CH517074A - Verfahren zur Herstellung neuer hypocalcämischer Peptide - Google Patents

Verfahren zur Herstellung neuer hypocalcämischer Peptide

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Description


  
 



  Verfahren zur Herstellung neuer hypocalcämischer Peptide
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des neuen hypocalcämisch wirksamen Peptids der Formel I H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala   Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe- Ser-Gly-Met[oder Met(O)] -Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-    Thr-Pro-OH und entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste in den Stellungen 3, 15, 17 und 18 durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest, in Stellung 30 durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest, in Stellung 25 durch den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin- oder Norleucinrest ersetzt sind, ihrer C-terminalen Amide und Säureadditionssalze und Komplexe der genannten Verbindungen.



   Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwer lösliche Salze wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate zu nennen.



   Unter Komplexen sind die in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu langkettigen Peptiden entstehen und diesen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche Stoffe sind beispielsweise beschrieben für ACTH und andere adrenocorticotrop wirksame Peptide. Zu nennen sind z. B. anorganische Verbindungen, die sich von Metallen wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, ferner Alkalimetallpolyphosphate wie z. B.  Calgon N ,  Calgon 322 ,  Calgon 188  oder  Polyron B 12 . Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z. B.

  Polyoxygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren,   z.B.   



  Protamin oder Polyglutaminsäure.



   Die neuen Verbindungen, insbesondere das Amid der Verbindung der Formel I, weisen eine hypocalcämische Wirkung auf. Sie senken den Plasma-, Calcium- und Phosphatgehalt des Blutes von Säugetieren, wie durch Versuche an Wistar-Ratten nachgewiesen wurde. Ferner haben sie entzündungshemmende Eigenschaften, wie am Beispiel des Kaolinödemes an der Ratte gezeigt werden konnte.



   Die Verbindungen sind auch am Menschen wirksam. Bei parenteraler Gabe von 0,01 bis 1 mg in   O,1-m.   



  Acetatpuffer vom pH 4,6 gelöstem C-terminalem Amid der Verbindung der Formel I wird das Serum-Calcium und Serum-Phosphat gesenkt.



   Diese Wirkung zeigt sich nicht nur an Hypercalcämie-Patienten, sondern an normalcalcämischen Personen, die z. B. an Osteoporose leiden.



   Die neuen Verbindungen können daher zur Behandlung von Hypercalcämie und von Knochenkrankheiten wie Osteoporose verwendet werden.



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen der Formel I und entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest durch den Glutaminrest und/ oder der Methioninrest durch einen der oben genannten Reste ersetzt sind, ihrer C-terminalen Amide und der Säureadditionssalze dieser Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren, wobei das Prolin auch als Amid vorliegen kann bzw. deren aktivierte Derivate, unter intermediärem Schutz von von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen und unter Bildung der   Disulfidbrücke zwischen Cys1 und Cys7 durch Oxydation kondensiert.



   Die erhaltenen Verbindungen können in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe übergeführt werden.



   Bei der Synthese der Endprodukte wie auch aller benötigten Zwischenprodukte verwendet man als Schutzgruppen besonders die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten sowie einige neue Schutzgruppen, die leicht abgespalten werden können,   z.B.    durch Hydrolyse, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse.



   So verwendet man   z.B.    als Schutzgruppen für Aminogruppen Acyl- oder Aralkylgruppen wie Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, 2,4-Dinitrophenylsulfenylgruppen (diese Sulfenylgruppen können auch durch Einwirkung nucleophiler Reagenzien,   z.B.    Sulfiten, Thiosulfaten, vgl. englisches Patent   1 104 271,    abgespalten werden) gegebenenfalls substituierte, wie z.B.



  durch Niederalkoxygruppen, besonders o- oder p-Methoxygruppen substituierte Benzyl-, oder Diphenyl- oder Triphenylmethylgruppen oder von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen, wie gegebenenfalls   z.B.    durch Halogenatome wie Chlor oder Brom, Nitrogruppen oder Niederalkoxygruppen substituierte Benzyl- oder Benzhydryloxycarbonylgruppen,   z.B.    Carbobenzoxy, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy oder p-Methoxycarbobenzoxy, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonyl, aliphatische Oxycarbonylgruppen wie Adamantyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Trichloräthyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl oder vor allem tert.-Butyloxycarbonyl,   aromatisch-aliphatische    Oxycarbonylgruppen wie 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl,

   2-Tolyl-isopropyloxycarbonyl und insbesondere 2-p-Diphenylisopropyloxycarbonyl (vgl. schweiz. Patent 509 266). Die Aminogruppen können auch durch Bildung von Enaminen, erhalten durch Reaktion der Aminogruppe mit 1,3 Diketonen, z. B. Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, geschützt werden.



   Carboxylgruppen werden beispielsweise durch Amid- oder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt. Die Amid- und Hydrazidgruppen können gegebenenfalls substituiert sein, die Amidgruppe   z.B.   



  durch die 3,4-Dimethoxybenzyl- oder bis-(p-Methoxyphenyl)-methylgruppe, die Hydrazidgruppe z. B. durch die Carbobenzoxygruppe, die Trichloräthyloxycarbonylgruppe, die   Trifluoracetylgruppe,    die Tritylgruppe, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder die 2-p-Diphenylisopropyloxycarbonylgruppe. Zur Veresterung geeignet sind z. B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole wie Methanol, Äthanol, Cyanmethylalkohol,   Benzol    methylalkohol oder insbesondere tert.-Butanol, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z.

  B. gegebenenfalls durch Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Halogenatome substituierte Benzyl- oder Benzhydrylalkohole wie p-Nitrobenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol oder   2,4, 6-Trimethylbenzylalkohol,    gegebenenfalls durch elektronenanziehende Substituenten substituierte Phenole und Thiophenole wie Thiophenol, Thiokresol, p-Nitrothiophenol, 2,4,5- und 2,4,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanophenol oder p-Methansulfonylphenol, weiter z. B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, N Hydroxypiperidin, 8-Hydroxychinolin.



   Die Hydroxygruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste können z. B. durch Veresterung oder Ver ätherung geschützt werden. Als Acylreste bei der Veresterung sind z.B. Niederalkanoylreste wie Acetyl, Aroylreste wie Benzoyl und vor allem von der Koh   lensäure    sich ableitende Reste wie Benzyloxycarbonyl oder Athyloxycarbonyl geeignet. Zur Verätherung geeignete Gruppen sind z. B.   Benzyl,    Tetrahydropyranyloder tert.-Butylreste. Ferner eignen sich zum Schutz der Hydroxylgruppen die in Ber. 100 (1967), 3838 bis 3849 beschriebenen   2,2,2-Trifluor-l-tert.-butyloxycar-    bonylamino-   oder -l-benzyloxycarbonylaminoäthylgrup-    pen (Weygand). Die Hydroxylgruppen brauchen aber nicht notwendig geschützt zu werden.



   Die Mercaptogruppen der Cysteinreste werden z. B.



  durch Acylierung oder Alkylierung geschützt. Zur Acylierung geeignet ist z. B. der Acetyl- oder Benzoylrest, der Athylcarbamoylrest oder der gegebenenfalls substituierte Carbobenzoxyrest. Zur Alkylierung geeignet sind   z.B.    der tert.-Butyl- oder Benzylthiomethylrest oder gegebenenfalls substituierte Arylmethylgruppen wie Benzyl, p-Nitrobenzyl, Diphenylmethyl, Dimethoxybenzhydryl oder Trityl, ferner Phenylcyclohexyl, Thienyl(2)-cyclohexyl u. a., vgl. Ber. 101 (1968), 681.



   Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidinogruppierung des Arginins kommen vor allem die Nitrogruppe und die Tosylgruppe oder der Carbobenzoxyrest zur Anwendung, doch braucht die Guanidinogruppe nicht geschützt zu werden.



   Ebenso braucht die Iminogruppe des Histidins nicht unbedingt geschützt zu werden, jedoch kann es vorteilhaft sein, sie zu schützen,   z.B.    durch Benzyl, Trityl, Carbobenzoxy, Adamantyloxycarbonyl, oder die oben genannten Weygandschen Gruppen.



   Falls die neuen Peptide nach der Merrifieldschen Feststoffträgersynthese aufgebaut werden, können die Seitenketten von Serin, Threonin und Tyrosin   z.B.   



  durch Benzyl, die von Cystein durch Benzyl oder p Methoxybenzyl, die von Histidin durch 1-Benzyloxy   carbonylamino-2,2,2-trifluoräthyl,    die von Arginin durch die Nitrogruppe und die der Glutaminsäure durch Benzyloxy geschützt werden. Als a-Aminoschutzgruppe wird beispielsweise tert.-Butyloxycarbonyl verwendet.



  Die Abspaltung des geschützten Peptids vom Harz und der Schutzgruppen geschieht   z.B.    mit wasserfreiem Fluorwasserstoff.



   Vorzugsweise verwendet man zum Schutz der Aminogruppen die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, zum Schutz der Carboxylgruppe der Seitenkette und gegebenenfalls der terminalen Carboxylgruppe die tert. Butylestergruppe, zum Schutz der Hydroxylgruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste, sofern diese überhaupt geschützt werden, die   tert.-Eutyläthergruppe    und, wenn erwünscht, zum Schutz der Iminogruppe des Histidins die 2,2,2-Trifluor-1-tert.-butyloxycarbonylaminoäthylgruppe. Alle diese Schutzgruppen können, wenn erwünscht, in einer Stufe durch saure Hydrolyse,   z.B.    mittels Trifluoressigsäure, abgespalten werden.

 

  Beim Aufbau des geschützten Dotriacontapeptids unter Verwendung von mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Schutzgruppen werden die Mercaptogruppen vorzugsweise durch Benzyl oder Trityl geschützt. Die S-Tritylgruppen können aus dem geschützten Peptid in organischer Lösung selektiv (unter Beibehaltung der mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Gruppen) mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff abgespalten werden.



  Die S-Benzylgruppen können aus dem geschützten Pep  tid selektiv mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten werden. In beiden Fällen erhält man das geschützte Peptid mit freien Mercaptogruppen. Dieses kann zum geschützten Disulfid,   z.B.    mit Jod in Eisessig, mit Dijodäthan in organischen Lösungsmitteln, mit Luftsauerstoff in flüssigem Ammoniak oxydiert werden. Besonders vorteilhaft ist es, die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen zu schützen und diese aus dem geschützten Peptid unter gleichzeitiger Bildung der Disulfidbrücke mit Jod in Methanol zu entfernen, vgl. Schweizer Patent 498 805. Diese Bildung des Disulfidringes kann auf der Stufe einer die beiden Cysteinreste enthaltenden Teilsequenz, z. B. des Nonapeptids 1-9, oder auf der Stufe des Dotriacontapeptids ausgeführt werden.



   Die erhaltenen freien Peptide können in an sich bekannter Weise nachträglich in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe übergeführt werden.



   Das Sulfoxyd kann aus Peptiden, welche in 25 Stellung Methionin enthalten, vorteilhaft durch Oxydation mit verdünnter Wasserstoffsuperoxydlösung in schwach saurem Medium hergestellt werden.



   Komplexe mit anorganischen Stoffen wie schwerlöslichen Metall-,   z.B.    Aluminium- oder Zinkverbindungen, werden in analoger Weise wie für ACTH bekannt, z. B. durch Umsetzung in wässriger Lösung mit einem löslichen Salz des betreffenden Metalls,   z.B.   



  Zinkchlorid oder Zinksulfat, und Ausfällung mit einem Alkalimetallphosphat, -pyrophat und/oder -hydroxyd bei einem pH von etwa 7-9 hergestellt. Komplexe mit organischen Verbindungen wie Polyoxygelatine, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyphloretinphosphat, Polyglutaminsäure usw. werden durch Mischen dieser Substanzen mit dem Peptid in wässeriger Lösung erhalten. In gleicher Weise können auch unlösliche Verbindungen mit Alkalimetallpolyphosphaten hergestellt werden.



   Erfindungsgemäss werden die Aminosäuren, wenn erforderlich oder erwünscht unter Verwendung leicht abspaltbarer Schutzgruppen, in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft, wobei gegebenenfalls auf einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird. Man arbeitet zweckmässig nach den für die Herstellung langkettiger Peptide, unter Berücksichtigung der Disulfid-Brücke, geeigneten Verknüpfungsmethoden, wie sie aus der Literatur bekannt sind.



   Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Pep   tideinheiten    erfolgt daher z. B. in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter, z. B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktiviertcr a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Amino säure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.



  Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch   Über-    führung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, Thiokresylester, p   Methansulfonylphenylester,    p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5- oder 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester, N Hydroxypiperidinester, oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder N,N'-Carbonyldiimidazols, oder Isoxazoliumsalzes,   z.B.    Woodward Reagens, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphit aktiviert werden.

  Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode, ferner die Merrifield-Methode und die Methode der N-Carboxyanhydride oder N-Thiocarboxyanhydride.



   Es wurde gefunden, dass es vorteilhaft ist, von einer Sequenz auszugehen, welche die ersten 7-12 Nterminalen Aminosäuren umfasst (1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-11 oder 1-12) und mit diesem N-Terminus die   ge    samte restliche Sequenz, also 8-32, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32 oder 13-32 zu kondensieren. Statt dessen kann man auch die genannte N-terminale Sequenz der ersten 7-12 Aminosäuren mit dem Fragment bis zur 24. Aminosäure (Glycin) verknüpfen und das Tetracosapeptid mit dem Octapeptid der Aminosäuren 25 bis 32 kondensieren. Die Kondensation des genannten N-terminalen Bruchstückes mit der Sequenz bis zur 32. bzw. bis zur 24. Aminosäure wird zweckmässig nach der Azidmethode, ausgehend vom Azid bzw. Hydrazid, oder der Methode nach Wünsch (Carbodiimid in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid), ausgehend vom Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe durchgeführt.



   Im folgenden wird die Herstellung des N-terminalen Bruchstückes an der Synthese des Nonapeptids (1-9) näher erläutert. In ganz entsprechender Weise können das Heptapeptid (1-7), das Octapeptid (1-8), das Decapeptid (1-10), das Undecapeptid (1-11) und das Dodecapeptid (1-12) hergestellt werden.



   Die Nonapeptidsequenz wird beispielsweise aus den Sequenzen 14 und 5-9 oder 1-6 und 7-9 aufgebaut, wie aus den Fig. 1-9 ersichtlich; man kann jedoch auch andere Bruchstücke zum Aufbau der Sequenz 1-9 verwenden. Als Schutzgruppe für die a-Aminogruppe am Cysteini wird vorzugsweise die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder eine äquivalente, durch saure Hydrolyse abspaltbare Gruppe verwendet, oder wenn ein   Na-acy-    liertes Dotriacontapeptid hergestellt werden soll, die entsprechende Acyl-, z. B. Acetylgruppe. Daneben verwendet man zweckmässig als Mercaptoschutzgruppen solche, die selektiv gegenüber der durch saure Hydrolyse abspaltbaren   Na-Aminoschutzgruppe      (z. 13.    tert. Butyloxycarbonylgruppe) abgespalten werden können,   z.B.    die Benzyl- oder Tritylgruppe.

  Die terminale Carboxylgruppe des Nonapeptids braucht nicht notwendig geschützt zu werden, z. B. nicht, wenn Kondensationen nach der Azid- oder Anhydridmethode ausgeführt werden (vgl. z. B. Fig. 1, Spalten 5 und 8). Man kann diese Gruppe aber auch durch Veresterung, wie oben angegeben, schützen, z. B. durch Veresterung mit Methanol (Abspaltung der Estergruppe mit verdünnter Natronlauge oder Überführung in das Hydrazid) oder mit Benzylalkohol oder Analogen (Abspaltung der Estergruppe   z.B.    durch Hydrogenolyse). Der Schutz der Aminogruppen der Zwischenprodukte erfolgt mittels der üblichen Schutzgruppen,   z.B.    Carbobenzoxy, Trityl, tert.-Butyloxycarbonyl und vor allem 2-para-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl. Die Carboxylgruppen der Zwischenprodukte werden, wenn erforderlich, in der üblichen Weise verestert. 

