CH512482A

CH512482A - Verfahren zur Herstellung von Cobalticorrinoiden

Info

Publication number: CH512482A
Application number: CH1718768A
Authority: CH
Inventors: Lester Smith Ernest; Mervyn Leonhard; Malcolm Victor
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1961-12-11
Filing date: 1962-11-12
Publication date: 1971-09-15

Description

Verfahren zur Herstellung von Cobalticorrinoiden
Vitamin B1. spielt in vielen biochemischen Prozessen, besonders bei der Synthese von Nucleinsäuren, eine wichtige Rolle. Wahrscheinlich ist dieses Vitamin in manchen dieser Prozesse in Gestalt eines Adenosyl-Derivates wirksam, welches als Vitamin Bl2-Coenzym bezeichnet werden kann, und man hat schon die Verwendung dieses Coenzyms für die Behandlung der bösartigen Blutarmut (anaemia perniciosa) vorgeschlagen. Die genaue Funktion dieses Coenzyms im Metabolismus der Zellen bildet den Gegenstand emsiger Forschung, und es besteht ein Bedarf für ein synthetisches Verfahren zu dessen Herstellung aus dem leichter erhältlichen Vitamin Ba2, sowohl in normaler als auch in radioaktiver Form.

Es ist zweckmässig, wenn man mit Hilfe eines solchen synthetischen Verfahrens auch andere Analoge dieses in der Natur vorkommenden Stoffes herstellen kann. Es sind verschiedene Verfahren für die Synthese von Vitamin B12-coenzym und auch von einigen analogen Verbindungen, z.B. der Coenzymform von 4-Vitamin B12 bekannt, aber diese Verfahren setzen langwierige Reinigungen voraus, und es konnten bisher keine anderen Nucleoside als Adenosin zur Bildung von Derivaten des Vitamins B1 oder seiner Analogen gebracht werden, und man konnte auch keine Vitamin B12-Analoge mit modifizierten Seitenketten an den Pyrrolgruppen, welche eine anti-metabolische Wirkung ausüben, in die Coenzymform bringen.

Vitamin B1o hat die Formel
EMI2.1
und es hat sich herausgestellt, dass im Coenzym die -CN Gruppe durch die 5'-Deoxy-adenosylgruppe ir
EMI2.2
ersetzt ist, welche mit dem 5'-Kohlenstoffatom des Ribosemoleküls am zentralen Kobaltatom hängt.

Es sind viele Analoge von Vitamin B12 bekannt, in denen das Molekül an einer oder mehreren Stellen modifiziert ist. Es können z.B. verschiedene, Amide tragende Seitenketten modifiziert sein, z.B. durch Entfernen der NH2-Gruppen, wobei sich freie Säuren bilden, die man in andere Derivate umwandeln kann, z.B. in Ester oder andere Amide, z.B. Arylamide, usw. [E. Lester Smith Vitamin B12a, (Methuen)]. Man kann den 5,6-Dimethyl -benziminazolrest des Moleküls durch andere heterocyclische Basen ersetzen, die zwei oder mehr Stickstoffatome im Ring haben, z.B. durch andere Benziminazole, wie Benziminazol, 5-Hydroxybenziminazol, Naphthiminazol, oder durch Purin- oder Pyrinimidinbasen, wie Adenin, Xanthin, Hypoxanthin, Guanin, 2-Methyladenin, 8 -Aza-adenin, 2,6-Diaminopurin usw. (Lester Smith, I.c.).

Der Riboseteil des Moleküls kann an einem anderen Kohlenstoffatom an die Phosphorsäuregruppe gebunden sein und die mit der Phosphorsäuregruppe verbundene Isopropylaminogruppe kann durch andere Alkylaminoketten ersetzt werden [Heinrich, Friedrich und Riedel (1961), Biochem. Zeit. 334, 284]. Man kann auch die CN-Gruppe durch eine andere Gruppe ersetzen, z.B., eine Hydroxyl-, Nitrit-, Thiocyanat-, Sulfitgruppe. Eine weitere Möglichkeit ist die völlige Abwesenheit des Nucleotid Restes, z.B. im Faktor B oder Cobinamid (Armitage, Cannon, Johnson, Parker, Lester Smith, Stafford und Todd J.C.S. 1953, S. 3849).

Der Einfachheit halber werden das Vitamin Bis und seine Analoge mit abgeändertem Molekül allgemein als Cobalticorrinoide bezeichnet. Diese Bezeichnung um- fasst aber nicht nur Moleküle mit Amidgruppen, sondern auch Analoge von Vitamin B12 mit ersetzten oder entfernten Amidgruppen.

