CH516521A

CH516521A - Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung

Info

Publication number: CH516521A
Application number: CH1563865A
Authority: CH
Inventors: Beat Dr Iselin; Heini Dr Kappeler; Bernhard Dr Riniker; Werner Dr Rittel
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1965-11-12
Filing date: 1965-11-12
Publication date: 1971-12-15
Also published as: FI47760B; GB1164809A; NL141174B; BR6684476D0; DE1543501B2; NO126480B; BE689575A; DE1543501C3; AT292208B; FI47760C; OA105E; SE345448B; FR5849M; NL6615965A; DE1543501A1

Description

Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung
Es wurden bereits Peptide beschrieben, die sich durch eine verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden, dass sie am Aminoende als erste a-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen, vgl.

z. B. Schweizer Patent Nr. 499497.

Es wurde nun gefunden, dass ein Octadecapeptidamid, das an Stelle der Argininreste in 17,18-Stellung Lysinreste enthält, eine besonders gute adrenocorticotrope Wirkung aufweist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des D-Seryl-L-tyros y1-L-seryl-L-methionyl-Lglutamyl (oder L-glutamins)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L- arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-vaWl- giycyl-L-lysyl-L4ysyl-L-lysyl-L4ysinamids und ihrer Säureadditionssalze und Komplexe.

Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen.

Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptiden entstehen und vor allem diejenigen, die ihnen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganische Stoffe sind Verbindungen, die sich von Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle. Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z. B.

Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrin, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z. B. Protamin und insbesondere von Aminosäuren, die einen überwiegenden Anteil an sauren sz-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, aufweisen.

Die neuen Verbindungen besitzen, wie bereits erwähnt, eine wesentlich stärkere ACTH-Aktivität als die entsprechenden Verbindungen mit L-Konfiguration an der ersten Aminosäure. Sie sollen dementsprechend in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden, z. B. an Stelle des natürlichen Hormons.

Die neuen Peptide werden nach den für die Her stellung von Peptiden mit grosser Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt unter Verwendung einer D-Aminosäure als N-terniinaler Aminosäure. Dabei werden die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Hervorzuheben ist besonders auch die sogenannte Feststoffträgersynthese (vgl. Merrifield, J. Am.

Chem. Soc. 85, 2149 [1963]), bei der das Peptid vom Carboxylende, das ersterartig an ein Polymeres gebunden ist, aufgebaut wird, indem man die Aminosäuren der Reihe nach ankondensiert. Als Kondensationsmethoden sind z.B. die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode zu erwähnen. Beispielsweise kann man eines der Aminosäure- bzw. Peptidmoleküle in Form eines Esters mit einem weiteren Aminosäure- bzw. Peptidmolekül, das eine geschützte Aminogruppe enthält, in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie eines Carbodiimids oder eines Phosphorigsäureesterhalogenids, ver knüpfen, oder man kann mit dem Aminosäure bzw.

Peptidester mit freier Aminogruppe eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe), z.B. ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid (z. 13. aus N athyl-5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat, 5. Woodward et al., J.Am.Chem.Soc. 89, 1011 [1961]), oder einem aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylthiolester oder Nitrophenylester, umsetzen. Umgekehrt kann auch eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit freier Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe) mit einer Aminosäure bzw. einem Peptid mit aktivierter Aminogruppe (und geschützter Carboxylgruppe), z. B.

einem Phosphitamid, zur Reaktion gebracht werden.

An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, oder Amidbildung, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung der Tosyl-, Trityl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, Phthalyl- oder Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p(p'-Methoxy-phenylazo)-ben- zyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des tert. Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginins ist die Nitrogruppe geeignet;

die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. Die Iminogruppe des Histidins kann durch den Benzyl- oder Tritylrest geschützt werden.

Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder Iminogruppe in eine freie Gruppe sowie die tJberfüh- rung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher dadurch gekennzeichnet, dass man die zum Aufbau der neuen Peptide nötigen Aminosäuren unter Bildung von CONH Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen schützt, die Carboxylgruppe des endständigen Lysinrestes zu Beginn oder zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt, indem man das Octadecapeptid durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.

Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, dass man das die ersten 3 Aminosäuren, D-Ser-Tyr-Ser-OH enthaltende Tripeptid (die abgekürzte Schreibweise bezieht sich auf L-Aminosäuren, wenn das D- nicht besonders bezeichnet ist), oder das ausserdem die 4. Aminosäure enthaltende Tetrapeptid mit dem Heptapeptid bzw.

Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 kondensiert, vorzugsweise nach der Azidmethode, und dann das Decapeptid mit dem Octapeptidester oder -amid der Aminosäuren 11-18 kondensiert.

Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode der aktivierten Ester, vor allem mittels des pNitro- phenylesters, verwendet. Im letzten Falle braucht der p-Nitrophenylester des Decapeptids nicht als solcher isoliert zu werden, sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst aus dem Decapeptid mit freier Carboxylgruppe, pNitrophenol und Dicyclohexylcarbodiimid gebildet werden. Das Decapeptid liegt also als a-Aminogeschütztes Peptid mit freier Carboxylgruppe oder mit einer pNitrophenylestergruppe vor. Die in den zu kondensierenden Peptidbruchstücken vorhandenen Seitenketten-Aminogruppen werden vorzugsweise durch die tert. - Butyloxycarbonylgruppe, die Carboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe geschützt.

Diese Schutzgruppen können in der letzten Stufe mit Trifluoressigsäure abgespalten werden.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.

B. solche nut anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwassertoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Amino- benzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Amino-salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Athansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure,

p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.

Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.

Man kann sie auch mit den in der ACTH-Therapie üblichen Zusätzen zur Verlängerung der Wirkung, wie z. B. Oxypolygelatine, Polyphloretinphosphat, Carboxymethylcellulose, oder den oben erwähnten schwerlöslichen Metallverbindungen, insbesondere Phosphaten, Pyrophosphaten oder Hydroxyden des Zinks, kombinieren.

In den folgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.

Die dünnschichtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet: System 43A: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (100 :40:10) System 43C: tert.-Amylalkohol-Tsopropanol-Wasser (100 :40: 55) System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser (100:10: 30) System 52A: n-Butanol-Eisessig-Wasser (67: 10: 23) System 100: Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6:11) System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (30:20:6:24)
Folgende Abkürzungen werden verwendet:
Z = Carbobenzoxy
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl tBu = tert.-Butyl.

Beispiel I 1. Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2
5 g ZLys(BOC > Lys(BOC)-OCH3 werden in 100 ml absolutem Methanol gelöst, bei Zimmertemperatur mit Ammoniakgas gesättigt und während 30 Stunden im verschlossenen Kolben stehengelassen. Die Lösung wird dann auf etwa 25 ml eingeengt und zur Kristallisation über Nacht in den Eisschrank gestellt. Man filtriert ab, wäscht mit ein wenig kaltem Methanol und trocknet die Kristalle im Vakuum. Man erhält 3,95 g Z-Lys(BOC) Lys(BOC)-NH2 vom F. = 1650.

Die Verbindung zeigt bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel folgende Rf-Werte:
Rf (Chloroform-Methanol = 95 : 5) = 0,11
Rf (Chloroform-Methanol = 8 : 2) = 0,75
Rf (43A) = 0,76
Das als Ausgangsmaterial verwendete Z-Lys(BOC) Lys(BOC)-OCH-3, F. 78-840 kann aus Z-Lys(BOC)-OH und H-Lys(BOC)-OCHn (vgl. belg. Patent Nr. 594 338) durch Kondensation mittels Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt werden.

2. H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH2
3 g Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH2 werden unter leichtem Erwärmen in 100 ml Methanol gelöst und mit 500 mg Palladiumkohle (10% Pd) in der Schüttelente unter Absorption des sich bildenden Kohlendioxyds-bei Raumtemperatur hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist nach etwa 1 Stunde beendet, und nach einer weiteren Stunde wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Das in quantitativer Ausbeute erhaltene Rohprodukt wird aus Essigester-Petroläther umkristallisiert und weist dann einen F. von 110-1120 auf.

Auf Silicagel ergeben sich folgende Rf-Werte:
Rf (Chloroform-Methanol = 8 : 2) = 0,32
Rf (43A) = 0,35
Rf (52) = 0,65 3. Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)- Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2
5,13 g Z-Lys (B OC)-Pro-Val-Gly-Lys (BOC)-Lys(BOC)-
NHNH2 (schweiz. Patent Nr. 485 6703 werden in 60 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und auf - 250 abgekühlt.