  Die Hydroxygruppen der Serinreste und des Threoninrestes können durch Ver   ätherung,   z.B.    mit tert.-Butanol oder Äquivalenten geschützt werden. In den folgenden Figuren und in den Beispielen bedeutet: 1) die Azidmethode 2) die Methode der gemischten Anhydride 3) die Methode der aktivierten Ester, besonders p-Nitrophenylester (ONP) oder Hydroxysucci nimidester (OSU) 4) die Carbodiimidmethode 5) die Methode nach Wünsch BOC tert.-Butyloxycarbonyl DPC p-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl Z Carbobenzoxy TRI Trityl Bzl Benzyl NPS o-Nitrophenylsulfenyl OtBu tert.-Butylester OBzl Benzylester ONB p-Nitrobenzylester ONP p-Nitrophenylester OMe Methylester tBu tert.-Butyläther Ac Acetyl TFA Trifluoressigsäure
Die Carbobenzoxy-, p-Nitrobenzylester- und Benzylestergruppen werden durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiumkohle abgespalten,

   die N-Tritylgruppe mit wässeriger Essigsäure, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure, die o-Nitrophenylsulfenylgruppe mit Chlorwasserstoff in organischen Lösungsmitteln oder z. B. mit Blausäure oder schwefliger Säure wie im englischen Patent 1 104 271 beschrieben; die Diphenylisopropyloxycarbonylgruppe   z.B.   



  mit einem Gemisch von Eisessig; Ameisensäure (82,8   % ig)    und Wasser   (7 : 1 : 2)    wie im Schweizer Patent 509 266 beschrieben. Der p-Nitrobenzyl- oder Methylester wird mit Hydrazinhydrat in das Hydrazid übergeführt. Mit verdünnter Natronlauge wird die Methylestergruppe hydrolysiert. Der tert.-Butylester wird mit Trifluoressigsäure gespalten, ebenso der tert.-Butyläther.



  Die S-Tritylgruppen werden mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff entfernt, die S-Benzylgruppe mit Natrium in flüssigem Ammoniak, wobei gegebenenfalls vorhandene p-Nitrobenzylestergruppen gleichzeitig abgespalten werden. Der Ringschluss zum Disulfid erfolgt z. B. durch Oxydation mit 1,2-Dijodäthan.



   Die mit der N-terminalen Sequenz zu verbindende C-terminale Sequenz, umfassend die 8. bis 13. bis zur 32. Aminosäure, wird vorzugsweise aus dem C-terminalen Fragment 25-32 und der Sequenz bis zur 24.



  Aminosäure, als 8-24, 9-24, 10-24, 11-24, 12-24 oder 13-24 zusammengesetzt.



   In der schematischen Darstellung von Fig. 11 und 12 wird die Synthese des C-terminalen Octapeptidamids (25-32) veranschaulicht. Vorzugsweise wird das Tripeptidamid 30-32 oder das Tetrapeptidamid 29-32 nach der Carbodiimidmethode mit einem Fragment aus den vorhergehenden Aminosäuren verknüpft. Die   r-Carboxylgruppe    der Glutaminsäure30 wird zweckmä   ssig    durch die tert.-Butylestergruppe geschützt. Die a Aminoschutzgruppe DPC wird wie oben angegeben mit Eisessig-Ameisensäure (82,8 % ig) - Wasser (7 : 1 : 2) abgespalten.



   Die Synthese des Bruchstücks mit der Aminosäuresequenz von der 8.-13. bis zur 24. Aminosäure kann auf ganz verschiedene Weise durchgeführt werden. Vorzugsweise wird das Peptid bis zur Aminosäure in Stellung 13 (Tryptophan), also 8-13, 9-13, 10-13 usw.



  hergestellt und dieses entweder mit dem Undecapeptid   1P24    kondensiert, oder zunächst mit einem Bruchteil dieser Undecapeptidsequenz,   z.B.    14-16,   1P17,      1plus,      1619,    und dann mit dem restlichen Bruchstück bis zur Aminosäure 24 verknüpft. Fig. 13 und 14 illustrieren die Synthese des Tetrapeptids der 10.-13.



  Aminosäure in Form des Hydrazids, das nach der Azidmethode mit den folgenden Aminosäuren,   z.B.   



  dem genannten Undecapeptid oder einem Bruchstück davon kondensiert werden kann.



   Das Undecapeptid mit der Sequenz   1624    wird erfindungsgemäss vorzugsweise aus den Sequenzen 14 bis 19 und 20-24 oder 14-20 und 21-24 aufgebaut.



  Das Hexapeptid   1P19    oder das Heptapeptid 14-20 werden zweckmässig nach der Azidmethode mit der Restsequenz bis zur 24. Aminosäure verknüpft. Fig.



  15, 16 und 17 illustrieren die Synthese des Hexapeptidhydrazids 14-19 und des Heptapeptidhydrazids 14-20.



  Das in Fig. 17A genannte Aminosäurederivat    H-His-N-H-BOC    erhält man durch Kondensation von Z-His-OH mit BOC-NH-NH2 mittels Dicyclohexylcarbodiimid in Essigester und hydrogenolytische Abspaltung der Carbobenzoxygruppe. In analoger Weise wird das geschützte Phenylalaninhydrazid in Fig. 15A und 16A hergestellt.



  Vom Hydrazinrest wird die BOC-Gruppe mit Trifluoressigsäure, die Carbobenzoxygruppe durch Hydrogenolyse abgespalten. Statt der BOC- und Carbobenzoxygruppe können äquivalente Schutzgruppen verwendet werden. Fig. 18-20 illustrieren die Synthese der Sequenzen 20-24 bzw. 21-24, die mit der Sequenz   1P19    (in Fig. 16 Stufe J, nach hydrogenolytischer Abspaltung der Z-Gruppe vom Hydrazinrest) bzw.   1P20    zum Undecapeptid   1P24    verbunden werden können.



   Man kann aber auch die Sequenz   1P19    bzw.



  14-20 der Fig. 16K oder der Fig. 15J oder 17L nach Abspaltung der a-Aminoschutzgruppe durch Hydrogenolyse bzw. mit Trifluoressigsäure mit der Sequenz   10-13    nach der Azidmethode zur Sequenz 10-19 bzw.



  10-20 verknüpfen, dann aus dem geschützten Hydrazid die BOC- bzw. Carbobenzoxy-Schutzgruppe wie oben abspalten und die Sequenz 10-19 bzw. 10-20 nach der Azidmethode mit der Sequenz 20-24 bzw. 21-24 zum Pentadecapeptid 10-24 verbinden.



   Die Sequenz des Pentadecapeptids 10-24, wie sie sich z. B. durch Zusammenfügen der in den Fig. 13-20 dargestellten Bruchstücke ergibt, kann beispielsweise nach der Methode von Wünsch mit dem Octapeptidamid 25-32, wie es in Fig. 11 oder 12 dargestellt ist, zum geschützten Tricosapeptidamid 10-32 kondensiert werden.



   Man kann aber auch das Pentadecapeptid 10-24 zunächst mit der N-terminalen Sequenz 1-9 kondensieren, zweckmässig in gleicher Weise wie unten für das Tricosapeptidamid 10-32 angegeben, und das Tetracosapeptid beispielsweise nach Wünsch mit dem Octapeptidamid 25-32 verknüpfen.



   Eine weitere erfindungsgemässe Möglichkeit, das geschützte Tricosapeptidamid der Aminosäuren 10-32 aufzubauen, besteht darin, dass man die Sequenz 10 bis 16, vorzugsweise nach der Azidmethode, mit der Sequenz 17-32 verknüpft. Die Sequenz 10-16 kann man z. B. durch Kondensation der in Fig. 13 oder 14 ange  gebenen Derivate der Sequenz 10-13 mit dem Tripeptid 14-16 (H-Arg-Asn-Leu-OH,   z.B.    aus Z-Arg-Asn Leu-OBzl durch Hydrogenolyse erhalten), nach der Azidmethode herstellen. Die Sequenz 17-32 wird vorzugsweise aus den Sequenzen 17-24 und 25-32 (Octapeptidamid) aufgebaut, beispielsweise durch Kondensation nach der Methode von Wünsch.

  Man kann das Octapeptidderivat Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly OH mit geschützter a-Aminogruppe und gegebenenfalls geschützter Hydroxylgruppe des Serinrestes beispielsweise durch Kondensation von Z-Asn-Asn-Phe   His-N2Hs    (aus Fig. 171  mit Trifluoressigsäure) mit   H-ArgPhe-Ser(tBu)-Gly-OH    (Fig. 20 H) nach der Azidmethode erhalten.



   Aus dem Tricosapeptidamid 10-32 mit geschützter a-Aminogruppe wird diese Schutzgruppe in geeigneter Weise entfernt (BOC mit Trifluoressigsäure, womit auch eine tert.-Butylestergruppe an der y-Carboxylgruppe von Glutaminsäure30 und gegebenenfalls vorhandene tert.-Butyläthergruppen hydrolysiert werden; DPC mit Eisessig-Ameisensäure-Wasser, wobei tert.-Butylester- und -äthergruppen nicht angegriffen werden).



   Die Verknüpfung der Sequenz 1-9, welche die Disulfidbrücke enthält und in welcher mindestens die a-Aminogruppe geschützt ist, mit der Sequenz 10-32, erfolgt, wie bereits erwähnt, vorzugsweise nach der Azidmethode.



   Man erhält so das Dotriacontapeptidamid mit geschützter a-Aminogruppe und gegebenenfalls geschützten Seitenketten-hydroxyl-   und/oder -carboxylgruppen.   



  Diese Schutzgruppen werden wie bereits erwähnt abgespalten.



   Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.B.

   solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Acorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.



   Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.



   Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.



   In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet.



  System 43A: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser    (100 40:10)    System 43C: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser  (51:21:28) System 45: sec. Butanol-3 % iges wässriges Ammoniak  (70: 30) System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser (75 : 7,5 : 21) System 52A: n-Butanol-Eisessig-Wasser   (67 :10: 23)    System 53:   n-Butanol-Ameisensäure-Wasser     (60 :   0,75 :    39) System 54: sec. Butanol-Isopropanol 9 % ige Mono chloressigsäure (58 :   8 : 34)    System 55: Äthanol-8 % iges wässriges Natriumchlorid  (75 : 25) System 59:   Methyläthylketon-Pyridin-Wasser       (60:15:    25) System 70: Äthylacetat-Pyridin-Wasser (40 : 20 : 40) System 89: Essigester-Aceton-Wasser   (72 : 24 : 4)    System 96: sec.

  Butanol-Eisessig-Wasser   (67 :10: 23)    Sytem 100: Athylacetat-Pyridin-Läsessig-Wasser    (62:21:6:11)    System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser  (38   : 24:      8 : 30)    System   101 A:      n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser     (42 : 24 :   4: 30)    System   101B:      n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser     (40 : 24 : 6 : 30) System 102E: Essigester-Methyläthylketon-Eisessig
Wasser ( 50 : 30 : 10 : 10) System 104:   Chloroform-Methanol-17%iges    wässriges
Ammoniak   (41: 4k:18)    System   111A:    n-Butanol-Pyridin-Ammoniak  (26% ig)-Wasser (42: 24 : 4 : 30) System 121:

  Isopropanol-Ammoniak 26 %ig)-Wasser    (70:10:    20) System   121 A:    Isopropanol-Ammoniak   (26 % ig)-Wasser     (85   :      5:10)    System 87: Isopropanol-Eisessig-Wasser   (77: 4:19)    System 110: Essigester-n-Butamol-Pyridin-Eisessig
Wasser (42   : 21: 21: 6:10)    System 1: Benzol-Athanol   (80 : 20)    System 2:   Benzol-Äthanol    (90:10) System 3: 

  Benzol-Äthanol   (95 : 5)    System 4: n-Amylalkohol-Ameisensäure-Wasser    (70:20:10)    System 5: n-Butanol-Essigsäure-Wasser  (66,6   :16,7      16,7)    System 6: n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser    (66,6:12,5    : 4,2:16,7) System 7: n-Amylalkohol-Pyridin-Wasser (50 : 30 : 20) System 8:   Chloroform-Methanol-Eisessig       (87,4 :    9,7 :

   2,9).  
EMI6.1     


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  Fig. 1  
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   3
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   4     
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    ID=10.1> Fig. 5     
EMI11.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
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<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> A <SEP> BOC---ONP <SEP> Z---OH <SEP> Z---ONP <SEP> H---OMe <SEP> DPC---OH <SEP> H---OMe <SEP> TRI---OH <SEP> Z---OH <SEP> H---OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> 3) <SEP> 1)-5)
<tb> B <SEP> Z--------------OMe <SEP> DPC-------------OMe <SEP> Z--------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> C <SEP> H--------------OMe <SEP> DPC-------------N2H3 <SEP> H--------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb>  <SEP> 1)-5) <SEP> -5)
<tb> D <SEP> Z--------------------------OMe <SEP> TRI-------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> E <SEP> H--------------------------OMe <SEP> H-------------------------OH
<tb>  

   <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb>  <SEP> 3) <SEP> 1)
<tb> F <SEP> BOC-------------------------------------OMe <SEP> DPC----------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> G <SEP> BOC-------------------------------------N2H3 <SEP> H----------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb>  <SEP> 1)
<tb> H <SEP> BOC--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> SH <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> SH
<tb> I <SEP> BOC--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> J <SEP> BOC--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 

   <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb>    Fit. 6     
EMI12.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb>  <SEP> Cys <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Tar <SEP> Cys <SEP> Val <SEP> Leu
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> A <SEP> BOC---ONP <SEP> Z---OH <SEP> Z---OH <SEP> H---OMe <SEP> Z---OH <SEP> H---OMe <SEP> TRI---OH <SEP> Z---OH <SEP> H---OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> 1)-5)
<tb> B <SEP> Z--------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> C <SEP> H--------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb>  <SEP> wie <SEP> Fig.

  <SEP> 6 <SEP> D
<tb> D <SEP> TRI--------------OMe <SEP> TRI------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> E <SEP> TRI--------------OH <SEP> H------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> F <SEP> TRI-----------------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> wie <SEP> Fig.

  <SEP> 6 <SEP> G
<tb> G <SEP> BOC-------------------------------------N2H3 <SEP> H-----------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> 1)
<tb> H <SEP> BOC--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> SH <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> I <SEP> BOC--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> J <SEP> BOC--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb>    Fig.

   7     
EMI13.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb>  <SEP> Cys <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Cys <SEP> Val <SEP> Leu
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> A <SEP> TRI---OH <SEP> Z---OH <SEP> Z---ONP <SEP> H---OMe <SEP> DPC---OH <SEP> H---OMe <SEP> TRI---OH <SEP> Z---OH <SEP> H---OMe
<tb>  <SEP> 3)
<tb> B <SEP> Z--------------OMe
<tb> C <SEP> H--------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> D <SEP> Z-------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> E <SEP> H-------------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu
<tb> F <SEP> TRI-------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu
<tb> G <SEP> H-------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI
<tb> H <SEP> AC-------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb>  <SEP> wie <SEP> Fig.

  <SEP> 6 <SEP> G
<tb> I <SEP> AC-------------------------------------N2H3 <SEP> H-----------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> J <SEP> AC--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> K <SEP> AC--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb>    Fig.

   8     
EMI14.1     

  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb>  <SEP> Cys <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Thr <SEP> Cys <SEP> Val <SEP> Leu
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> A <SEP> TRI---OH <SEP> Z---OH <SEP> Z---ONP <SEP> H---OMe <SEP> DPC---OH <SEP> H---OMe <SEP> TRI---OH <SEP> Z---OH <SEP> H---OMe
<tb>  <SEP> 3)
<tb> B <SEP> Z--------------OMe
<tb> C <SEP> H--------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb>  <SEP> 1)-5)
<tb> D <SEP> Z-------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> E <SEP> H-------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> F <SEP> BOC-------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb>  <SEP> wie <SEP> Fig. 

  <SEP> 6 <SEP> G
<tb> G <SEP> BOC-------------------------------------N2H3 <SEP> H-----------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> TRI <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> TRI
<tb> H <SEP> BOC--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> I <SEP> BOC--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb> J <SEP> H--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb> K <SEP> AC--------------------------------------------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9
<tb>    Fig.

   9     
EMI15.1     

  <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 31 <SEP> 32
<tb>  <SEP> Met <SEP> Gly <SEP> Pas <SEP> Gly <SEP> Pro <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Pro
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> tBu
<tb> A <SEP> DPC---OH <SEP> Z---OH <SEP> Z---OH <SEP> H---OMe <SEP> Z---OH <SEP> Z---ONP <SEP> Z---OH <SEP> H---NH2
<tb>  <SEP> tBu
<tb>  <SEP> 2)-5) <SEP> 2)-5)
<tb> B <SEP> Z----------------OMe <SEP> Z---------------NH2
<tb>  <SEP> tBu
<tb> C <SEP> H----------------OMe <SEP> H---------------NH2
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> 2)-5) <SEP> 3)
<tb> D <SEP> Z----------------------------OMe <SEP> Z---------------------------NH2
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> tBu
<tb> E <SEP> H----------------------------OMe <SEP> H---------------------------NH2
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> 2)-5) <SEP> 2)-5)
<tb> F <SEP> DPC----------------------------------------OMe <SEP> 

   Z---------------------------------------NH2
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> tBu
<tb> G <SEP> DPC----------------------------------------OH <SEP> H---------------------------------------NH2
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> tBu
<tb>  <SEP> 2)-5)
<tb> H <SEP> DPC---------------------------------------------------------------------------------------NH2
<tb>  <SEP> OtBu <SEP> tBu
<tb> I <SEP> H---------------------------------------------------------------------------------------NH2
<tb>  <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 31 <SEP> 32
<tb>    Fig.