Die Cobalticorrinoide sind im allgemeinen rot oder orange gefärbt, wenn man sie aber z.B. mit einem Borhydrid reduziert, erhält man eine braungefärbte reduzierte Form, in welches das Cobaltatom wahrscheinlich zweiwertig ist. Diese Reduktion ist reversibel und die reduzierten braunen Stoffe werden an der Luft leicht wieder oxydiert, in denen aber das an das Cobaltatom gebundene Anion im allgemeinen durch OH ersetzt ist, wenn die Oxydation in Gegenwart von Wasser erfolgt. Solche Verbindungen seien reduzierte Cobalticorrinoide genannt.

Die Reduktion kann aber weiter geführt werden, wobei man graugrün gefärbte Produkte erhält Beavan und Johnson (1955), Nature, 176, 1264. Solche Verbindungen werden als vollständig reduzierte Cobalticorrinoide bezeichnet. Diese vollständig reduzierten Cobalticorrinoide sind ebenso wie die braungefärbten reduzierten Cobalticorrinoide leicht oxydierbar in Gegenwart von Wasser, z.B. durch die Einwirkung von Luft, und liefern dabei die entsprechenden Hydroxocobalticorrinoide.

Wie gezeigt wird, ist der Nucleosid-Rest im Vitamin B,2-Coenzym mit dem zentralen Cobaltatom durch eine Kohlenstoff-Cobaltbindung verbunden. Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens ist es möglich, solche Cobalticorrinoid-Derivate herzustellen in denen eine organische Gruppe mit dem zentralen Cobaltatom durch eine Kohlenstoff-Cobaltbindung verbunden ist, ähnlich wie beim Vitamin-B12-Coenzym, und das Verfahren ist auch anwendbar zur Herstellung dieses Coenzyms selbst aus Vitamin Bl. Das Verfahren ist aber auch zur Herstellung von analogen Verbindungen mit einer Schwefel-Cobaltbindung, z.B. von Sulfonylderivaten, anwendbar.

Es hat sich gezeigt, dass man Cobalticorrinoid-Derivate herstellen kann durch Umsetzung von vollständig reduzierten Cobalticorrinoiden mit acylierenden oder ähnlichen Mitteln, wobei man eine die Carbonyl- oder Sulfonylgruppe enthaltende Acylgruppe beim Cobaltatom einführen kann. Solche Mittel umfassen insbesondere Verbindungen der Formel RX, in welcher X ein anionenbildender Substituent ist, z.B. ein Halogenatom, ein Sulfat-, Phosphat-, Sulfonat oder Oxalatrest, und R eine Acylgruppe einer Carbonsäure oder eine Alkylsulfonyl-, Arylsulfonyl- oder Aralkylsulfonylgruppe bedeutet.

Damit das Ausgangsmaterial nicht oxydiert wird, soll die Umsetzung unter nichtoxydierenden Bedingungen durchgeführt werden.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Cobalticorrinoiden mit einer an das Cobaltatom gebundenen Gruppe R, die ein Acylrest einer Carbonsäure oder eine Alkylsulfonyl-, Aralkylsulfonyl- oder Arylsulfonylgruppe ist, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Cobalticorrinoid reduziert bis das Cobaltatom in einwertiger Form vorliegt und dann unter nichtoxydierenden Bedingungen die Gruppe R durch Umsetzung mit einem den Rest R abgebenden Mittel einführt.

Der Substituent X im Mittel RX kann z.B. ein Chlor-, Brom- oder Jodatom sein. Die Gruppe R kann dabei eine Acylgruppe z.B. ein Acetyl-, Propionyl- oder Benzoylrest, sein.

In Anhydriden kann R eine Acylgruppe sein, während X eine von einer Carbonsäure abgeleitete Acyloxygruppe darstellt.

Die Reaktion zwischen der Verbindung RX und dem vollständig reduzierten Cobalticorrinoid wird vorzugsweise in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt, zweckmässig in einem polaren Lösungsmittel. Brauchbar sind Wasser, Alkanole, wie Methanol und Äthynol, und substituierte Amide, wie Dimethylformamid und Dimethylacetamid.

Die nichtoxydierenden Bedingungen können erzielt werden, wenn man die Umsetzung in einer inerten Atmosphäre, z.B. unter Stickstoff, durchführt. Besonders zweckmässig ist es das Cobalticorrinoid z.B. mit einem Metallhydrid, wie Alkaliborhydrid, zu reduzieren und eventuell ohne Zerstörung oder Entfernung des überschüssigen Reduziermittels und ohne Isolierung des vollständig reduzierten Cobalticorrinoids den anderen Reaktionsteilnehmer unmittelbar der Lösung zuzusetzen. Man kann überschüssiges Borhydrid nach beendigter Reduktion des Cobalticorrinoids vor oder nach Zusetzen des anderen Reaktionsteilnehmers zersetzen, z.B. mit einer organischen Säure, wie Essigsäure. Andere brauchbare Reduktionsmittel sind Verbindungen mit niedrigwertigen Metallionen, z.B. Corm-II-acetat, Zink- und Essigsgure oder Wasserstoffgas in Gegenwart eines Katalysators, wie Platinoxyd.