Bei dieser Temperatur gibt man tropfenweise unter Rühren 8,8 ml 2,1 15n Salzsäure hinzu und zuletzt noch 0,973 ml 5n Natriumnitritlösung. Die Reaktionslösung wird während 15 Minuten bei - 100 gerührt, worauf man eine auf -100 vorgekühlte Lösung von 2,0 g
H-Lys (B GC)-Lys(B O C) -NH2 in 10 ml Dimethylformamid zufügt und dann noch 2,6 ml Triäthylamin zutropft. Man rührt während 30 Minuten bei 0 und lässt dann während etwa 20 Stunden bei 0 stehen. Zur Isolierung des Rohproduktes engt man auf etwa 30 ml ein, fällt durch Zugabe von 150 ml Wasser und filtriert den flockig-gallertigen Niederschlag ab.

Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Methanol-Wasser (2: 1) wird das geschützte Octapeptid in feinkristallisierter und chromatographisch reiner Form vom F. = 220-2210 (Zersetzung) erhalten. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:
Rf (Chloroform-Methanol = 9 :1) = 0,47
Rf (43A) = 0,75 4. H-Lys(B OC)-Pro-Val-Gly-Lys (B OC)-Lys(BOC)- Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2
1,0 g der oben beschriebenen Carbobenzoxy-Verbindung wird in 250 ml Methanol gelöst und mit 200 mg Palladiumkohle (10% Pd) in der Schüttelente bei Zimmertemperatur und unter Kohlendioxyd-Absorption hydriert.

Nach 6 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockene eingeengt und der Rückstand noch zweimal aus Methanol-Wasser umgefällt. Man erhält 738 mg chromatographisch einheitliches Octapeptidderivat, das auf Silicagel die folgenden Rf-Werte aufweist:
Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,14
Rf (52) = 0,63
Rf (43A) = 0,28 5. B OC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg- Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-
Lys(BOC)-Lys(BOC) -Lys(B OC)-NH2
988 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His Phe-Arg-Try-Gly-OH und 736 mg H-Lys(BOC)-Pro-Val Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC3-NH2 werden in 20 ml Pyridin suspendiert und nach Zugabe von 0,3 ml Wasser und 0,835 ml 1n Salzsäure während 15 Minuten bei 500 gerührt.

Nach Zugabe von 378 mg Dicyclohexylcarbodiimid rührt man während 3 Stunden bei 500, gibt dann nochmals gleich viel Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt weitere 3 Stunden bei 500 und engt dann bis zur Blildung eines halbfesten Rückstandes ein. Durch Erwärmen mit 20 ml Dimethylformamid werden die Peptide gelöst und durch Filtration vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff abgetrennt.

Das Filtrat wird bis zur Bildung eines dickflüssigen Rückstandes eingeengt und daraus durch Zugabe von 50 ml Wasser ein schmieriges Rohprodukt ausgefällt, das von der Mutterlauge abgetrennt und getrocknet wird. Durch zweimaliges Umfällen aus Dimethylformamid-Methanol-Essigester erhält man 1,29 g Rohprodukt, das zur endgültigen Reinigung einer Craig-Verteilung im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloro form-Tetrachlorkohlenstoff (10 : 3 : 7 :

4) [Puffer = 28,5 ml Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat in 960 ml Wassers mit Phasenvolumina von je 10 ml unterworfen wird. (Zu Beginn wird die Substanz gleichmässig verteilt in die ersten 5 Elemente eingefüllt.) Nach 171 Stufen isoliert man aus den Elementen Nr. 50-74 (rmax = 62; K=0,57) durch Einengen zur Trockene und Absublimieren des Ammoniumacetates bei 400 im Hochvakuum das dünnschichtchromatographisch einheitliche ge schützte Octadecapeptid-amid als reines, amorphes Pulver vom F. = etwa 210-2250 (Zersetzung). Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:
Rf (Chloroform-Methanol = 75 : 25) = 0,51
Rf (43C) = 0,62
Rf (52) = 0,55
Rf (100) = 0,43
Das als Ausgangsstoff verwendete Decapeptidderivat ist im Hauptpatent beschrieben.

6. H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-ArgTry-Gly- Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 (D-Ser1-Lys97Bt8-ss - 8-Corticotropin-Lys18-amid)
400 mg geschütztes Octadecapeptid-amid werden in 8 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und während 30 Minuten bei 250 stehengelassen. Man engt sodann auf ein Volumen von etwa 3 ml ein, gibt 20 ml Wasser zu, engt nochmals ein und lyophiliert. Das so erhaltene Trifluoracetat des Octadecapeptid-amides wird zur Umwandlung in das Acetat in wenig Wasser gelöst und langsam durch eine Säule (O = 11 mm; 1 = 16 cm) von schwach basischem Ionenaustauscher (z. B. Merck Nr. II) in der Acetatform filtriert. Das Eluat wird auf ein kleines Volumen konzentriert, lyophilisiert und bei 400 im Hochvakuum nachgetrocknet.