   10     
EMI16.1     

  <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 31 <SEP> 32
<tb>  <SEP> Met <SEP> Gly <SEP> Pas <SEP> Gly <SEP> Pro <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Pro
<tb>  <SEP> OtBu
<tb> A <SEP> NPS---OH <SEP> Z---OH <SEP> Z---OH <SEP> Z---OH <SEP> H-OtBu <SEP> Z---OH <SEP> Z---OH <SEP> H---NH2
<tb>  <SEP> 2)-5) <SEP> 2)-5)
<tb> B <SEP> Z-------------OtBu <SEP> Z---------------NH2
<tb> C <SEP> H-------------OtBu <SEP> H---------------NH2
<tb>  <SEP> OtBu
<tb>  <SEP> 2)-5) <SEP> 2)-5)
<tb> D <SEP> Z-------------------------OtBu <SEP> Z---------------------------NH2
<tb>  <SEP> OtBu
<tb> E <SEP> H-------------------------OtBu <SEP> H---------------------------NH2
<tb>  <SEP> 2)-5)
<tb> F <SEP> Z-------------------------------------OtBu
<tb> G <SEP> Z-------------------------------------OH
<tb>  <SEP> OtBu
<tb> H <SEP> 

   Z---------------------------------------------------------------------------NH2
<tb>  <SEP> OtBu
<tb> I <SEP> H---------------------------------------------------------------------------NH2
<tb>  <SEP> OtBu
<tb> J <SEP> NPS---------------------------------------------------------------------------------------NH2
<tb>  <SEP> OtBu
<tb> K <SEP> H---------------------------------------------------------------------------------------NH2
<tb>  <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 30 <SEP> 31 <SEP> 32
<tb>    Fit. 11     
10 11 12 13
Ser Ala Tyr Try A BOC---OH Z---OH BOC---OH H---OMe    2)-5) B BOC------------------OMe    C H OMe D Z-----------------------------------OMe E H OMe F BOC--------------------------------------------------OMe G BOC--------------------------------------------------N2H3
10 11 12 13
Fig.

   12  
EMI18.1     


<tb>  <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13
<tb>  <SEP> Ser <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Try
<tb>  <SEP> tBu <SEP>    t3u    <SEP> 
<tb> A <SEP> DPC---OH <SEP> Z---OH <SEP> Z---OH <SEP> H-OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> B <SEP> Z------2)-5)--------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> C <SEP> H---------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> 2)-5)
<tb> D <SEP> Z-------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> E <SEP> H-------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> F <SEP> DPC--------------2)-5)------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu <SEP> tBu
<tb> G <SEP> DPC---------------------------------------N2H3
<tb>  <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13
<tb>  Fig.

   13  
14 15 16 17 18 19
Arg Asn Leu Asn Asn Phe    A Z---OH Z---ONP Z---ONP Z-----ONP Z---ONP H---N2H2---BOC
OSU OSU OSU
3) B Z-----------------N2H2-BOC    C H-----------------N2H2-BOC    3) D Z---------------------------------N2H2-BOC    E H---------------------------------N2H2-BOC    3) F Z----------------------------------------------N2H2-BOC    G H----------------------------------------------N2H2-BOC    3) H Z------------------------------------------------------------N2H2-BOC    I H------------------------------------------------------------N2H2-BOC
4) 5) J Z-------------------------------------------------------------------------N2H2-BOC K Z N2H3
14 15 16 17 18 19
Fig 14  
14 15 16 17 18 19
Arg Asn Leu Asn Asn Phe A BOC---OH BOC---OH BOC---OH BOC---OH BOC---OH H---N2H2-Z B 

   BOC---------------N2H2-Z C H---------------N2H2-Z D BOC------------------------------N2H2-Z E H------------------------------N2H2-Z F BOC---------------------------------------------N2H2-Z G H---------------------------------------------N2H2-Z H BOC-----------------------------------------------------------N2H2-Z I H-----------------------------------------------------------N2H2-Z J BOC-------------------------------------------------------------------------N2H2-Z K H-------------------------------------------------------------------------N2H2-Z
14 15 16 17 18 19
Fig.

   15  
14 15 16 17 18 19 20
Arg Asn Leu Asn Asn Phe His A Z---OH Z---ONP Z---OH Z---ONP Z---ONP Z---OH H---NH-NH-BOC   
2)-5) B Z----------------NH-NH-BOC    C H----------------NH-NH-BOC   
3) D Z-----------------------------NH-NH-BOC    E H-----------------------------NH-NH-BOC   
3) F Z------------------------------------------NH-NH-BOC    G H------------------------------------------NH-NH-BOC   
2)-5) H Z-------------------------------------------------------NH-NH-BOC    I H-------------------------------------------------------NH-NH-BOC   
3) J Z---------------------------------------------------------------------NH-NH-BOC    K H---------------------------------------------------------------------NH-NH-BOC
4) 5) L  

   Z---------------------------------------------------------------------------------NH-NH-BOC M Z---------------------------------------------------------------------------------NH-NH2
14 15 16 17 18 19 20
Fig. 16  
EMI22.1     


<tb>  <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24
<tb>  <SEP> His <SEP> Arg <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Gly
<tb>  <SEP> tBu
<tb> A <SEP> Z---OH <SEP> Z---OH <SEP> Z---OH <SEP> Z---OH <SEP> H-OMe
<tb>  <SEP>    t3u    <SEP> 
<tb> 2)-5)
<tb> B <SEP> Z---------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb>  <SEP> C <SEP> H---------------OMe
<tb>  <SEP> 2)-5)
<tb>  <SEP> tBu
<tb> Z--------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> E <SEP> H-----------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb>  <SEP> 4) <SEP> 5)
<tb>  <SEP> F <SEP> Z------------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb>  <SEP> G <SEP> 

   H------------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> 1), <SEP> 4), <SEP> 5)
<tb>  <SEP> H <SEP> Z-------------------------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> I <SEP> H-------------------------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> J <SEP> H-------------------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24
<tb>  Fig.

   17  
EMI23.1     


<tb>  <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24
<tb>  <SEP> His <SEP> Arg <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Gly
<tb>  <SEP> N02
<tb> A <SEP> Z---OH <SEP> BOC---OH <SEP> BOC---OH <SEP> BOC---OH <SEP> H---OBzl
<tb> 2)-5)
<tb> B <SEP> BOC----------------OBzl
<tb> C <SEP> H----------------OBzl
<tb> 2)-5)
<tb> D <SEP> BOC------------------------------OBzl
<tb> E <SEP> H------------------------------OBzl
<tb>  <SEP> NO
<tb> 2)-5)
<tb>  <SEP> F <SEP> BOC----------------------------------------------OBzl
<tb>  <SEP> NO2
<tb> G <SEP> H----------------------------------------------OBzl
<tb>  <SEP> NO2
<tb>  <SEP> 1)
<tb>  <SEP> H <SEP> Z-------------------------------------------------------------OBzl
<tb> I <SEP> H <SEP> .

  <SEP> OH
<tb>  <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24
<tb>  Fig. 18  
EMI24.1     


<tb>  <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24
<tb>  <SEP> Arg <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Gly
<tb>  <SEP> NO2 <SEP> tBu
<tb> A <SEP> Z---OH <SEP> Z---OH <SEP> Z---OH <SEP> H---OMe
<tb>  <SEP> 2)-5)
<tb>  <SEP> tBu
<tb> B <SEP> Z-----------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> C <SEP> H <SEP>    @ <SEP>    OMe
<tb>  <SEP>    tBu    <SEP> 
<tb> D <SEP> Z
<tb>  <SEP> tBu
<tb> E <SEP> H <SEP>    # <SEP>    OMe
<tb>  <SEP> NO2 <SEP> tBu
<tb> 2)-5)
<tb> Z-------------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> G <SEP> H----------------------------------------------OMe
<tb>  <SEP> tBu
<tb> H <SEP> H----------------------------------------------OH
<tb>  <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24
<tb>  Fig.

   19  
EMI25.1     


<tb>  <SEP> Beispiel <SEP> 1
<tb>   H-Cvs-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cvs-Val-Leu-Ser-Ala-Tvr-    <SEP> 
<tb>  Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly   Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2    (I, Thyrocalcitonin).
EMI25.2     


<tb>



   <SEP> 480 <SEP> mg <SEP> BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)
<tb>   Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-    <SEP> 
<tb>  Arg(H2 +   )-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg(H +    )-Phe   Ser(tB u)-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-    Thr(tBu)-Pro-NH2 werden unter Eiskühlung in 20 ml 90 % iger Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung unter Stickstoff 30 Minuten bei   0     belassen. Hierauf wird sie in 300 ml eiskalten, peroxydfreien Äther eingegossen. Der dabei entstehende Niederschlag wird abgenutscht, mehrmals mit peroxydfreiem Äther gewaschen und im Vakuum über   Atznatron    getrocknet. Hierauf wird das Pulver wiederum in 20 ml eiskalter, 90   % iger    Trifluoressigsäure gelöst, auf 250 erwärmt und unter Stickstoff 1 Stunde bei 250 belassen.

  Sodann wird die Lösung wiederum in 300 ml eiskalten, peroxydfreien   Ather    gegossen und der entstehende Niederschlag abgenutscht, mit   Äther    gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur über Ätznatron getrocknet. Die nachfolgenden Operationen werden unter Stickstoff und unter Verwendung von peroxyd- und sauerstofffreien Lösungsmitteln ausgeführt.



   Zur Überführung in das essigsaure Salz wird das oben erhaltene Trifluoracetat von I in 20 % Essigsäure gelöst und über eine Säure (1,2 x 15 cm) eines schwach basischen Ionenaustauscherharzes (Merck Nr. II, Acetatform) filtriert. Die Säule wird so lange mit 20   S    iger Essisäure nachgewaschen, bis die U. V.-Kontrolle des Eluats keine Anwesenheit von I mehr zeigt. Hierauf wird das Eluat unter Zusatz von n-Octanol im Vakuum bei 400 Badtemperatur eingedampft, der Rückstand durch Waschen mit Petroläther von Octanol befreit und getrocknet. Dabei wird das essigsaure Salz des Dotriacontapeptids als schwach gelbliches Harz erhalten. Zur Reinigung wird das Produkt einer Gegenstromverteilung im System n-Butanol (1 Liter-l-n. Essigsäure (1 Liter)-Ammonacetat (500 mg) unterworfen.



  Zu diesem Zweck löst man es in je 30 mI Ober- und Unterphase dieses Systems und füllt die Lösung in die ersten drei Rohre der Verteilungsapparatur ein. Nach 250 Verteilungsschritten werden die einzelnen Fraktionen mittels Dünnschichtchromatographie (auf AIuminiumoxydplatte, System 104, Rf = 0,50) auf ihre Reinheit geprüft. Das reine Dotriacontapeptid befindet sich in den Fraktionen 140-165 (Maximum der Gewichtskurve in Fraktion 156,   K = 1,65).    Diese Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bei 400 Badtemperatur eingedampft und der Rückstand zur Entfernung von Ammoniumacetat bei 400 und 0,01 mm Hg getrocknet. Das dabei erhaltene Dotriacontapeptid erweist sich bei Dünnschichtchromatographie an   Alu-    miniumoxyd als einheitlich (Nachweis mit Reindel Hoppe-Reagens); es zeigt die folgenden Rf-Werte:
Rf45 = 0,33; Rf52 = 0,59; Rf104 = 0,56.



   Das Sulfoxyd von I weist folgende Rf-Werte auf:    Rf45    = 0,30;   Rf52    = 0,54;   Ruft04    =   0,5O.   



   Bei der Elektrophorese auf Celluloseacetat-Folie ( Cellogel ) in Essigsäure-Ameisensäurepuffer, pH= 1,9, 90 Minuten Laufzeit, 8 Volt/cm, zeigen I und sein Sulfoxyd eine Laufstrecke von 1,1 cm gegen die Kathode.



   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1. H-Thr(tBu)-OMe
12,92 g (40 mMol) Z-Thr(tBu)-OMe werden in 200 ml Eisessig und 3 g Pd-Kohle (10 %) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme von Wasserstoff ist nach einer Stunde beendet. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Wasserstrahlvakuum bei 350 eingedampft. Nach dem Trocknen am Hochvakuum bei 350 resultieren 7,3 g eines Öls, das gemäss Dünnschichtchromatogramm einheitlich ist und direkt weiter verwendet wird.



  2.   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OMe   
19,3 g (38,6 mMol) DPC-Ser(tBu)-OH, Cyclohexylaminsalz werden in 500 ml Chloroform aufgenommen und bei   0     dreimal mit 25 ml in Zitronensäure und fünfmal mit 40 ml halbgesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird eingedampft und der erhaltene Schaum in 250 ml Essigester aufgenommen. Man gibt 5,36 ml (38,6 mMol) Triäthylamin zu, kühlt die Lösung auf   - 100    ab und versetzt unter Rühren mit 5,13 ml (38,6 mMol) Isobutylchlorocarbonat. Es wird 10 Minuten bei - 100 gerührt und dann die auf - 120 gekühlte Lösung von 7,3 g (38,6 mMol) H-Thr-(tBu)-OMe in 100 ml Essigester so zugetropft, dass die Reaktionstemperatur - 100 nie übersteigt.

  Nach beendetem Eintragen wird noch eine Stunde bei - 100 gerührt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Lösung wird vom ausgeschiedenen Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert und bei   0     dreimal mit je 20 ml   1n    Zitronensäure und fünfmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Rohprodukt   (Öl):      2207    g. Zur Reinigung wird 1 g an einer Silicagelsäule (2,5 cm, 30 cm) chromatographiert. Mit Petrol äther-Essigester (1 :   1)    werden nach einem Vorlauf von 110 ml 787 mg reines Produkt eluiert.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in   Toluol-Aceton      (7 3)    ist Rf = 0,51.



  3. Z-Val-Leu-OMe
Man löst 19,9 g (110 mMol) H-Leu-OMe,   HCl    in 120 ml Dimethylformamid und gibt bei   0     14,6 ml (105 mMol) Triäthylamin zu. Das ausgeschiedene Tri   äthylamin-Hydrochlorid    wird abfiltriert, das Filtrat zu einer Lösung von 25,1 g (100 mMol) Z-Val-OH in 200 ml Dimethylformamid (00) gegeben und dann 22,6 g (110 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid trocken zugefügt. Nach einer Stunde Rühren bei   0     und über Nacht im Kühlschrank wird filtriert und die Lösung am Hochvakuum bei 400 eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 30 ml Essigester aufgenommen, die Lösung auf   0     abgekühlt und vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff befreit. Nach Zugabe von n-Hexan kristallisiert das Produkt aus dem Filtrat über Nacht aus. 

  F.   1021050;       [a]D:      -410    C (c = 2,88 in Methanol).



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol   (98 : 2)    ist Rf = 0,55 und in Toluol-Aceton   (7 : 3)    ist Rf = 0,60.



  4.   DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NHO   
4,253 g (7,4 mMol) DPC-SerftBu)-Thr(tBu)-OMe in 18 ml Methanol werden mit 5,55 ml (etwa 110 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und 10 Stunden bei Zimmertemperatur und 2 Stunden bei 400 stehengelassen. Die   Reaktionslösung wird in 450 ml Essigester aufgenommen und viermal mit halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird auf etwa 15 ml eingeengt und mit etwa 5 ml Petroläther versetzt. Über Nacht kristallisieren 3,17 g des Hydrazids vom F.   1321340    aus.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in   Tolüol-Aceton      (7: 3)    ist Rf = 0,40.



  5. H-Val-Leu-OMe,HCl
5,66 g (15   mMoV    Z-Val-Leu-OMe werden in 75 ml Methanol in Gegenwart von 15 mMol Salzsäure und 850 mg Pd-Kohle   (10 %)    bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme von Wasserstoff ist nach 3 Stunden beendet. Es wird vom Katalysator abfiltriert und die Lösung auf etwa 15 ml eingeengt. Bei Zugabe von Äther kristallisiert das Produkt aus. F.   136-139 .   



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (9: 1) ist Rf = 0,45; in Toluol Aceton   (1:1)    ist Rf = 0,43.



  6. TRI-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe
7,13 g (10 mMol) TRI-Cys(TRI)-OH, Diäthylaminsalz werden in Chloroform bei   0     mit in Zitronensäure und halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen, die Lösung getrocknet, eingedampft und der erhaltene Schaum in 50 ml Essigester aufgenommen.



  Dazu gibt man eine mit 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin versetzte Lösung von 3,22 g (10 mMol) H-Val Leu-OMe, Hydrochlorid in 40 ml Essigester von 00, aus der man das ausgefallene Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert hat. Dann versetzt man bei   0     mit 2,26 g (11 mMol) trockenem Dicyclohexylcarbodiimid, rührt   2·    Stunden bei   0     und lässt über Nacht im Kühlschrank stehen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und die Lösung bei   0     mit in Zitronensäure, in Natriumbicarbonat und   halbges ättigter    Kochsalzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird auf etwa 20 ml eingeengt, auf   0     gekühlt und von weiterem Dicyclohexylharnstoff abfiltriert.