Als Cobalticorrinoid verwendet man zweckmässig ein Hydrocobalticorrinoid. Obwohl man Cyano- oder Sulfitocobalticorrinoide usw. auch verwenden kann, ist es im allgemeinen empfehlenswert, das freiwerdende HCN oder 50 vor der kondensierenden Einführung zu entfernen, weil diese ähnlich wirken wie das kondensierende Mittel und bilden das ursprüngliche Cobalticorrinoid wieder zurück. So säuert man z.B., wenn man von Cyanocobalamin ausgeht, die bei der Reduktion gebildete Lösung an und erwärmt sie unter vermindertem Druck, um das gebildete HCN zu entfernen.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Derivate von Vitamin B12 sind von besonderem Wert bei der experimentellen Untersuchung des Vitamin B,2-Metabolismus und bei der darauf gegründeten Therapie. Die Acylderivate sind besonders als Antimetabolite des natürlichen Coenzymes wertvoll, indem sie Prozesse hemmen, in welchen das Vitamin eine wesentliche Rolle spielt. Von grosser Brauchbarkeit sind insbesondere die Coenzym-Analoge, welche aus solchen Vitamin-B, > -Analogen gebildet werden, welche an sich antimetabolisch wirken.

Beispiel I
Herstellung des Acetylanalogen.

50 mg Hydrocobalamin werden mit Chromacetat in 7,5 ml EDTA-Puffer bei pH 10 in Stickstoffatmosphäre zu einem graugrünen Stoff reduziert. Nach Zugabe von 0,25 ml Acetylchlorid schlägt die Lösung fast augenblicklich in orangerot um. Nach 45 Minuten bei Zimmertemperatur wird die Mischung weiterverarbeitet. Etwa verbliebenes reduziertes Vitamin B12 kann durch Luftzutritt bei Zimmertemperatur oxydiert und abgetrennt werden.

Das erhaltene Produkt kann weiter aufgearbeitet werden, indem man die alkalische Lösung mit verdünnter Salzsäure neutralisiert und mit Phenol/Tetrachlorkohlenstoff (3 :1) in kleinen Anteilen extrahiert, bis die wässrige Schicht beinahe farblos ist. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, mit ungefähr 10 Teilen Tetrachlorkohlenstoff/Aceton (10:1) gemischt und mit kleinen Anteilen Wasser geschüttelt, bis die rote Farbe gänzlich verschwunden ist.

Durch Chromatographie wird das Produkt an Säulen von CMC (Carboxymethyl)-cellulose (150 X 25 mm) und Entwicklung mit Wasser, gereinigt.

Der aus der CMC-Säule austretende Stoff ist etwas stärker orangefarbig als das Coenzym und hat ein Absorptionsmaximum bei 510 mp anstatt bei 520 mull. Ausserdem ist die Umwandlung zu gelber Farbe in Säurelösung bei pH 3,5 beendet, -während das Coenzym ein An säuren auf pH 2 erfordert, bevor die Umwandlung bet endet ist. Sonst ähnelt das Spektrum dem des Coenzyms.

Die spektroskopisch ermittelte Ausbeute beträgt 31 mg.

Das Produkt kristallisiert aus wässrigem Aceton in langen roten Nadeln (Ausbeute 27 mg). Es hemmt das natürliche Coenzym im Enzymversuch in bedeutendem Masse.

Beispiel 2 Herstelltç7zg des p-Tollrolsulfonyl-(Tosyl)-A nalogen
Hydroxocobalamin wird mit Chromacetat in einem EDTA-Puffer hei pH 10 in einer Stickstoffatmosphäre vollständig reduziert. Man gibt einen beträchtlichen Überschuss an p-Toluolsulfonylchlorid, gelöst in Äthanol, zu.

Die Farbe ändert sich von fast schwarz sofort zu rot. Man verarbeitet das Reaktionsgemisch weiter durch Phenolextraktion und stellt fest, dass nach Waschen mit verdünnter Salzsäure der Phenolextrakt grün und nach Waschen mit Wasser dunkelrot wird. Die wässrige Lösung wird mittels Hindurchleitens durch Säulen von DEAE- und CM-Cellulose gereinigt, welch letztere sehr wenig Farbe zurückhalten. Das Tosylanaloge läuft mit nur geringer Verzögerung hindurch. Das ausstretende Material wird konzentriert und nach Zugabe von Aceton in fast schwarzen Nadeln kristallisiert. Das Absorptionsspektrum liegt zwischen dem des Cobalamins und des Coenzyms. Es zeigt eine Spitze im sichtbaren Bereich bei 520 myS, eine Beugung bei 365 mp und eine schwache Spitze bei 351 mtl.