Man erhält 301 mg chromatographisch und elektrophoretisch einheitliches Acetat des D-Ser1-Lys17'18-ss1 - 18-Corticotropin-Lys18-amids als amorphes, weisses Pulver von unscharfem Zersetzungspunkt bei etwa 170-180 . Im Dünnschichtchromatogramm an Aluminiumoxyd werden folgende Rf-Werte erhalten:
Rf (52A) = 0,13
Rf (101) = 0,32
Bei der Papierelektrophorese (16 Volt/cm) bei pH 6,1 (Pyridinacetatpuffer) läuft die Verbindung in 2 Stunden 11,5 cm gegen die Kathode.

Beispiel 2
Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her:
Acetat des D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18
Corticotropin-Lys'8-amids 0,5 mg
ZnSO4 + 7 H2O 1,23 mg
Na3PO4 + 12 H2O 1,38 mg
Mannit 40,0 mg
Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 1 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt. Man erhält eine Suspension mit einem pH von 7,6.

Beispiel 3
Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her:
Acetat des D-serl-Lysl7ls-,g1- 18¯
Corticotropin-Lys'8-amids 0,5 mg ZnSO4+7H,O 1,23 mg
Mannit 40,0 g und eine Lösungsampulle mit folgender Zusammensetzung der Lösung: Na3PO4 + 12 H20 1,38 mg
Versene - Fe-3 0,1 mg dest. Wasser ad 1,0 ml
Vor Gebrauch werden der Inhalt der Trockenampulle und der Lösungsampulle vermischt. Die erhaltene Suspension hat ein pH von 7,6.

Beispiel 4
Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden Komponenten her:
Acetat des D-SerÚ-Lysl7,18-ss1-18-
Corticotropin-Lys18-amids 0,5 mg
Gelatine 280,0 mg
Phenol 5,0 mg dest. Wasser ad 1,0 ml
Beispiel 5
Eine steril filtrierte wässrige Lösung von D-Ser-Lyst7 - 18-Corticotropin-Lyst8-amid- acetat wird unter aseptischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphosphat und Natriumchlorid vermischt und in Vials abgefüllt und lyophilisiert, so dass ein Trockenvial erhalten wird, das folgende Komponenten enthält:
Acetat des D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18 Corticotropin-Lys's-amids 0,5 mg
N atrium-Polyphloretinphosphat (86,5%ig) 23,20 mg
NaCl 12,28 mg
Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 2 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt.

Beispiel 6
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her:
Acetat des D-Ser'-Lys17'8-ss1-'8-
Corticotropin-Lys'8-amids 1,0 mg ZnC12 10,5 mg
Na2HPO4 1,7 mg
Benzylalkohol 17,0 mg
NaCl 2,5 mg
NaOH ad pH 8,0
Aqua dest. ad 2 ml
Beispiel 7
2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 11 000 werden in etwa 5,7 ml 10% iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser'-Lyst7,t8-ss-' - 8-Corticotropin-Lys'8-amid- acetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert.

Sie enthält pro ml:
Acetat des D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18 Corticotropin-Lyst8-amids 0,5 mg Poly-Lglutaminsäure 200,0 mg
Natronlauge bis pH 7,4
Merthiolat 0,02 mg
Aqua dest. 1,0 ml
Beispiel 8
2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 10 % iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg Acetat des D-Ser'-Lys'7'18-ss' - 18-Corticotropin-Lys18-amids und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst. Zu dieser Lösung wird 1 ml einer salzsauren Zinkchloridlösung (pH 2,8) mit 5,2 mg Zinkchlorid pro ml gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml aufgefüllt.

Beispiel 9
2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 10 % iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lö- sung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg Acetat des D-Sert-Lyst7,t8,Bt - 8-Corticotropin-Lys8-amids und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 1 ml einer salzsauren Lösung (pH 2,8) enthaltend 5,2 mg Zinkchlorid und 0,85 mg Dinatriumphosphat (wasserfrei) gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt. Man füllt mit Wasser auf ein Volumen von 10 ml auf.

Beispiel 10
Man löst 11,12 mg Eisessig, 1,21 mg Natriumacetat, 2,5 mg Natriumchlorid und 2,0 mg D-5er1-Lys17'18-fl1 - 18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf. Die Lösung wird bei 1200 20 Minuten autoklaviert. Das pH ist nach der Sterilisation 3,7.