  Eindampfen zur Trockne ergibt   8,53    g Ester. Zur Reinigung wird das Rohprodukt an einer Silicagelsäule (5 cm; 55 cm) chromatographiert. Nach einem Vorlauf von 400 ml wird das Hauptprodukt mit 300 ml Petroläther-Essigester   (1 : 1)    in reiner Form eluiert.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (99   1)    ist Rf =   0,43.   



  7. H-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe
11,08 g (13,3 mMol) TRI-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe werden in 75 rnl Essigester gelöst und 12,3 ml Wasser tropfenweise zugegeben, so dass stets eine klare Lösung bleibt. Nach einer Stunde Rühren bei Zimmertemperatur gibt man zur klaren Lösung 64 ml Wasser, filtriert den Niederschlag ab und wäscht mit kalter 50   %    iger Essigsäure. Das Filtrat wird am Hochvakuum bei 400 zu einem Öl eingedampft, dieses in 250 ml Essigester aufgenommen und bei   0     mit in Natriumbicarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen.



  Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft, wobei 7,07 g eines weissen Produktes erhalten werden. Das Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Chloroform-Methanol   (98 : 2)    zeigt beim Besprühen mit Reindel-Hoppe-Reagenz einen Fleck vom Rf-Wert   0,30.   



  8. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe
Zu 13,6 g (23,8 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)   NH-NH.,    in 220 ml Dimethylformamid werden bei   - 120    32,26 ml Salzsäure in Essigester (1,84-n.; 59,25 mMol) und 3,26 ml (28,55 mMol) tert.-Butylnitrit gegeben. Nach 15 Minuten bei   -10     lässt man dann die auf   - 100    gekühlte Lösung von 14,03 g (23,8 mMol) H-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe und 8,315 ml (59,25 mMol) Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid derart zutropfen, dass die Reaktionstemperatur   - 90    nie überschreitet. Es wird noch eine Stunde bei   -100    gerührt und dann über Nacht bei   iLimmertempe-    ratur stehengelassen.

  Es wird vom ausgeschiedenen Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert, das Filtrat am Hochvakuum bei 400 eingedampft, der ölige Rückstand in 500 ml Essigester aufgenommen, mit in Zitronensäure, in Natriumbicarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet, auf etwa 40 ml eingeengt und mit etwa 10 ml Petroläther versetzt. Über Nacht kristallisiert der geschützte Pentapeptidester vom F.   177-1780    aus.



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol   (98 : 2)    ist Rf = 0,45; in Toluol Aceton   (7 : 3)    ist Rf = 0,57.



  9. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe
2,830 g (2 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu) Cys(TRI)-Val-Leu-OMe werden in 60 ml   75 S igem    Dioxan gelöst und mit 3 ml 2n Natronlauge (6 mMol) versetzt. Nach 1 1/2 Stunden bei Zimmertemperatur wird das Dioxan am Wasserstrahlvakuum bei 40  abgedampft, Essigester und Wasser zugegeben und bei   0     mit in Zitronensäure auf pH 3 gestellt. Die Essigester Phase wird mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Es resultiert ein Produkt, das gemäss Dünnschichtchromatogramm an Silicagel einheitlich ist.



   Rf in Chloroform-Methanol   (7 : 3)    = 0,40;
Rf45 = 0,55.



  10. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH    2.22    g (2 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI) Val-Leu-OH werden in 20 ml Methylenchlorid gelöst und 12 ml Chloressigsäure in Wasser (aus 75 g Chloressigsäure und 25 ml Wasser) zugegeben. Die klare Lösung wird 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, auf   0     gekühlt und dann werden 70 ml Wasser zugegeben. Mit konzentriertem Ammoniak wird auf pH 6,5 eingestellt, wobei das Produkt ausfällt. Die wässrige Lösung wird abdekantiert und der Rückstand noch dreimal mit Wasser verrieben und dann lyophilisiert. Dreimaliges Verreiben des Produktes mit Äther liefert ein weisses Pulver, welches laut Dünnschichtchromatogramm einheitlich ist. Es wird in dieser Form weiter verwendet.

 

   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf45 = 0,48; Rf   ioi    = 0,65;   Rf52    =   0,75.   



  11. Z-Asn-Leu-OMe
16,7 g H-Leu-OMe und 46,0 g Z-Asn-ONP werden in 100 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird 19 Stunden bei 250 stehengelassen. Hierauf gibt man 1,2 Liter Wasser zu und nutscht die kristalline Fällung ab. Das   Dipeptidderivat    wird bei 400 im Vakuum getrocknet und dann zweimal aus Methanol-Wasser umkristallisiert.



   F.   180-181 ;    [a]   20    = +90 (c = 2,05 in Chloro form).



  12. H-Asn-Leu-OMe
15,0 g Z-Asn-Leu-OMe werden in 400 ml t-Butanol-Wasser (9: 1) gelöst und in Gegenwart von 2 g   Palladium-Kohle (10 % Pd) hydriert. Nach Beendigung der Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht und bei 400 eingedampft. Der Rückstand wird direkt weiter verwendet.



   13. Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe
8,90 g H-Asn-Leu-OMe und 11,0 g Z-Ser(tBu)-OH werden in 100 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf   0     gekühlt und mit 3,90 g N-Hydroxysuccinimid und dann mit 8,70 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 30 Minuten Stehen bei   0     und 18 Stunden bei 250 wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und das Filtrat in 800 ml Eiswasser gegossen. Der dabei ausfallende, kristalline Niederschlag wird im Vakuum bei 400 getrocknet und dann aus Methanol-Wasser umkristallisiert. Das dabei in analysenreiner Form erhaltene Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe schmilzt bei F. 202 bis 2050;    [n]      2D      '      -180    (c = 1,05 in Eisessig).



  14. H-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe
6,3 g   Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe    werden in 600 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,2 g Palladium Kohle (10 % Pd) hydriert. Nach 1,25 Stunden wird vom Katalysator abgenutscht und im Vakuum bei 300 Badtemperatur zur Trockne eingedampft. Das dabei erhaltene kristalline Tripeptidderivat zeigt bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten im System Chloroform-Methanol (90 : 10) Rf = 0,11.



  15. BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe
5,0 g H-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe und 6,7 g BOC Cys(TRI)-ONP werden in 30 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Die gelbe Lösung wird 42 Stunden bei 260 stehengelassen. Hierauf wird durch Zugabe von 500 ml Eiswasser gefällt und das ausgefallene Produkt abgenutscht. Es wird in Essigester gelöst und die Lösung mit 5 % Zitronensäurelösung und dann mit Wasser gewaschen. Hierauf wird unter Eiskühlung zur Entfernung von p-Nitrophenol 5mal mit einem Gemisch von je 1 Volumteil 5 % iger Kaliumcarbonat- und 5 % iger Kaliumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Die Essigesterlösung hinterlässt nach Trocknen und Eindampfen ein harzartiges Produkt. Dieses wird viermal aus Aceton und Petroläther umgefällt.

  Das dabei als festes Pulver erhaltene Tetrapeptidderivat zeigt F.   181-1.820;       [a]      D    =   -110    (c = 2,09 in Methanol).



   Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten ist Rf43A = 0,57; Rf in Essigester =   1,10;    Rf in Toluol Aceton   (7 : 3)    = 0,05; Rf in Chloroform-Methanol   (9:1)    = 0,45.



  16. BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-NH-NH2
7,0 g BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe werden in 70 ml Methanol gelöst und die auf   0     gekühlte Lösung mit 7 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 16 Stunden bei 20 wird eine eiskalte Lösung von 600 ml 2n Essigsäure zugegeben, die gallertige Fällung gut zerrieben, abgenutscht und mit viel Wasser neutral gewaschen. Das erhaltene Pulver wird bei 400 im Vakuum getrocknet und dann in 100 ml Acetonitril suspendiert.



  Nach Zerreiben wird abgenutscht und bei 400 im Vakuum getrocknet. Das erhaltene BOC-Cys(TRI) Ser(tBu)-Asn-Leu-Hydrazid zeigt F.   216-2180.   



   Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten weist es die folgenden Rf-Werte auf: Rf = 0,55 in Dioxan-Wasser   (98 : 2);    Rf = 0,52 in Chloroform Methanol   (8 : 2);      Rft02E    = 0,70.



  17. BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)    Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH   
Bei   - 150    werden zu 1,075 g (1,26 mMol) BOC Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-NH-NH2 in 15 ml Dimethylformamid 1,71 ml Salzsäure in Essigester (1,84-n.; 3,15 mMol) und 0,174 ml (1,51 mMol) tert.-Butylnitrit (1,74 ml aus einer Lösung von 1 ml tert.-Butylnitrit mit Dimethylformamid auf 10 ml aufgefüllt) gegeben.



  Die Lösung wird 15 Minuten bei   -100    gerührt und   dann die auf - -120 gekühlte Lösung von 1,104 g    (1,26 mMol) H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu OH und 0,61 ml (4,41 mMol) Triäthylamin in 15 ml Dimethylformamid zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei - 100 und vier Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Eindampfen am Hochvakuum auf ein kleines Volumen und Zugabe von Wasser erhält man ein pulveriges Produkt, welches zweimal mit Wasser verrieben und dann am Hochvakuum über Kalilauge getrocknet wird. Dieses Rohprodukt wird durch Umlösen aus Methanol gereinigt.

  Aus einer bei 500 gesättigten methanolischen Lösung scheidet sich über Nacht bei   0     ein weisses Pulver aus, welches sich im Dünnschichtchromatogramm als einheitlich erweist
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   Rf48C    = 0,54;   Ruft21    = 0,65; Rf45 = 0,50;   Rf70    = 0,75; Rf in Chloroform-Methanol   (8 : 2)    = 0,40.
EMI27.1     


<tb>



  18. <SEP> BOC-Cys-Ser-(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)
<tb>  <SEP> Cys-Val-Leu-OII
<tb> 
846 mg (0,5 mMol) BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Val-Leu-OH werden in 8 ml Dimethylformamid gelöst und 350 mg (1,1 mMol) Quecksilber(II)acetat in 4 ml Methanol zugegeben. Aus der klaren Lösung beginnt sich nach etwa 5 Minuten ein gallertiges Produkt auszuscheiden. Man rührt das Reaktionsgemisch 60 Minuten bei Zimmertemperatur, verdünnt mit 50 ml Dimethylformamid und leitet dann 20 Minuten Schwefelwasserstoff und 15 Minuten Stickstoff hindurch. Der schwarze Niederschlag wird durch  Celite  abfiltriert und mit Dimethylformamid gewaschen. Das Filtrat engt man auf 40 ml ein und leitet 15 Minuten Stickstoff hindurch.

  Diese Lösung wird gleichzeitig mit einer Lösung von 170 mg (0,6 mMol) Dijodäthan in 40 ml Methanol bei Zimmertemperatur zu 20 ml Dimethylformamid und 20 ml Methanol innerhalb einer Stunde unter Rühren eingetropft. Nach 10 Stunden bei Zimmertemperatur wird das Lösungsmittel am Hochvakuum bei 400 abgedampft und der ölige Rückstand zunächst dreimal mit Petroläther, dann zweimal mit Wasser verrieben und lyophilisiert. Die Reinigung des bräunlichen Rohproduktes gelingt durch Gegenstromverteilung im System: Methanol-Puffer Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff   (10: 3 : 5 : 4).    Der Puffer wird aus 28,6 ml Eisessig und 19,25 g Ammoniumacetat, mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt, erhalten.

 

  Nach 135 Verteilungsschritten befindet sich das Produkt in den Elementen 49-63   (rmaX = 53;      K = 0,65).   



  Der Inhalt dieser Elemente wird zur Trockne eingedampft und über Nacht am Hochvakuum bei 400 vom Ammoniumacetat befreit. Es resultieren 254 mg eines chromatographisch einheitlichen Produktes.  



   Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist   RfrÏ    = 0,42;   Rfl2lA    = 0,70;   RfTo    = 0,75;   Rf53    = 0,43;   Rfnst    = 0,22.



   b) Zu einer gerührten Lösung von 3,73 g (14,78 mMol) Jod in 500 ml Methanol werden bei Zimmertemperatur 2,50 g (14,78 mMol)   BOC-Cys(TRI)-Ser-(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-    Cys(TRI)-Val-Leu-OH in 500 ml Methanol innert 45 Minuten zugetropft.



  Nach beendetem Eintragen rührt man 1 Stunde weiter und entfärbt dann die Lösung bei   0     mit   1 ,0-n.wässriger    Thiosulfatlösung (26,05 ml 1-n. Thiosulfat). Die klare Lösung wird am Wasserstrahlvakuum bei 300 auf etwa 100 ml eingeengt. Dann gibt man 1,5 1 Wasser zu, filtriert das ausgefallene Produkt und wäscht es mit Wasser. Nach dem Trocknen über Kaliumhydroxyd wiegt das Rohprodukt 2,3 g. Es wird zweimal mit Petroläther verrieben und zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloro   form-Tetrachlorkohlenstoff      (10 : 3 : 5 : 4)    entworfen.



  (Puffer: 28,6 ml Eisessig; 19,25 g Ammoniumacetat, mit Wasser auf   11    aufgefüllt). Nach 135 Schritten befindet sich das Hauptprodukt in den Elementen 50 bis 79   (rmax    =   64;    K= 0,96). Der Inhalt dieser Elemente wird zusammen am Hochvakuum (400) zur Trockne eingedampft und das Ammoniumacetat absublimiert.



  Das erhaltene
EMI28.1     


<tb> BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)
<tb>  <SEP> Cys-Val-Leu-OH
<tb>  (1,49   g = 83 %    der Theorie) erweist sich im Dünn   schichtchromatogramm    (Silicagel) als einheitlich. Es zeigt die gleichen Rf-Werte wie das unter a) beschriebene Produkt.



  19. Z-Tyr(tBu)-Try-OMe
Man gibt zu einer Lösung von 29,8 g Z-Tyr(tBu) OH in 190 ml Chloroform 11,1 ml Triäthylamin und 20,5 g H-Try-OMe-Chlorhydrat, rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur und kühlt dann auf 00. Bei dieser Temperatur tropft man eine Lösung von 29,9 g Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Chloroform zu. Man rührt 1 Stunde bei   0     und die ganze Nacht bei Raumtemperatur. Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffes wird die Lösung im Vakuum eingeengt, der Rückstand in Essigester aufgenommen und diese Lösung bei   0     mit   5 % iger    Zitronensäurelösung und 2n Natriumcarbonat ausgeschüttelt. Das nach Verdampfen des Essigesters erhaltene Öl wird an 1 kg Kieselgel chromatographiert.

  Das Rohprodukt wird in 250 ml Toluol auf die Säule gebracht, mit 9 Liter Toluol, 6,5 Liter Toluol-Chloroform (9: 1) und 15 Liter Toluol-Chloroform   (1 : 4)    eluiert. Die nach Dünnschicht   chrom ato gramm    reinen Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhält 27,9 g   Z-Tyr(tBu)-Try-OMe;    Rf = 0,65 in Chloroform-Aceton (1: 1) auf Silicagel.



  20.   H-Tyr(tBu)-Try-OMe   
26,2 g   Z-Tyr(tBu)-Try-OMe    werden in 520 ml Methanol gelöst in Gegenwart von 4 g 10 % iger Pal   ladium-Kohle    und 21,8 ml 2,1n Salzsäure bei Raumtemperatur hydriert. Nach beendigter Hydrierung wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum bei   30    zur Trockne eingedampft. Man erhält 22,0 g H-Tyr(tBu)-Try-OMe-Chlorhydrat Rf = 0,45 in Chloroform-Aceton   (1:1).   



  21. Z-Ala-Tyr(tBu)-Try-OMe
20,8 g H-Tyr(tBu)-Try-OMe,   HCl    werden in 40 ml Dimethylformamid gelöst, mit 16,7 g Z-Ala-ONP und 6,1 ml Triäthylamin versetzt und gerührt, bis die Mischung durchkristallisiert. Nach Stehenlassen über Nacht werden   3Q0    ml Essigester zugegeben, das unlös   lichte    Material wird abfiltriert und das Filtrat bei   0     mit verdünnter Kaliumcarbonatlösung nitrophenolfrei gewaschen, dann mit 0,1-m Zitronensäure und Wasser ausgeschüttelt. Nach Trocknen der Lösung und Verdampfen des Essigesters wird der Rückstand in 25 ml Chloroform gelöst, auf eine Säule aus 200 g Kieselgel aufgezogen und mit Chloroform eluiert. Das erhaltene Produkt wird aus Essigester-Hexan umkristallisiert. Das Z-Ala-Tyr(tBu)-Try-OMe schmilzt ab 1080 unter langsamer Zersetzung.

  Rf = 0,5 in Chloroform-Aceton (1:1).



  22. H-Ala-Tyr(tBu)-Try-OMe
10,3 g Carbobenzoxyverbindung von 21 werden in 200 ml Methanol in Gegenwart von 0,5 g   10 S iger    Palladium-Kohle wie vorher gezeigt hydriert. Das decarbobenzoxylierte Produkt zeigt Rf = 0,3 im System Chloroform-Methanol (9 : 1).