Das Intensitätsverhältnis bei 350 und 520 mll ist 2,8 verglichen mit 3,4 für Hydroxycobalamin und 1,75 für das Coenzym.

Beispiel 3 Alerstelllmg des A cetyianalogen
100 mg Hydrocobalamin werden mit Natriumborhvdrid zu einem grünlich-schwarzen Stoff reduziert. Dann setzt man überschüssiges Äthylaceiat zu, das sich jedoch nicht umsetzt, wie die unveränderte Farbe nach 15 Minuten beweist. Darauf gibt man Essigsäureanhydrid zu, wodurch sich die Farbe sofort in orangerot ändert. Das Re tktionsgemisch wird über Phenol /Tetrachlorkohlenstoff weiterverarbeitet und in Säulen von DEAE- und CM-Cellulose gereinigt. Es wird aus wässrigem Aceton kristallisiert. Nach Papierchromatographie hat das Produkt einen R-Wert gegenüber B12 von 1,40, den gleichen wie das Produkt nach Beispiel 1.

Beispiel 4 Herstei!nrlg des MetSlanslllfonyl-(Mesyl)-AsTalogen
Man reduziert 100 mg Hydroxocobalamin mit 50 mg Chromacetat in 10 ml EDTA-Puffer bei pH 10. Nach 15 Minuten werden 0,25 ml Methansulfonylchlorid zugegeben. Die Farbe schlägt sofort von dunkelgrün in rot um. Nach 15 Minuten wird extrahiert und gereinigt, wie in früheren Beispielen beschrrieben. Die Ausbeute an purpur-schwarzen Kristallen beträgt 50 mg.

Das Absorptionsspektrum zeigt Spitzen bei 363 und 52f > und ist dem Spektrum der in Beispiel 1 beschrie- benen Tosylverbindung sehr ähnlich. Nach Papierchroma tographie ist der R-Wert gegenüber B15 0,70.

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur Herstellung von Cobalticorrinoiden mit einer an das Cobaltatom gebundenen Gruppe R, die ein Acylrest einer Carbonsäure oder eine Alkylsulfonyl-, Aralkylsulfonyl- oder Arylsulfonylgruppe ist, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Cobalticorrinoid reduziert, bis das Cobaltatom in einwertiger Form vorliegt und dass man dann unter nichtoxydierenden Bedingungen die Gruppe R durch Umsetzung mit einem den Rest R abgebenden Mittel einführt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mittel eine Verbindung der Formel RX, worin X ein anionbildender Substituent ist, verwendet.

2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X ein Halogenatom oder der Rest einer starken anorganischen oder organischen Säure ist.

3. Verfahren nach Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass X ein Chlor-, Brom- oder Jodatom, ein Aryl-, Aralkyl- oder Alkylsulfonatrest oder ein Sulfatoder Phosphatrest ist.

4. Verfahren nach Unteranspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass R eine Methansulfonyl- oder p-Toluolsulfonylgruppe oder eine Acetylgruppe ist.

5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Acylierungsmittel ein Carbonsäureanhydrid verwendet.

6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Vitamin B12 verwendet.

7. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff eine Vitamin-B1..- -monocarbonsäure oder deren Anilid oder Lactam verwendet.

8. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kondensation in einem inerten Lösungsmittel durchführt.

9. Verfahren nach Unteranspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das inerte Lösungsmittel polar ist.

10. Verfahren nach Unteranspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man als polares Lösungsmittel Wasser.

einen Alkanol oder ein substituiertes Amid verwendet.

11. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Hydroxo-, Cyano-, Sulfito-, Thiocyanato- oder Nitritocobalticorrinoid verwendet.

12. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet. dass man das reduzierte Cobalticorrinoid unmittelbar anschliessend an dessen Herstellung ohne seine Isolierung weiterverarbeitet.

13. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das aus dem Ausgangsstoff durch Reduktion mittels eines Metallhydrids, eines Metallions niederer Valenz, eines metallösenden Reduziermittels oder mittels Wasserstoff in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators erhaltene Produkt ohne Zwischenisolierung weiterverarbeitet.

14. Verfahren nach Unteranspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet. dass man den Überschuss der zur Reduktion des Cobalticorrinoids verwendeten Mittels vor, während oder nach der kondensierenden Einführung der Gruppe R zersetzt.

15. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Kondensation in einer inerten Atmosphäre durchgeführt wird.

16. Verfahren nach Unteranspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Kondensation in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt wird.