carboxylic acid or an alkylsulfonyl, aralkylsulfonyl or arylsulfonyl group, characterized in that a cobalticorrinoid is reduced until the cobalt atom is in a monovalent form and then introduces the group R by reaction with an agent which releases the radical R under non-oxidizing conditions.

SUBCLAIMS 1. The method according to claim, characterized in that a compound of the formula RX, wherein X is an anion-forming substituent, is used as the agent.

2. The method according to dependent claim 1, characterized in that X is a halogen atom or the residue of a strong inorganic or organic acid.

3. The method according to dependent claim 2, characterized in that X is a chlorine, bromine or iodine atom, an aryl, aralkyl or alkylsulfonate radical or a sulfate or phosphate radical.

4. The method according to dependent claim 3, characterized in that R is a methanesulfonyl or p-toluenesulfonyl group or an acetyl group.

5. The method according to claim, characterized in that the acylating agent used is a carboxylic acid anhydride.

6. The method according to claim, characterized in that the starting material used is vitamin B12.

7. The method according to claim, characterized in that a vitamin B1 ..- monocarboxylic acid or its anilide or lactam is used as the starting material.

8. The method according to claim, characterized in that the condensation is carried out in an inert solvent.

9. The method according to dependent claim 9, characterized in that the inert solvent is polar.

10. The method according to dependent claim 10, characterized in that the polar solvent is water.

an alkanol or a substituted amide is used.

11. The method according to claim, characterized in that the starting material used is hydroxo-, cyano-, sulfito-, thiocyanato- or nitritocobalticorrinoid.

12. The method according to claim, characterized. that the reduced cobalticorrinoid is processed further immediately after its production without its isolation.

13. The method according to claim, characterized in that the product obtained from the starting material by reduction using a metal hydride, a metal ion of lower valence, a metal-dissolving reducing agent or using hydrogen in the presence of a hydrogenation catalyst is further processed without intermediate isolation.

14. The method according to dependent claim 12 or 13, characterized. that the excess of the agent used to reduce the cobalticorrinoid is decomposed before, during or after the condensing introduction of the R group.

15. The method according to claim, characterized in that the condensation is carried out in an inert atmosphere.

16. The method according to dependent claim 15, characterized in that the condensation is carried out in a nitrogen atmosphere.