  23. DPC-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-OMe
8,3 g DPC-Ser(tBu)-OH (aus dem Cyclohexylammoniumsalz mit Zitronensäure freigesetzt) in 25 ml Essigester werden bei   - 100    mit 2,7 ml Triäthylamin und 2,7 ml Chlorameisensäureisobutylester versetzt.



  Nach 5 Minuten bei   -100    wird zum gemischten Anhydrid die Lösung von 8,1 g H-Ala-Tyr(tBu)-Try-OMe in 20 ml Dimethylformamid gegeben und 10 Minuten bei - 100, 2 Stunden bei   0     und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird mit Essigester verdünnt, bei   0     mit 0,1-m Zitronensäure und gesättigter Kaliumcarbonatlösung ausgeschüttelt, dann bei Raumtemperatur mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigester-Hexan umkristallisiert. Man erhält 10,5 g DPC-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-OMe vom F.   148-149     (Zersetzung). Rf = 0,7 im System Chloroform-Methanol (9 : 1).



  24.   DPC-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-NH-NH,   
1,34 g des Tetrapeptidderivats von 23 werden in 7,5 ml Methanol gelöst, mit 0,75 ml Hydrazinhydrat versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Durch Zugabe von 7,5 ml Methanol und 15 ml Wasser kristallisiert das DPC-Ser(tBu)-Ala Tyr(tBu)-Try-NH-NH2 aus. Das Produkt wird abgenutscht, gut mit 50   Sigem    Methanol und Wasser gewaschen und im Hochvakuum über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Das Produkt schmilzt ab 1360 unter langsamem Zersetzen. Rf = 0,35 im System Chloroform-Methanol (9: 1).

 

  25. Z-Asn-Phe-NHNH-BOC
1,4 g H-Phe-NHNH-BOC, 1,94 g Z-Asn-ONP und 3 ml Dimethylformamid werden bei Raumtemperatur gerührt, bis die Mischung erstarrt. Nach Stehenlassen über Nacht wird mit Äther verrieben, das Dipeptidderivat abfiltriert und mit Äther nitrophenolfrei gewaschen.



  Das Produkt beginnt bei 2110 unter Zersetzung zu schmelzen. Rf = 0,55 in Chloroform-Methanol   (8 : 2)    auf Silicagel.



  26. H-Asn-Phe-NH-NH-BOC
28,75 g der Carbobenzoxyverbindung von 25 wer  den, in 1 Liter Methanol gelöst, in Gegenwart von 2,9 g   10 % iger    Palladium-Kohle bei Raumtemperatur hydriert. Nach vollständiger Decarbobenzoxylierung wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das Produkt schmilzt bei   160-1610.   



  Rf = 0,15 in Chloroform-Methanol (8 : 2).



  27.   Z-Asn-Asn-Phe-NH-SH-BOC   
20,93 g H-Asn-Phe-NH-NH-BOC werden in 45 ml Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst, bei Raumtemperatur mit 22,7 g Z-Asn-ONP versetzt und gerührt, bis die Mischung erstarrt. Nach Stehenlassen über Nacht wird die feste Masse in 160 ml Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst, durch Eintropfen in 1 Liter Äther gefällt, das Produkt abfiltriert und mit Aceton nitrophenolfrei gewaschen. Rf = 0,24 in Chloroform-Methanol (8 : 2).



  28.   H-Asn-Asn-Phe-NHNH-BOC   
35,8 g der unter 27 beschriebenen Carbobenzoxyverbindung werden in 560 ml Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur gibt man 3,6 g 10 % Palladium-Kohle zu und hydriert.



  Nach vollständiger Decarbobenzoxylierung wird der Katalysator abfiltriert, die Dimethylformamid-Lösung auf etwa 100 ml eingeengt und das H-Asn-Asn-Phe NHNH-BOC durch Eintropfen in 1 Liter Äther gefällt. Rfloo = 0,35 auf Silicagel.



  29. Z-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-BOC
26,5 g H-Asn-Asn-Phe-NHNH-BOC werden in 58 ml warmem Dimethylformamid gelöst, bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 24,2 g Z-Leu-ONP in 16 ml Dimethylformamid versetzt und gerührt, bis die Mischung erstarrt. Nach Stehenlassen über Nacht wird mit Äther verrieben, abfiltriert, in 190   ml    Dime   thylfonnamid    gelöst und das Produkt durch Eintropfen in 1,5 Liter Äther wieder gefällt. Man filtriert ab und wäscht mit Äther nitrophenolfrei. Rf = 0,45 im System Chloroform-Methanol   (7 : 3)    auf Silicagel.



  30. H-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-BOC
36,0 g des unter 29 erhaltenen Carbobenzoxyderivats werden in 800 ml Dimethylformamid wie unter 28 beschrieben hydriert und aufgearbeitet. Man erhält 27,9 g H-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH-BOC.   RfJoo    = 0,35.



  31. Z-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-BOC
27,9 g   H-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-B OC    werden in 145 ml Dimethylformamid warm gelöst, bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 21,6 g Z-Asn-ONP in 20 ml Dimethylformamid versetzt und gerührt, bis die Mischung erstarrt. Nach Stehenlassen über Nacht wird wie bei 29 beschrieben aufgearbeitet. Man erhält 34,2   g= 88 %    d. Th. des Pentapeptidderivats.



     Rfroo    = 0,5.



  32. H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-BOC
34,2 g des unter 31 beschriebenen Pentapeptidderivats werden wie unter 30 beschrieben hydriert und aufgearbeitet. Das H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-BOC zeigt Rfioo = 0,2.



  33. Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH
BOC-Hydrochlorid
23,6 g Z-Arg-OH werden in 87 ml Dimethylformamid suspendiert und unter Kühlung mit kaltem Wasser mit 21,2 ml 3,6n Salzsäure in Dioxan versetzt, wobei Lösung eintritt. 28,2 g des unter 32 genannten Pentapeptidderivats werden in 440 ml Dimethylformamid warm gelöst, auf Raumtemperatur gekühlt und zu der Lösung von Z-Arg-OH, HC1 gegeben, dann noch 17,4 g Dicyclohexylcarbodiimid. Man lässt 24 Stunden rühren, filtriert vom auskristallisierten Dicyclohexylharnstoff ab und engt das Filtrat auf etwa 250 ml ein. Durch Eintropfen dieser Lösung in 2 Liter Äther wird das Rohprodukt gefällt. Dieses wird durch Eintragen unter Rühren in 280 ml heisses Dimethylformamid gelöst.



  Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Produkt mit 870 ml gesättigter Kochsalzlösung und 1740 ml Wasser ausgefällt. Das ausgefallene Produkt wird abgenutscht und gut mit halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Das feuchte Nutschgut wird in 1 Liter warmem Dimethylformamid gelöst und durch zweimaliges Einengen der Lösung azeotrop entwässert. Das ausgefallene Kochsalz filtriert man ab, das Filtrat wird in 2,4 Liter Acetonitril eingetropft, die entstandene Fällung nach einigen Stunden abfiltriert, mit Acetonitril und Ather gewaschen und im Vakuum bei 400 getrocknet. Das Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-BOC Hydrochlorid weist   Rfloo    = 0,25 auf.



  34.   ZArg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHNH2-   
Hydrochlorid
10,6 g des unter 33 beschriebenen Hexapeptidderivats werden unter Rühren und Eiskühlung in 50 ml 90 % iger Trifluoressigsäure gelöst, auf Raumtemperatur erwärmt und 20 Minuten bei dieser Temperatur belassen. Darauf wird die Lösung unter Rühren und Eiskühlung in 500 ml Äther eingetropft, die Fällung abfiltriert und mit Äther säurefrei gewaschen. Das Produkt wird in 90 ml warmes Dimethylformamid eingetragen, einige Zeit gerührt und darauf mit 1 Liter Äther in pulvriger Form ausgefällt. Dieses Rohprodukt wird mit 170 ml Isopropanol 1 Stunde bei Raumtemperatur verrührt, abfiltriert, mit Isopropanol und Äther gewaschen und im Vakuum bei 400 getrocknet. Man erhält das   Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NHN112-Hydrochlo-    rid, das   Rfs6    = 0,38 auf Silicagel aufweist.



  35. Z-Phe-Ser(tBu)-OCH3
27,0 g (90 mMol) Z-Phe-OH werden in 250 ml absolutem Tetrahydrofuran zusammen mit 12,5 ml (90 mMol) Triäthylamin gelöst und gekühlt. Bei   -180    werden 14,7 ml (112 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester zugetropft und eine halbe Stunde bei  <    -100       gerührt. Zu der weissen Suspension (Triäthylaminhydrochlorid) gibt man nun 18,1 g H-Ser(tBu)-OCH3-Hydrochlorid (85,5 mMol) in feingepulverter Form, verdünnt    mit 350 ml Tetrahydrofuran und lässt dann 15,0 ml (108 mMol) Triäthylamin in 100 ml Tetrahydrofuran zutropfen. Man rührt noch 3 Stunden bei etwa - 100 und dann über Nacht bei Zimmertemperatur. 

  Die Suspension wird dann am Vakuum auf etwa 250 ml eingeengt, in viel Essigsäureäthylester aufgenommen und mit verdünnter Zitronensäurelösung (3 x 200 ml), verdünnter Natriumcarbonatlösung (3 x 200 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (5 x 200 ml) ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das   Rohprodukt wird in 200 ml Essigsäureäthylester-Hexan (1: 1) gelöst. Aus der Lösung kristallisieren beim Ab-    kühlen weisse Drusen aus, die isoliert und getrocknet werden. Das Produkt schmilzt bei 92,5-94 .



       [&alpha;] D24 = + 3  0,5  (c = 2,2 % in Methanol).



  Bei das Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten
Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten    weist das Produkt folgende   Rf-Werbe    auf: In Chloro  form-Aceton   (1:1)    Rf = 0,70; in Chloroform-Methanol   (95 : 5) Rf    = 0,70;   Rf43A    = 0,65; Rf89 = 0,86.



  36. Z-Phe-Ser(tBu)-hydrazid
25,4 g Z-Phe-Ser(tBu)-OCH3 (55,7 mMol) werden in 250 ml Methanol gelöst und unter Eiskühlung mit 28 ml (575 mMol) Hydrazinhydrat versetzt. Die Lösung wird 67 Stunden im Kühlschrank belassen, wobei sich ein dicker Kristallkuchen bildet. Das Produkt wird isoliert und getrocknet. Es schmilzt bei 158,5-159,5 .



     []      2r)    = + 160   #    0,50 (c =   2,3 %    in Eisessig).



   Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelschichten ist Rf = 0,27 in   Chloroform-Methanol      (95 : 5);      Rfl3.s    = 0,57; Rf89 = 0,65.



  37.   Z-Phe-Ser(tBu)-Gly-OCH3   
18,4 g Z-Phe-Ser(tBu)-hydrazid (40,4 mMol) werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst und bei   -200    mit 41,6 ml Chlorwasserstoff in Äther (2,43-n., 101 mMol) versetzt. Zu der klaren Lösung gibt man 7,15 ml t-Butylnitrit (59 mMol) in 40 ml Dimethylformamid und spült mit 20 ml Dimethylformamid.



  Nach 10 Minuten bei Temperaturen unter - -9  gibt man 14,0 ml (101 mMol) Triäthylamin in 60 ml Dimethylformamid zu und trägt 8,85 g   H-Gly-OCH3-Hy-    drochlorid (70 mMol) ein. In Intervallen von 10 Minuten gibt man drei Portionen von je 5,6 ml Triäthylamin zu (insgesamt 121 mMol). Das pH beträgt dann etwa 8,5. Die   Kühlmischung    wird dann entfernt und drei Stunden bei 00, dann über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Einengen der Reaktionsmischung im Vakuum zu einer dicken Paste nimmt man diese in viel Essigsäureäthylester auf und wäscht die Lösung nacheinander mit 3 Portionen verdünnter Zitronensäurelösung, 3 Portionen verdünnter Natriumcarbonatlösung und 5 Portionen gesättigter Kochsalzlösung.

  Das nach dem Trocknen und Eindampfen der Lösung erhaltene Rohprodukt wird in Essigsäureäthylester gelöst, durch eine Glasfritte filtriert und mit etwa 800 ml Äther versetzt. Der geschützte Tripeptidester kristallisiert sehr langsam aus, F.   140-1410.   



     [Ia]    20 =   +    130 +   0,50    (c =   2,3   in Eisessig).   



   Im Dünnschichtchromatogramm auf   Silicagelschich-    ten ist in Chloroform-Methanol   (95 : 5)    Rf = 0,61; in   Chloroform-Aceton    (9:1) Rf = 0,28;   Rflo2E    = 0,82;   Rfisc    =   (),72.   



  38.   H-Phe-Ser(tBu)-Gly-OCHo   
7,4 g Z-Phe-Ser(tBu)-Gly-OCH3 werden in Methanol mit Wasserstoff in Gegenwart von 1,0 g Palladiumkohle   (10 %    Pd) decarbobenzoxyliert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird filtriert, eingedampft und das entstandene Rohprodukt direkt weiter verarbeitet. Das Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelschichten folgende Rf-Werte auf: in Chloroform-Methanol   (95 : 5):    Rf = 0,26;    Rfu    =   0,60;      Rfse    = 0,51.



  39. Z-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-OCH3-Hydrobromid
5,3 g Z-Arg-OH (17,3 mMol) werden in 15 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt und nach Kühlung mit Eis-Kochsalzgemisch mit 5,9 ml Bromwasserstoffsäure in Methanol (3,06-n., 18 mMol) versetzt. Nach kurzem Rühren entsteht eine klare, farblose Lösung. Dazu lässt man bei   -180    eine Lösung von 5,6 g H-Phe Ser(tBu)-Gly-OHC3 (14,4 mMol) in 15 ml Dimethylformamid zutropfen und gibt noch 7 ml Dimethylformamid zu. Dann fügt man eine Lösung von 3,85 g Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml Methylenchlorid zu, ersetzt nach 1 Stunde die   Kühlmischung    durch Eiswasser und lässt nach weiteren drei Stunden über Nacht bei Zimmertemperatur rühren.

  Der ausgefallene Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff wird dann abfiltriert, das Filtrat im Vakuum auf die Hälfte eingeengt, auf   0     gekühlt und in 600 ml   Äther    eingerührt. Von der resultierenden Fällung wird abdekantiert, der Niederschlag mit Äther gewaschen, in etwa 50 ml Methanol gelöst und wieder mit 600 ml Äther ausgefällt. Nach nochmaligem Lösen in Methanol wird eingedampft und am Hochvakuum getrocknet. Das Produkt zeigt im Dünn   schiditchromatogramm    auf   Silicagelschichten:   
Rf52 = 0,48;   Rfloo    = 0,54; auf Cellulose Selekta
Rf25 = 0,81 40.

  H-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-OCH3-Hydrochlorid
Hydrobromid
6,3 g Z-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-OCH3-Hydrobromid (8,5 mMol) werden in 350 ml Methanol gelöst und mit 2,9 ml Chlorwasserstoff in Dioxan (3,09-n., 8,9 mMol) versetzt. Man hydriert in Gegenwart von 1,2 g 10 % iger Palladium-Kohle bei Zimmertemperatur und Atmosphärendruck. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird filtriert, eingedampft, der erhaltene Rückstand in 30 ml Methanol gelöst und die Lösung in 700 ml   Ather    eingerührt. Dadurch entsteht eine gelbliche Paste, die nochmals in gleicher Weise gelöst und gefällt wird. Schliesslich wird das Produkt nochmals in Methanol gelöst, filtriert und eingedampft. Das Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelschichten folgende Werte auf:
Rf59 = 0,12; Rf96 = 0,38;   Rfloo    =   0,13.   



  41.   Z-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-OCH3   
Man schlämmt 7,6 g Z-His-NH-NH2 (25 mMol) in 60 ml Dimethylformamid auf, versetzt bei - 160 unit 31 ml Chlorwasserstoff in Äther (2,43-n., 75,3 mMol) und vermischt die dadurch erhaltene klare, gelbliche Lösung bei - -18  mit 3,2 ml t-Butylnitrit (95 % ig, 26,5 mMol) in 10 ml Dimethylformamid. Nach 10 Minuten werden 10,4 ml Triäthylamin (75 mMol) in 25 ml vorgekühltem Dimethylformamid und 8,5 g H-Arg-Phe   Ser(tBu)-Gly-OCH8,    2HCl (14 mMol) in 50   ml    vorgekühltem Dimethylformamid zugefügt. Es wird mit 40 ml Dimethylformamid verdünnt und in Intervallen von 5 Minuten 4 Portionen von je 1,0 ml Triäthylamin (insgesamt 28,7 mMol) zugegeben.