Beispiel 11
Man löst in 0,7 ml physiologischer Natriumchloridlösung 0,5 mg D-5er1-Lys17'18-ss1 18-ss1- 18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat und säuert die Lösung mit 0,in Salzsäure auf pH 3,2 an.

Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml aufgefüllt und wie in Beispiel 1 hitzesterilisiert.

Beispiel 12
In 0,8 ml destilliertem Wasser werden 7,05 ml Glycin und 6,08 mg Natriumchlorid gelöst und 0,055 ml 0,ln HC1 zugefügt. Anschliessend wird 1,0 mg
D-SerÚ-Lys17,18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat in der Lösung aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 1200 20 Minuten autoklaviert.

Das pH beträgt 3,6.

Beispiel 13
In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung von 10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml in Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0, in Salzsäure hergestellt. In dieser Lösung werden 4,0 mg
D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 0,1 ml aufgefüllt.

Das pH beträgt 3,6.

Beispiel 14
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser1-Lys'718,ss' - 18-Cortico tropin-Lyst8-amid-acetat 1,0 mg
ZnCl2 5,25 mg Na2HPO4 - 2 H20 1,05 mg
NaCl 2,0 mg
Benzylalkohol 10,0 mg
NaOH ad pH 8,3
Dest. Wasser ad 1,0 ml
Beispiel 15
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser-Lysl7il8,ss1- 18-Cortico- tropin-Lyst8-amid-acetat 1,0 mg ZnCl2 6,30 mg
Na2NPO4.2H2O 1,26 mg
NaCl 1,5 mg
Benzylalkohol 10,0 mg
NaOH ad pH 8,3
Dest.

Wasser ad 1,0 ml
Beispiel 16
Man stellt 0,5 ml einer salzsauren Lösung von 0,5 mg
D-SerÚ-Lys17,18-ss-1 - 18-Corticotropin-Lys'8-amid- acetat, 5,25 mg ZnCl2, 1,05 mg Na2HPO4 2 HoO und 2,0 mg NaCl vom pH 3,0 her und gibt die Lösung zu 0,5 ml einer wässrigen Lösung von 10 mg Benzylalkohol, die so viel Natronlauge enthält, dass eine Suspension vom pH 8,3 erhalten wird.

Beispiel 17
5 mg Poly-L-glutaminsäure vom mittleren Molekulargewicht 39 600 werden in 5 ml 0,1n Natronlauge gelöst. Man filtriert die Lösung, gibt eine Lösung von 2,5 mg D-Ser1-Lys17'18-ss' - 18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat hinzu, säuert dann mit Essigsäure oder Salzsäure auf pH 4 an und füllt mit Wasser auf 101 ml auf. Dabei fällt ein
Poly-L-glutaminsäure-D-SerÚ-Lys17,18-ss-1 - 18 Corticotropin-Lysl8-amid-Komplex fein verteilt aus. Die Suspension enthält pro ml 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure und 0,25 mg D-Ser1-Lys17'18-p-1 - 18-Corticotropin-Lys18-amld als Komplexverbindung.

Beispiel 18
2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 39 600 werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden dann 4,0 mg D-Ser1-Lys17'15-fi1 18-ss1- 18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml: D-Ser1-Lys17'18-ss-' - 18-Cortico- tropin-Lysl8-amid-acetat 4,0 mg
Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg
Natronlauge bis pH 7,4
Merthiolat 0,02 mg
Dest.

Wasser ad 1,0 ml
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH Wirkung der Formel
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl (oder L-glutaminyl) -L-histidyl-L-phenylalanyl-L- arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysin-amid und von Säureadditionssalzen dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man zu ihrem Aufbau nötige Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende reaktive funktionelle Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen intermediär schützt, die Carboxylgruppe des endständigen Lysinrestes zu Beginn oder zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt,

indem man das Octadecapeptid durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.

UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Schutzgruppe für die Aminogruppen die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und als Schutzgruppe für die Carboxylgruppen die tert.-Butylgruppe verwendet.

2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man sämtliche Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäure abspaltet.

3. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteransprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-

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Claims

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Beispiel 11 Man löst in 0,7 ml physiologischer Natriumchloridlösung 0,5 mg D-5er1-Lys17'18-ss1 18-ss1- 18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat und säuert die Lösung mit 0,in Salzsäure auf pH 3,2 an.

Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml aufgefüllt und wie in Beispiel 1 hitzesterilisiert.

Beispiel 12 In 0,8 ml destilliertem Wasser werden 7,05 ml Glycin und 6,08 mg Natriumchlorid gelöst und 0,055 ml 0,ln HC1 zugefügt. Anschliessend wird 1,0 mg D-SerÚ-Lys17,18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat in der Lösung aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 1200 20 Minuten autoklaviert.

Das pH beträgt 3,6.

Beispiel 13 In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung von 10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml in Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0, in Salzsäure hergestellt. In dieser Lösung werden 4,0 mg D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 0,1 ml aufgefüllt.

Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 1200 20 Minuten autoklaviert.

Das pH beträgt 3,6.

Beispiel 14 Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser1-Lys'718,ss' - 18-Cortico tropin-Lyst8-amid-acetat 1,0 mg ZnCl2 5,25 mg Na2HPO4 - 2 H20 1,05 mg NaCl 2,0 mg Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3 Dest. Wasser ad 1,0 ml Beispiel 15 Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser-Lysl7il8,ss1- 18-Cortico- tropin-Lyst8-amid-acetat 1,0 mg ZnCl2 6,30 mg Na2NPO4.2H2O 1,26 mg NaCl 1,5 mg Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3 Dest.

Wasser ad 1,0 ml Beispiel 16 Man stellt 0,5 ml einer salzsauren Lösung von 0,5 mg D-SerÚ-Lys17,18-ss-1 - 18-Corticotropin-Lys'8-amid- acetat, 5,25 mg ZnCl2, 1,05 mg Na2HPO4 2 HoO und 2,0 mg NaCl vom pH 3,0 her und gibt die Lösung zu 0,5 ml einer wässrigen Lösung von 10 mg Benzylalkohol, die so viel Natronlauge enthält, dass eine Suspension vom pH 8,3 erhalten wird.

Beispiel 17 5 mg Poly-L-glutaminsäure vom mittleren Molekulargewicht 39 600 werden in 5 ml 0,1n Natronlauge gelöst. Man filtriert die Lösung, gibt eine Lösung von 2,5 mg D-Ser1-Lys17'18-ss' - 18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat hinzu, säuert dann mit Essigsäure oder Salzsäure auf pH 4 an und füllt mit Wasser auf 101 ml auf. Dabei fällt ein Poly-L-glutaminsäure-D-SerÚ-Lys17,18-ss-1 - 18 Corticotropin-Lysl8-amid-Komplex fein verteilt aus. Die Suspension enthält pro ml 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure und 0,25 mg D-Ser1-Lys17'18-p-1 - 18-Corticotropin-Lys18-amld als Komplexverbindung.

Beispiel 18 2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 39 600 werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden dann 4,0 mg D-Ser1-Lys17'15-fi1 18-ss1- 18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml: D-Ser1-Lys17'18-ss-' - 18-Cortico- tropin-Lysl8-amid-acetat 4,0 mg Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg Natronlauge bis pH 7,4 Merthiolat 0,02 mg Dest.

Wasser ad 1,0 ml PATENTANSPRUCH 1 Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH Wirkung der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl (oder L-glutaminyl) -L-histidyl-L-phenylalanyl-L- arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysin-amid und von Säureadditionssalzen dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man zu ihrem Aufbau nötige Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende reaktive funktionelle Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen intermediär schützt, die Carboxylgruppe des endständigen Lysinrestes zu Beginn oder zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt,

indem man das Octadecapeptid durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Schutzgruppe für die Aminogruppen die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und als Schutzgruppe für die Carboxylgruppen die tert.-Butylgruppe verwendet.

2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man sämtliche Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäure abspaltet.

3. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteransprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-

L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl glycyl-Llysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-Llysyl-L lysyl-l-lysyl-l-lysin-amid oder seine Säureadditionssalze herstellt.

PATENTANSPRUCH II Verwendung der nach dem Verfahren von Patentanspruch I erhaltenen Peptide zur Herstellung von entsprechenden Peptid-Komplexen mit verlängerter Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man Komplexe mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat und/oder Zinkhydroxid dadurch herstellt, dass man eine saure wässrige Lösung, welche das Peptid und ein wasserlösliches Zinksalz enthält, mit einem Alkalimetallhydroxid-phosphat oder-pyrophosphat umsetzt und das pH auf 7-8 einstellt.