  Man lässt noch drei Stunden bei   0     und 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, filtriert dann von den ausgefallenen Salzen ab und engt die Reaktionslösung am Vakuum auf etwa 3/4 des Volumens ein. Durch wiederholtes Einrühren des Produktes in viel Essigester gewinnt man ein Rohprodukt, das durch Gegenstromverteilung im System
Methanol-Puffer-Chloroform
Tetrachlorkohlenstoff 9 : 3,5 : 8 : 2) über 130 Stufen gereinigt wird (Puffer wie unter 18);   rmax= 54;      K = 0,7).    Die reinen Fraktionen werden zusammengefasst, eingedampft, bei 400 am Hochvakuum vom Ammoniumacetat befreit und nach Lösung in Wasser lyophilisiert.

 

   Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelschichten ist Rf52A = 0,34; Rflola = 0,71;   Rfioi    = 0,76;   RfltlA    =   0,40.   



  42. H-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-OCH3, 2   CH8-COOH   
2,9 g   Z-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-OCH3    (3,3 mMol)  werden in 300 ml Methanol-Eisessig   (9 : 1)    unter Zusatz von 500 mg Palladium-Kohle (10   %    Pd) bei Zimmertemperatur und Atmosphärendruck hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird filtriert und am Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man über dem Rückstand zweimal je 50 ml Toluol eindampft. Das Produkt, ein weisses Pulver, zeigt in Dünnschichtchromatogrammen auf Silicagelplatten folgende Rf-Werte:    RflolB    = 0,51; Rf96 = 0,10;   RflllA    = 0,28; auf Cellulose Selekta Rf45 = 0,55;   Rf52s    =   0,44.   



  43. H-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-OH, CH3-COOH
2,84 g H - His - Arg - Phe - Ser(tBu) - Gly - OCH3, 2 CH3-COOH werden in 40 ml Wasser gelöst mit 15 ml 2-n-Piperidinlösung in Wasser 14 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Die klare, leicht gelbe Lösung wird dann mit 15 ml 2n wässriger Essigsäure neutralisiert, filtriert und lyophilisiert. Aus dem Lyophilisat, einer leicht gelben zerfliesslichen Masse, wird am Hochvakuum im Wasserbad von 600   Piperidinacetat    abgetrieben. Nun wird in 10 ml Methanol gelöst und in 400 ml Essigsäureäthylester eingerührt. Die weisse, flockige Fällung wird filtriert, mit Essigester gewaschen und getrocknet. Man erhält 2,0 g reines Produkt in Form eines weissen Pulvers.



   Im Dünnschichtchromatogramm auf   Silicageischich-    ten ist Rf101B = 0,45; Rf121 = 0,47; auf Cellulose Selekta: Rf45 = 0,48; Rf55 = 0,38; Rf90 = 0,36.



   In der Papierelektrophorese (Papier S+S 2043 6; 5 Stunden; 2000 Volt; pH 6,3) wandert die Substanz 6,5 cm zur Kathode. In der Elektrophorese auf Selekta Cellulose-Platten (pH 6,3; 3 Stunden; 1000 Volt) wandert die Substanz 8,5 cm zur Kathode.



  44.   Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-   
Ser(tBu)-Gly-OH, CH3-COOH
3,77 g   Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NHe    werden in 100 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt und nach Kühlung mit einem Eiskochsalzbad mit 3,0 ml Chlorwasserstoff in Dioxan (3,09-n., 9,27 mMol) versetzt. Ein Teil der Suspension geht in Lösung. Nun gibt   man bei - 100 0,5 ml t-Butylnitrit (95 % ig, 4,14 mMol)    zu. Nach 5 Minuten bei -10 bis   -      120    gibt man nochmals 0,08 ml t-Butylnitrit zu. Nach insgesamt 11 Minuten Reaktionsdauer gibt man 1,29 ml Triäthylamin (9,26 mMol) zu und gleich darauf die vorgekühlte Lösung von 2,40 g   H-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-0H,    CH3-COOH (3,6 mMol) in 30 ml Dimethylformamid, dann noch 20 ml kaltes Dimethylformamid.

  In vier Portionen gibt man nun innerhalb 2,5 Stunden 1,08 ml Triäthylamin (7,8 mMol) zu, das pH bewegt sich zwischen 7 und 8. Man belässt den Ansatz über Nacht bei   0     und gibt am Morgen die Lösung des auf gleiche Art wie oben beschrieben aus 1,81 g Z-Arg-Asn-Leu-Asn   Asn-Phe-NH-NHs    hergestellten Azids zu, dann noch 0,62 ml (4,47 mMol) Triäthylamin. Wiederum belässt man den Ansatz über Nacht bei 00, engt am Morgen am Vakuum bei einer Badtemperatur von 450 auf etwa
15 ml Volumen ein und rührt den Ansatz in 800 ml Essigester ein. Das abfiltrierte Rohprodukt wird mit Essigester gewaschen und getrocknet. Es wird einer
Gegenstromverteilung im System n-Butanol-Eisessig
Wasser (4: 1: 5) über 300 Stufen unterworfen;   rrna =    94; K= 0,46.

  Die durch Dünnschichtchromatographie ermittelten reinen Fraktionen werden kombiniert, eingedampft, in Wasser gelöst, filtriert und lyophilisiert.



   Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelschichten:   RflolB    =   0,56;    Rf104 = 0,07; auf Cellulose Selekta: Rf45 =   0,37.   



  45. H-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe    Ser(tBu)-Gly-OH,    2 CH3-COOH
1,48 g Z-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe Ser(tBu)-Gly-OH werden in 350 ml Dimethylformamid Wasser (4: 1) unter Zusatz von 700 mg 10 % iger Palladium-Kohle bei Zimmertemperatur und Atmosphärendruck hydriert. Nach 15 Stunden Schütteln unter Wasserstoffatmosphäre wird filtriert, am Vakuum eingedampft, in Wasser gelöst und lyophilisiert. Das reine Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelplatten folgende Rf-Werte:
Rf101B = 0,42; Rf101A = 0,34; auf Cellulose Se lekta: Rf45 = 0,27; auf Alox-Camag: Rf53A = 0,51;
Rf111A = 0,28; Rf121= 0.27.



  46. DPC-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu
Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-OH
756 mg   DPC-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-NHNH2    in 15 ml entgastem Dimethylformamid werden bei   - 300    mit 0,6 ml 3,6n Chlorwasserstoff in Dioxan und anschliessend mit 0,124 ml t-Butylnitrit versetzt. Nach 15 Minuten bei   -150    werden 1,7 ml 2n Natriumcarbonatlösung zugetropft (pH 7-8) und das Azid mit eiskaltem Wasser ausgefällt. Die Fällung wird abgenutscht und mit eiskaltem Wasser gewaschen. Man löst 272 mg H-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe
Ser(tBu)-Gly-OH, Acetat durch leichtes Erwärmen in 5,5 ml Dimethylformamid, gibt bei Raumtemperatur 0,51 ml l-m. Triäthylamin in Dimethylformamid zu und versetzt die Lösung bei   0     mit dem oben hergestellten festen Azid.

  Die Nutsche wird noch mit 4 ml kaltem Dimethylformamid und 2 ml kaltem Essigester ausgewaschen. Die Lösung wird nun bei   0     gerührt, wobei nach 20 Minuten 0,5 ml Wasser und nach 2 Stunden 0,05 ml   l-m.    Triäthylamin in Dimethylformamid zugegeben werden. Nach 4 Stunden wird das Reaktionsgemisch mit viel Äther gefällt. Dabei erhält man das zuerst ölig ausfallende Produkt nach mehrmaligem Verreiben mit   Ather    und Umfällen aus   Methanol-Äther    als flockiges Produkt. Das erhaltene Rohprodukt wird durch Craig-Verteilung über 150 Stufen im Gemisch   Methanol-Puffer-Chloroform-Tefta-    chlorkohlenstoff   (10 : 3 7 : 4)    (Puffer wie unter 18) gereinigt. Die reine Substanz befindet sich in den Verteilungselementen 75-112.

  Diese werden vereinigt, die organischen Lösungsmittel im Vakuum entfernt und die - wässrige Lösung lyophilisiert. Man erhält das geschützte Pentadecapeptid, das bei Chromatographie an Silicagel im System Essigester-Pyridin-Wasser (49 : 24 : 27) Rf = 0,4 zeigt.

 

  47. Z-Gly-Phe-Gly-Pro-OtBu
Man löst 15,5 g Z-Gly-Phe-Gly-OH [dargestellt nach J. R. Vaughan  & J. A. Eichler, J. Am. Chem.



  Soc. 75, 5556 (1953)] in 100 ml absolutem Tetrahydrofuran und 5,3 ml absolutem Triäthylamin und lässt zu der auf   - 200    gekühlten Lösung unter Rühren 4,64 ml Isobutylchlorocarbonat so zutropfen, dass die Innentemperatur   - 150    nicht übersteigt. Hierauf wird
10 Minuten bei   - 100    reagieren gelassen, dann wieder auf   -200    gekühlt und eine Lösung von 7,6 g H-Pro OtBu in 30 ml Dimethylformamid unter Rühren derart zugetropft, dass die Innentemperatur   0     nicht übersteigt.



  Man lässt 18 Stunden bei   0     stehen, saugt dann vom   Triäthylamin-hydrochlorid ab und dampft das Filtrat bei 400 Badtemperatur ein. Der Rückstand wird in 200 ml Essigester gelöst und die Lösung mit Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 10 % ige Weinsäurelösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigester Petroläther kristallisiert F.   66-710;     [a] D =   -450    (c =   1%    in Chloroform).



  48. Z-Gly-Phe-Gly-Pro-OH
Man löst 25,6 g Z-Gly-Phe-Gly-Pro-OtBu in 260 ml 90 % iger Trifluoressigsäure und lässt die Lösung 20 Minuten bei 220 stehen. Hierauf wird am Rotationsverdampfer bei 250 Badtemperatur bis zur öligen Konsistenz eingeengt, dann gibt man 250 ml Wasser zu und knetet die zähe Masse bei   0     durch. Die wässrige Phase wird abdekantiert und der Rückstand noch zweimal mit je 100 ml Wasser in gleicher Weise gewaschen. Hierauf wird er im Hochvakuum bei 300 Badtemperatur getrocknet. Der dabei erhaltene Rückstand wird mit 600 ml   Äther-Petroläther    (1: 1) versetzt, zerrieben, abgenutscht und getrocknet. Das Produkt wird direkt weiter verarbeitet.



  49. Z-Thr(tBu)-Pro-NH2
Man löst 5,27 g ZThr(tBu)-OH und 1,56 g H-Pro-NH2 in 60 ml Acetonitril, kühlt die Lösung auf   0     und versetzt mit 3,11 g Dicyclohexylcarbodiimid.



  Nach 1 Stunde bei   0     und 20 Stunden bei Raumtemperatur wird vom Dicyclohexylharnstoff abgenutscht, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen. Die Essigesterlösung wird mit verdünnter Zitronensäurelösung, Sodalösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der farblose Rückstand zeigt bei Dünnschichtchromatographie an Silicagelplatten    Ruf45    = 0,76;   Rf43C    = 0,70; Rf52 = 0,62.



  50.   H-Thr(tBu)-Pro-NH2-hydrochlorid   
5,88 g   Z-Thr(tBu)-Pro-NH2    werden in 200 ml Methanol und 13,7 ml   1n      HCl    gelöst und in Gegenwart von 660 mg Palladium-Kohle   (10 %    Pd) hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird bei 350 Badtemperatur zur Trockne eingedampft und getrocknet. Der Rückstand wird aus   Äthanol-Äther    kristallisiert; F.   170-1730.   



  51.   Z-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NHz   
Man suspendiert 3,0 g   H-Thr(tBu)-Pro-NH2-hydro    chlorid und 4,92 g Z-Glu(OtBu)-ONP in einem Gemisch von 10 ml Dimethylformamid und 1,64 ml Tri äthylamin. Das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden bei 300 gerührt, hierauf mit 150 ml Essigester verdünnt und die Essigesterlösung bei   0     viermal mit je 50 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung, 50 ml Wasser,   2 x 50    ml   ölige    Zitronensäurelösung und   2 x 50    ml Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Eindampfrückstand wird aus Essigester-Hexan kristallisiert, F.   159-1610.   



  52. H-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2
4,4 g Z-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2 werden in 120 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,2 g Palladiumkohle   (10%    Pd) hydriert. Nach Beendigung der Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht und das Filtrat eingedampft, wobei das Tripeptidderivat als kristalline Kruste anfällt. Es zeigt bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten den   Rf-Wert =0,50    im System Chloroform-Methanol   (9:1).   



  53.   Z-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2   
Man löst 4,47 g Z-Gly-Phe-Gly-Pro-OH und 3,00 g H-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2 in 40 ml Acetonitril und versetzt die Lösung mit 1,76 g Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 12 Stunden bei 250 wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und die Lösung mit Weinsäurelösung, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird zur Reinigung zweimal aus Essigester-Lösung durch Zugabe von Petrol äther umgefällt. Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten ist    Rf43c    = 0,52; Rfs2 =   0,57.   



  54. H-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2
Man löst 3,95 g Z-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu) Thr(tBu)-Pro-NH2 in 80 ml Methanol und hydriert die Lösung in Gegenwart von 600 mg Palladium-Kohle (10 % Pd). Nach Beendigung der Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht, das Filtrat auf ein Volumen von 10 ml eingedampft, 20 ml Benzol zugegeben, nochmals auf 10 ml eingeengt und das Produkt mit 70 ml Petroläther ausgefällt. Die schmierige Fällung wird zu einem Pulver zerrieben, abgenutscht und getrocknet; Ausbeute 3,3 g. Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten ist    Rfac    = 0,27;   Rf5    = 0,24; Rf in Chloroform
Methanol   (8 : 2) =    0,10.



  55. DPC-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)    Thr(tBu)-Pro-NH2   
Man suspendiert 3,72 g DPC-Methionin (G. Nummer 17108/67, Case 6106/1-3) und 5,21 g H-Gly-Phe   Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2    in 30 ml Acetonitril und gibt dann 1,98 g Dicyclohexylcarbodiimid zu.



  Nachdem die Luft im Reaktionsgefäss durch Stickstoff verdrängt worden ist, wird 20 Stunden bei 300 gerührt.



  Sodann wird mit 45 ml Methanol verdünnt, leicht erwärmt und dann vom noch ungelösten Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und bei   0     wie unter 52 beschrieben, neutral gewaschen.



  Die Essigesterlösung hinterlässt beim Trocknen und Eindampfen 9,12 g farbloses Produkt, das aus Essigester-Hexan kristallisiert; F. 1820. Bei Dünnschichtchromatographie an Silicagelplatten ist    Rf4e    = 0,64, Rf in Chloroform-Methanol (9:1)  = 0,30.

 

  56. H-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)    Thr(tBu)-Pro-NH,   
3,0 g des unter 55 erhaltenen   Octapeptidderivats    werden in 35 ml Methylenchlorid gelöst und bei Raumtemperatur mit 28 ml eines Gemisches von Monochloressigsäure und Wasser (3 :1) versetzt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wird in 170 ml eiskalte, 2n Sodalösung eingegossen. Das sich dabei abscheidende Octapeptidderivat wird mit 200 ml n-Butanol-Essigester   (1: 1)    extrahiert und die organische Phase mit Wasser neutral gewaschen. Sodann wird zur Trockne eingedampft, wobei das Octapeptidderivat mit freier Aminogruppe als farbloser Rückstand erhalten wird, der bei Dünnschichtchromatographie an Silicagelplatten    Rftoo    = 0,23 und Rf43C = 0,51 zeigt.  



  57.   Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-   
Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-OH, Ditosylat
258 mg des unter 46 beschriebenen Pentadecapeptid-diacetats werden bei 400 in 4 ml absolutem Pyridin gelöst und dann bei   0     mit 1,025 ml einer 4 % igen Lösung von Toluolsulfosäure-monohydrat (2 Äquivalente) versetzt. Die Lösung wird im Hochvakuum bei 350 Badtemperatur zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Äther zerrieben. Hierauf wird abgenutscht und getrocknet (bei 300), wobei das Ditosylat als festes Pulver erhalten wird.



   RflOlA = 0,58;   Rfno    = 0,09;   Ruf57    = 0,48.



  58. DPC-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu
Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met
Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2
254 mg des unter 57 erhaltenen Ditosylates, 138 mg H-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)
Pro-NH2 und 22,3 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 1 ml Dimethylformamid unter Erwärmen auf 600 gelöst und die auf 250 gekühlte Lösung mit 0,3 ml einer Dimethylformamidlösung versetzt, die 30 mg Dicyclohexylcarbodiimid enthält. Das Reaktionsgemisch wird unter Stickstoff 4 Stunden bei 250 und 12 Stunden bei 450 belassen, der abgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat mit einem Gemisch von 15 ml Benzol und 40 ml Petroläther gefällt. Der entstehende Niederschlag wird abzentrifugiert, getrocknet und nach Lösen in 2,5 ml Dimethylformamid nochmals durch Zugabe von 30 ml Benzol-Petroläther   (1 : 2)    gefällt.



  Nach Abdekantieren der Lösung wird der Niederschlag getrocknet. Ausbeute 390 mg Rohprodukt. Zur Reinigung wird multiplikativ verteilt über 200 Stufen im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff   (10 : 3 : 6 : 5;    Puffer wie unter 18). Das reine Produkt wird aus den Elementen 103-132 gewonnen, das Maximum befindet sich im Element 122 (K = 1,5).



  Die Ausbeute beträgt 213 mg;    Rollo    = 0,36; Rf52A = 0,25;   Rf96    = 0,42.



  59.   H-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-       Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met-Gly
Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2-tritosylat   
Man löst 210 mg des unter 58 erhaltenen geschützten   Tricosapeptidamids    in 10 ml Eisessig-Ameisensäure   (83 S)-Wasser      (7: 1 : 2)    und lässt die Lösung 1 Stunde bei 300 stehen. Dann wird das Produkt mit freier a-Aminogruppe durch Zugabe von 100 ml Äther ausgefällt und abzentrifugiert. Der Überstand wird mit 25 ml Petroläther versetzt, auf ein Volumen von 30 ml eingeengt und die dabei entstehende Fällung abzentrifugiert. Beide Niederschläge werden vereinigt und in 5 ml   Methanol-0,1-m.    Essigsäure (2:1) gelöst. Die Lösung wird über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr.

  II in der Acetatform filtriert (Säule 9 mm; 125 mm). Das Eluat wird auf 2 ml eingeengt und dann lyophilisiert. Hierauf trocknet man im Hochvakuum bei 450 bis zur Gewichtskonstanz und löst den Rückstand in 10 ml   90 S igem    Pyridin. Dann gibt man 27 mg Toluolsulfosäure-monohydrat zu und dampft die Lösung im Hochvakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird in 2 ml Wasser gelöst, die Lösung lyophilisiert und hierauf im Hochvakuum bei 400 getrocknet.



  Dabei werden 17 mg Tritosylat des geschützten Tricosapeptidamids mit freier a-Aminogruppe erhalten.



     Rf9s    = 0,27; RflolA = 0,58; Rf87 = 0,15.
EMI33.1     


<tb>



  60. <SEP> BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)
<tb>  <SEP>    Cys-Val-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-    <SEP> 
<tb>    Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met-    Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu) -Thr(tBu)-Pro-NH2
EMI33.2     


<tb>  <SEP> 675 <SEP> mg <SEP>    BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr-    <SEP> 
<tb> (tBu)-Cys-Val-Leu-OH, <SEP> 1,30 <SEP> g <SEP> des <SEP> unter <SEP> 59 <SEP> erhaltenen
<tb>  Tritosylats der Sequenz 10-32, 38 mg N-Methylmorpholin und 86 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 7 ml frisch destilliertem Dimethylformamid unter Erwärmen auf 700 gelöst. Sodann kühlt man die Lösung auf 250 ab und gibt 115 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu. Die Reaktionsmischung wird unter Stickstoff 9 Stunden bei 250 und 8 Stunden bei 450 stehengelassen.

  Hierauf wird vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat mit 80 ml Benzol und 400 ml Petroläther versetzt. Das dabei ausfallende rohe geschützte Dotriacontapeptidamid wird in 25 ml Methanol gelöst und durch Zugabe von 100 ml Benzol und 250 ml Petrol äther ausgefällt. Hierauf wird der Niederschlag abgenutscht und getrocknet.



   Zur Reinigung wird einer multiplikativen Verteilung im System Methanol-Puffer (wie unter 18) - Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10 : 3 :   6 : 5)    über 300 Stufen unterworfen (Phasenvolumen: 25 ml). Dünnschichtchromatographische Kontrolle (Systeme wie unten) ergibt, dass die Fraktionen 101-130 die reine, geschützte Sequenz 1-32 enthalten (Maximum Element 116, K = 0,63).



   Bei Dünnschichtchromatographie an Silicagel ist Rf52 = 0,20;   Rf > G    = 0,44;   Rftoo    = 0,23; Rf87 = 0,69; auf Aluminiumoxyd ist Rf45 = 0,67.
EMI33.3     


<tb>



  61. <SEP> BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)
<tb>  <SEP> Cys-Val-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu) <SEP> -Try-Arg-Asn  Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-OH
EMI33.4     


<tb>  <SEP> 145 <SEP> mg <SEP> BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr
<tb> (tBu)-Cys-Val-Leu-Oh <SEP> in <SEP> 0,7 <SEP> ml <SEP> entgastem <SEP> Dimethyl  formamid und 0,116 ml einer 1-m. Lösung von N-Methylmorpholin in Dimethylformamid werden bei   - 150    mit 0,116 ml einer   l-m.    Lösung von   Pivaloylchlorid    in Dimethylformamid versetzt. Nach 3 Minuten bei - 10 bis - 150 wird eine Lösung von 172 mg H-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-OH, diacetat in 0,4 ml Dimethylformamid und 0,04 ml einer 1-m.



  Lösung von N-Methylmorpholin in Dimethylformamid zugetropft. Nach 30 Minuten bei -5 bis - 100 wird mit Äther gefällt und das feste Produkt isoliert. Dieses Rohprodukt wird durch Craigverteilung über 530 Stufen gereinigt; System: Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff   (10 :    3 : 7 : 4) (Puffer wie unter 18).

 

  Die reinen Fraktionen (Verteilungskoeffizient: 0,9 bis 0,95) werden vereinigt, das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und die verbleibende wässrige Lösung lyophilisiert. Man erhält 155 mg eines weissen Pulvers.



     Rfg6    = 0,4;   Rf43G    = 0,18.
EMI33.5     


<tb>



  62. <SEP> BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys    Val-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-    Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met   Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2     
EMI34.1     


<tb>  <SEP> 99 <SEP> mg <SEP>    BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-    <SEP> 
<tb> Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try    Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-    Gly-OH, 2   HCl    und 85 mg des unter 56 erhaltenen Peptids der Sequenz 25-32 werden unter Überleiten von Stickstoff mit 10 mg N-Hydroxy-succinimid, gelöst in 0,4 ml Dimethylformamid, versetzt und bei 400 gerührt, bis alles gelöst ist. Nach Zugabe von 12,5 mg Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 0,1 ml Dimethylformamid, wird noch 12 Stunden bei 400 gerührt.

  Mit 8 ml peroxidfreiem Äther wird das Rohprodukt ausgefällt und abzentrifugiert. Zur Reinigung wird, wie unter 60 beschrieben, verteilt. Das erhaltene Produkt ist mit dem unter 60 beschriebenen vollständig identisch.



   Beispiel 2
EMI34.2     


<tb>   H-Cys-S <SEP> er-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-    <SEP> 
<tb>  Tyr-Tru-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 (Thyrocalcitonin)
EMI34.3     


<tb> 300 <SEP> mg <SEP> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val  Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg(H2+)-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-His-Arg(H2+)-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met Gly-Phe-gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2 werden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Trifluoressigsäure zur Abspaltung der Schutzgruppen hydrolysiert, in das Acetat überführt und durch   Gegenstromvertef-    lung gereinigt. Das Produkt erweist sich nach Dünnschichtchromatographie und Elektrophorese auf Cellulose-Acetatfolie als mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Dotriacontapeptidamid identisch. Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1.

  BOC-Val-Leu-OBzl
19,9 g (92 mMol) BOC-Val-OH werden in 200 ml frisch destilliertem Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst, nach Abkühlen auf 0  25,9 ml absolutes Triäthylamin zugegeben, und die auf - 10  gekühlte Lösung mit 8,64 ml Chlorkohlensäure-äthylester versetzt. Nach 10 Minuten bei   -100    wird eine Lösung von 23,2 g (90 mMol) H-Leu-OBzl.   HC1    in 90 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei - 10 , 3 Stunden bei 0  und 16 Stunden bei 20  belassen. Dann wird vom Ungelösten abfiltriert und das Filtrat am Hochvakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und die Lösung mit verdünnter Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.

  Nach Zugabe von Petroläther kristallisiert das Produkt über kuum über Ätznatrion getrocknet.



   F.128-129,5 ; Rf2 =0,65 Rf4 (c = 2 in Dimethyl formamid); Rf2 = 0,73.



  2. H-Val-Leu-OBzl-HCl
22,8 g (54 mMol) BOC-Val-Leu-OBzl werden in 228 ml Methylenchlorid gelöst. Durch diese Lösung wird während 1 1/2 Stunden gasförmiger Chlorwasserstoff geleitet. Nach Eindampfen zur Trockne wird der Rückstand dreimal mit   Ather    verrieben.



   F.   192-1950.    Rf2 =   0727.   



  3.   BOC-Cys(Bzl)-Val-Leu-OBzl   
14,2 g (32,8 mMol) BOC-Cys(Bzl)-ONP und 11,7 g (32,8 mMol) H-Val-Leu-OBzl.   HCl    werden in 137 ml Dimethylformamid gelöst und zu der auf   0     gekühlten Lösung werden 4,7 ml Triäthylamin und 0,5 ml Eisessig zugegeben. Die gelbe Suspension wird 3 Stunden bei   0     und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.



  Nun wird vom ausgefallenen   Triäthylamin-Hydrochlo-    rid abfiltriert, und das Filtrat am Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester gelöst und ausgesch2ttelt, und zwar zweimal mit Wasser, zweimal mit 0,1n Salzsäure, zweimal mit 10 %iger Kochsalzlösung, sechsmal mit 10 % Sodalösung und zweimal mit gesättigter Kochsalzlösung. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft zur Trockne. Aus Essigester/Petroläther kristallisiert das geschützte Tripeptid vom F.   113-115 ;       [&alpha;] D20    -33  (c = 1 in Dimethylformamid); Rf3  =   0,30.   



  4. H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OBzl,TFA
10 g (16,3 mMol) BOC-Cys(Bzl)-Val-Leu-OBzl werden in 20 ml 90 % iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen. Hierauf wird 200 ml peroxydfreier   Äther    zugegeben und 2 Stunden unter Eis/Kochsalz Kühlung gerührt. Die Fällung wird abgenuischt und zweimal mit peroxydfreiem Äther gewaschen und im Vakuum über Ätznatron getrocknet.



   F.   168-1730;      Rf4 =    0,77.



  5. BOC-Ser-Thr-OBzl
Man gibt zu einer Lösung von 14,7 g (38,2 mMol) BOC-Ser-OH, Dicyclohexylammoniumsalz in 100 ml Methylenchlorid 9,4 g (38,2 mMol)   H-Thr-OBzl, HC1    und 60 ml Methylenchlorid, rührt 10 Minuten bei Raumtemperatur und kühlt dann auf   -5 .    Bei dieser Temperatur tropft man eine Lösung von 8,0 g (38,6 mMoI) Dicyclohexylcarbodiimid in 18 ml Methylenchlorid zu. Man rührt 3 Stunden bei   -5     und die ganze Nacht bei Raumtemperatur. Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffes und Dicyclohexylamin-Hydrochlorids wird die Lösung ausgeschüttelt, und zwar dreimal mit 0,1n Salzsäure, zweimal mit 20 % iger Kochsalzlösung, ein mal mit   10 % iger    Natriumbicarbonatlösung und zweimal   mit 20 %    iger Kochsalzlösung und über Natriumsulfat getrocknet.

  Die Lösung wird auf etwa 100 ml eingeengt, auf   5     gekühlt und von weiterem   Dicyclohexylkernstoff abfiltriert. Eindampfen    zur Trockne ergibt 15,8 g Ester. Zur Reinigung wird das Produkt aus Essigester-Hexan kristallisiert.



   F. 110-111    [&alpha;]    20 -8,5  (c = 2 in Dimethyl    formamid); @; [&alpha;] = 33    6.   H-Ser-Thr-OBzl,TFA   
9,3 g (23,5 mMol) BOC-Ser-Thr-OBzl werden gelöst in 13,8 ml 90 % iger Trifluoressigsäure und die Lösung 20 Minuten bei 22  belassen. Hierauf wird sie unter Rühren in 138 ml trockenen   Äther    eingetropft, eine Stunde gerührt, und 2 Tage bei   -100    stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und dreimal mit trockenem   Äther    gewaschen und im Vakuum über Ätznatron getrocknet.

 

   F.   12S1290;      Rf*    = 0,65; Rf4 = 0,50.



  7.   BOC-Asn-Leu-NgHg-Z       34,8 g (150 mMol) BOC-Asn-OH werden in g 300 ml    Acetonitril aufgeschlämmt und mit 38 g (150 mMol) Woodwards Reagenz K versetzt. Dann lässt man unter Rühren und Kühlen 21 ml (150 mMol) Triäthylamin so zutropfen, dass die Innentemperatur +300 nicht   übersteigt. Nach beendetem Eintragen wird noch 45 Minuten bei 250 gerührt. Zu der fast klaren Lösung gibt man 52,2 g (165 mMol)   H-Leu-N2H2-Z,    HCI und 23 ml (165 mMol) Triäthylamin in 185 ml Acetonitril, rührt das bald erstarrende Reaktionsgemisch über Nacht bei Zimmertemperatur, kühlt auf   -100    ab und rührt noch 2 Stunden bei -10 . Hierauf nutscht man die kristalline Fällung ab und wäscht das Dipeptidderivat einmal mit kaltem Acetonitril, einmal mit Essigester und achtmal mit Wasser bis chloridfrei.

  Das erhaltene Produkt wird bei 400 im Vakuum getrocknet.



   F.   194-196 ;      [&alpha;]    30 -39 (c = 2 in Dimethylform amid); Rf1 = 0,45.



  8.   H-Asn-Leu-NH2-Z,TFA   
46,3 g (94 mMol)   BOC-Asn-Leu-N2H2-Z    werden in 92,6 ml 90 % iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei 200 belassen. Darauf wird die Lösung unter Rühren in 975 ml Äther eingetropft und 15 Minuten gerührt. Man dekantiert den Äther von der Fällung, gibt aufs neue 210 ml   Ather    zu und rührt 1 Stunde bei 350 unter Rückfluss, kühlt auf   -100    ab, und filtriert das Produkt nach einigen Stunden ab. Es wird im Vakuum über   Atznatron    getrocknet.



   F.   175-1790;    Rf4 = 0,46.



  9.   BOC-Ser-Asn-Leu-N2H2-Z   
16 g (78 mMol) BOC-Ser-OH werden in 200   ml    Acetonitril gelöst, die Lösung gekühlt auf   0     und mit 20 g (78 mMol) Woodwards Reagenz K und 11 ml Triäthylamin versetzt. Nach 11/2 Stunden Rühren bei   0     wird zu der klaren Lösung 39,6 g (78 mMol) H Asn-Leu-N2H2-Z,TFA und 11 ml Triäthylamin in 200 ml Dimethylformamid zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird die Lösung am Hochvakuum bei 500 eingedampft, der ölige Rückstand in 500 ml Essigester aufgenommen, zweimal mit 0,2n Salzsäure, zweimal mit 10 % iger Kochsalzlösung, zweimal mit 10 % iger   Natriumbicarbonatlösung    und zweimal mit   10 S iger    Kochsalzlösung ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet, und auf 100 ml eingeengt.

  Nach Zugabe von 20 ml Hexan kristallisiert das Tripeptidderivat aus. Zweimaliges Kristallisieren aus Essigester 10 % Wasser ergibt einheitliches BOC   Ser-Asn-Leu-N2Hs-Z.   



   F. 149-151 ;   [&alpha;]    20 - 18,5  (c = 2 in Dimethyl formamid); Rf1 = 0,33.



  10. BOC-Ser-Asn-Leu-N2H3
15,3 G (26,7 mMol) BOC-Ser-Leu-N2H2-Z werden in 456 ml Dimethylformamid in Gegenwart von 2,4 g Pd-Kohle   (10 %)    bei Zimmertemperatur hydriert.



  Die Reduktion ist nach 5 Stunden vollendet. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Hochvakuum eingeengt. Dreimaliges Verreiben mit   Ather    liefert ein weisses Pulver.



   F.   179-1810;    [a]   2D0 140    (c = 2 in Dimethyl formamid); Rf6 =   0,73.   



  11. BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl
8,4 g (18,7 mMol) BOC-Ser-Asn-Leu-N2H3 in 49 ml Dimethylformamid werden bei -20  mit 19,1 ml Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran  (1,97-n; 37,6 mMol) und 2,53 ml iso-Amylnitrit versetzt. Nach 8 Minuten bei -20  wird eine vorgekühlte Lösung von 8 g (18,7 mMol) H-Ser-Thr-OBzl. 1,13 TFA und 8,3 ml Triäthylamin in 49 ml Dimethylformamid zugegeben.



  Das Reaktionsgemisch wird 3 Tage bei   0     belassen.



  Dann   wird    vom ausgeschiedenen Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert, das Filtrat im Hochvakuum bei 400 auf 40 ml eingeengt, unter Rühren mit 400   ml    Essigester versetzt, und über Nacht bei   -100    belassen.



  Die Fällung wird abgenutscht und zweimal mit Essigester gewaschen. Das noch feuchte Rohprodukt wird mit einer Mischung von 60 ml 0,03n Salzsäure und 40 ml Essigester verrührt, und über Nacht bei   -100    belassen. Am folgenden Morgen wird von der Fällung abdekantiert, der Rückstand gelöst in Aceton-Wasser, am Wasserstrahlvakuum das Aceton abgedampft, wobei das in Wasser unlösliche Pentapeptidderivat ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet, und aus Dimethylformamid-Essigester kristallisiert.



   F.   207-2080;    [a] 20   -19,50    (c = 2 in   Dimethylform    amid); Rf6 =   0,88.   



  12. BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH
10 g (14,1 mMol) BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl werden in 300 ml Dimethylformamid unter Zusatz von 1,25 g Pd-Kohle   (10 %)    bei Zimmertemperatur und Atmosphärendruck hydriert. Die Reduktion ist nach 2,5 Stunden vollendet. Die Lösung wird über Asbest vom Katalysator abfiltriert und am Hochvakuum eingeengt. Dreimaliges Verreiben des Rückstandes mit   Ather    liefert ein laut Dünnschichtchromatogramm einheitliches Pentapeptid.



   F.   141-1440;    [a]   2r)      -130    (c = 2 in   Dimethyl    formamid);   Rfs    =   0,34.   



  13. H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH,TFA
8,5 g (13,7 mMol) BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH werden in 85 ml 90 % iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei 200 belassen. Darauf wird die Lösung auf etwa 25 ml eingeengt, unter Rühren mit 200 ml   Äther    versetzt und über Nacht bei   - 100    stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und aufs neue mit 100 ml Äther während 5 Stunden verrührt, abfiltriert, zweimal mit Äther gewaschen und im Vakuum über Ätznatron getrocknet.



   F.   161-1680;    [a]   D 110    (c = 2 in Dimethyl formamid), Rf: 0,09.



  14. BOC-Cys(BzI)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH
5,3 g (13 mMol) BOC-Cys(Bzl)-OSU und 7,4 g (10 mMol) H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-OH, 1,93TFA werden in 75 ml Dimethylformamid gelöst. Aus einer Lösung von 150 mMol Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid wird unter Rühren 18,1 ml (27,2 mMol) zugetropft, bis das Reaktionsgemisch auf feuchtem Indikatorpapier ein pH von 6,4 zeigt. Die Lösung wird 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt, darauf am Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird zweimal mit 250 ml Essigester verrührt, anschliessend dreimal mit einer Mischung von 100 ml Essigester und 20 ml 5 % iger Zitronensäurelösung abfiltriert und im Vakuum bei 400 getrocknet.

 

   F.   184-185 ;    [a]   2D0 130    (c = 2 in Dimethyl formamid);   Rfo    =   0,45.   



  15. BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr
Cys(Bzl)-Val-Leu-OH
3,90 g (6 mMol) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH. 1,15TFA werden in 50 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst, mit 4,48 g (5,5 mMol) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn Leu-Ser-Thr-OH versetzt und bei Raumtemperatur bis zur Lösung gerührt. Sodann kühlt man die Lösung auf   0     ab, gibt 1,26 g (11 mMol) N-Hydroxysuccinimid  und 0,98 ml Triäthylamin in 45 ml Dimethylformamid zu, kühlt weiter auf   -    220 ab und gibt 1,13 g (5,5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dimethylformamid zu. Man rührt 1 Stunde bei   -220    und alsdann 3 Tage bei Zimmertemperatur, filtriert von ausgefallenem Dicyclohexylharnstoff ab und dämpft am Hochvakuum zur Trockne ein.

  Der Rückstand wird zweimal verrührt mit einer Mischung von 200 ml Essigester und 20 ml 5 % iger Zitronensäurelösung, anschliessend einmal mit einer Mischung von 200 ml Essigester und 20 ml 5 % iger Natriumbicarbonatlösung, das erhaltene Produkt abfiltriert und im Hochvakuum bei 400 getrocknet.



   F.   218-2210;    [a]   D20 28,50    (c = 2 in Dimethyl formamid);   Rfg    =   0,43.   



  16.   BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH   
2,5 g (1,9 mMol) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH werden bei   -400    in 250 ml trockenem flüssigem Ammoniak suspendiert. Unter Rühren wird, beim Siedepunkt des Ammoniaks, Natrium in solcher Weise zugegeben, dass die Farbe des Reaktionsgemisches nur hellblau wird. Nach 50 Minuten hat sich das Nonapeptidderivat ganz gelöst. Man rührt noch 10 Minuten unter Beibehalten der Blaufärbung, gibt alsdann 1 g Ammoniumchlorid zu und dampft im Hochvakuum (etwa 1 mm) zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit 30 ml 0,1n Salzsäure verrührt, die Fällung abfiltriert, sechsmal mit Wasser gewaschen und getrocknet, Ausbeute 1,38 g. Das wässrige Filtrat wird dreimal mit Essigester extrahiert.

  Der Essigester-Auszug wird zweimal mit   10 % iger    und einmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft.



  Das Produkt ist im Dünnschichtchromatogramm einheitlich.



     Rf = 0,86;      Rfs;    = 0,76; Rf7 = 0,81.
EMI36.1     


<tb>



  17. <SEP>    B <SEP> 0 <SEP> C-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cvs-Val-Leu-OH    <SEP> 
<tb> 
234 mg (0,225 mMol)   BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-      Thr-Cys-Vai-Leu-OH    werden in 100 ml entgastem Dimethylformamid gelöst und mit 1 ml einer Triäthylaminlösung in Dimethylformamid versetzt (0,95 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid, also 0,675 mMol). Diese Lösung wird gleichzeitig mit einer Lösung von 69,8 mg (0,248 mMol) Dijodäthan in 100 ml entgastem Methanol bei Zimmertemperatur zu einer entgasten Mischung von 150 ml Dimethylformamid und 150 ml Methanol innerhalb 90 Minuten unter Rühren eingetropft. Man gibt 1 ml Cyclohexan zu und dampft am Hochvakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird zweimal verrührt mit einer Mischung von 10 ml   2Sigem    Natriumbicarbonat und 20 ml Chloroform.

  Das schwach gelb gefärbte Pulver wird im Hochvakuum getrocknet und erweist sich im Dünnschichtchromatogramm als einheitlich.



     Rfa    = 0,82;   Rfs    = 0,75; Rf7 = 0,78.
EMI36.2     


<tb>



  18. <SEP>    BOC-Cvs-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cvs-Val-Leu-    <SEP> 
<tb>  Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met-Gly Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2
EMI36.3     


<tb> 412 <SEP> mg <SEP>    BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-    <SEP> 
<tb>    eu-OH    360 mg des unter 59 erhaltenen Tritosylats   ler    Sequenz 10-32, 15 mg N-Methylmorpholin, 50 mg N-Hydroxysuccinimid und 15 ml Dimethylformamid werden unter Stickstoff 2 Stunden bei 450 gerührt.



  Dann kühlt man auf   0     ab, fügt 8 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 2 Stunden bei   0     unter Stickstoff, gibt dann weitere 50 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt unter Stickstoff 8 Stunden bei   450.    Dann giesst man in 100 ml peroxydfreien   Äther    ein, nutscht den Niederschlag ab, wäscht ihn mit Äther und trocknet ihn im Vakuum bei   350.    Das Rohprodukt wird durch Gegenstromverteilung wie unter 60 beschrieben, gereinigt.



   Beispiel 3
EMI36.4     


<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala  Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe   Ser-Gly-Met(O)-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2    (Thyrocalcitoninsulfoxyd)
25 mg Thyrocalcitonin werden in 5 ml 0,05n Essigsäure gelöst. Dazu gibt man 0,5 ml   ölige    wässrige Wasserstoffsuperoxydlösung und lässt 90 Minuten bei Zimmertemperatur stehen. Dann setzt man eine Spur Platinmohr zu und rührt, bis die Sauerstoffentwicklung aufhört. Man zentriugiert das Platin ab und lyophilisiert die überstehende Lösung. Das so erhaltene Thyrocalcitonin-Sulfoxyd weist bei der Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxyd   Rf5      =    0,51 und   Rfrol=    0,48 auf.

  Bei der Elektrophorese auf Celluloseacetat   (pH =    1,9; 90 Minuten; 9   Volt/cm)    wandert es 1,5 cm gegen die Kathode, auf Avicel-cellulose 2,9 cm.



   Beispiel 4
EMI36.5     


<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala    Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg,-Phe- Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-OH   
EMI36.6     


<tb>  <SEP> 25 <SEP> mg <SEP> BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)
<tb> Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try
<tb>  Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu) Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu) Pro-OtBu werden in 2 ml 95   S    iger Trifluoressigsäure 1 Stunde bei Zimmertemperatur belassen. Anschliessend giesst man den Ansatz in 20 ml tiefgekühlten, peroxydfreien   Äther,    filtriert und wäscht mit etwas Äther und lässt die Lösung des Filtrationsrückstandes in wenig Wasser über eine kleine Säule Amberlite CG-45 in Acetatform laufen.

  Das Eluat wird mittels einer UV-Zelle verfolgt und die Fraktionen mit der Substanz werden lyophilisiert. Dünnschichtchromatogramm an Aluminiumoxyd:
Rf45 = 0,36;   Rf52    = 0,39; Rf79 = 0,42.

 

   Elektrophorese: Auf Selektaplatten   (pH =    1,9   15    Stunden 280 V) Wanderungsstrecke gegen die Kathode 6,3 cm.



   Auf Cellogel   (pH =    1,9, 1,5 Stunden 280 V) Wanderungsstrecke gegen die Kathode: 4,3 cm.



   Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 1. Z-Thr(tBu)-Pro-OtBu
6,3 g Z-Thr(tBu)-OH und 2,34 ml N-Methylmorpholin werden in 100 ml Tetrahydrofuran gelöst und bei 170 mit 3,0 ml Chlorameisensäure-isobutylester versetzt und nach 20 Minuten Rühren bei derselben Temperatur mit 6,7 g H-Pro-OtBu in 100 ml Tetrahydrofuran umgesetzt. Nach Stehenlassen bei Zimmertemperatur über Nacht wird filtriert und das am Va  kuum zur Trockne verdampfte Filtrat in Essigester mehrmals mit verdünnter wässriger Zitronensäurelösung, verdünnter wässriger Sodalösung und gesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt.

  Die erhaltene ölige Verbindung gibt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel:    Rf43c    = 0,89; Rf45 = 0,75, Rf52 = 0,64;   [&alpha;]D20    =  -44          10(c=      1,0 in Äthanol).   



  2. H-Thr(tBu)-Pro-OtBu,HCl
2,7 g Z-Thr(tBu)-Pro-OtBu werden in 200 ml Methanol unter Zusatz von 2,9 ml wässriger 2n Salzsäure und 500 mg Palladium-auf-Kohle Katalysator (10 % ig) mit Wasserstoff in der Schüttelente bei Atmosphärendruck und Raumtemperatur decarbobenzoxyliert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme, Filtration und Eindampfen zur Trockne wird das Produkt aus Hexan kristallisiert. F. 142-145  (Zersetzung).



   Dünnschichtchromatogramm an Silicagel:    Rf43o    = 0,45; Rf45 = 0,70; Rf52 = 0,55; [a]   =   
660   +    0,50   [2,2 %    in Äthanol].



  3. Z-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu
7,79 g H-Thr(tBu)-Pro-OtBu,HCl und 9,79 g Z Glu(OtBu)-ONP werden zusammen in 15 ml Dimethylformamid gelöst, mit 3,2 ml Triäthylamin versetzt und über Nacht bei 27-30  gerührt. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Essigester und Chloroform aufgenommen und mit Zitronensäure, Sodalösung und Kochsalzlösung wie bei 1 ausgeschüttelt und das erhaltene Rohprodukt an Silicagel chromatographiert. Die Substanz lässt sich mit   Hexan/Äther      1 :1    und Äther eluieren und kristallisiert anschliessend aus   Sither/Hexan.    F.   135-1370.   



   Dünnschichtchromatogramm an Silicagel:    Rfcuci3-u0on      (95 : 5) =    0,53,   RfCHCl3 Aeeton    1:1 =
0,72, Rf45 = 0,82; [a]   2,0 =    -44    +    0,50 (c = 2 in Äthanol).



  4. H-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu
777 mg der unter 3 beschriebenen Verbindung werden in 250 ml Methanol mit 300 mg 10 % igem Palladiumkatalysator auf Kohle hydriert. Man erhält ein dickes Öl, das ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe eingesetzt wird.



   Dünnschichtehromatogramm an Silicagel:
RfCHCl3-MeOH   (9 :1)    = 0,48;   Rf43A    =   0,50.   



  5. Z-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu
667 mg Z-Gly-Phe-Gly-Pro-OH werden mit den unter 4 erhaltenen 608 mg H-Glu(OtBu)-Thr(tBu) Pro(OtBu) in 20 ml Acetonitril gelöst und unter Zusatz von 222 mg N-Hydroxysuccinimid mit 269 mg Dicyclohexylcarbodiimid 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man filtriert vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff ab, dampft im Vakuum ein, löst den Rückstand in viel Essigester und schüttelt die Lösung wie bei 1 beschrieben aus. Nach dem Trocknen und Eindampfen am Vakuum wird das Rohprodukt durch Säulenchromatographie an Silicagel gereinigt. Es lässt sich mit Essigester und Essigester/Äthanol   (4 : 1)      elu-    ieren. Anschliessend wird aus Äther umgefällt. F. 96 bis 990.



   Dünnschichtchromatogramm an Silicagel:    RfclicI3-MeO    (9: 1) = 0,40;   RfI02A    = 5,75; Rf52 =
0,80.



  6. H-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu
858 mg   Z-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-    Pro-OtBu werden in 150 ml Methanol in Gegenwart von 200 mg Palladiumkatalysator (10 % Pd auf Kohle) hydriert. Das Produkt, das man nach Verreiben mit Äther-Hexan (1:1) als amorphes Pulver erhält, zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgende Werte:
RfCHCl3-MeOH   (9 :1)    = 0,16; Rfl02E = 0,17; Rf52  = 0,41.



  7. DPC-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)
Pro-OtBu
410 mg DPC-Met-OH werden mit 750 mg H-Gly Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu in 15 ml Acetonitril unter Stickstoff und unter Zusatz von 152 mg N-Hydroxysuccinimid mit 271 mg Dicyclohexylcarbodiimid 19 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffes wird das Filtrat im Vakuum eingedampft, der Rückstand in viel Essigester aufgenommen und wie bei 1 ausgeschüttelt und eingedampft. Das Rohprodukt wird durch Säulenchromatographie an Silicagel gereinigt.



  Es lässt sich mit   Essigester/Äthanol    (4   1)    eluieren.



   Dünnschichtchromatogramm an Silicagel:    RfHcI3-MeOH      (9 :1)    = 0,42;   Rfx02E    = 0,39; Rf53  = 0,29.



  8. H-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)
Pro-OtBu
190 mg der unter 7 erhaltenen DPC-Verbindung werden in 3 ml Methylenchlorid unter Stickstoff gelöst und mit 2,9 ml des Gemisches Monochloressigsäure/Wasser   (3 : 1)    versetzt. Nach 12 Minuten Reaktion bei Zimmertemperatur giesst man den Ansatz in 20 ml eiskalte 2n Sodalösung in Wasser und extrahiert diese mit drei Portionen zu 30 ml n-Butanol/Essigester (1:1). Nach Neutralwaschen mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung wird getrocknet und eingedampft und der Rückstand mit   Äther    mehrmals extrahiert. Dieser Extraktionsrückstand, ein amorphes Pulver, hat folgende Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel:    Rf43c    = 0,31; Rf52 = 0,30; Rf100 = 0,27.
EMI37.1     


<tb>



  9. <SEP> BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys  Val-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-OtBu
EMI37.2     


<tb>  <SEP> 55 <SEP> mg <SEP>    BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-    <SEP> 
<tb> Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg  Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly OH-ditosylat wird mit 81 mg H-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu) Thr(tBu)-Pro-OtBu in 0,2 ml Dimethylformamid unter Einleiten von Stickstoff nach Zugabe von 9 mg N Hydroxysuccinimid bei 400 gerührt. Nachdem sich alles gelöst hat, gibt man 7,3 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Dimethylformamid zu und rührt 22 Stunden bei 400. Nach dem Erkalten fällt man das Produkt mit 8 ml peroxydfreiem Äther und zentrifugiert ab. 

  Das Rohprodukt wird im System   Methanol/Puffer/Chloro-    form/Tetrachlorkohlenstoff (10 : 3 : 6 : 5) über 100 Stufen multiplikativ verteilt   (K = 0,4).    (Puffer wie in Beispiel 1, unter 18). Die das Produkt enthaltenden Röhrchen werden zusammengegossen, eingedampft und  am Hochvakuum bei 400 das Ammoniumacetat abgeriemen.



     Rf0-.    = 0,24;   Rfioo    = 0,25; Rfllo = 0,65 auf Sili cagelplatten.



   Beispiel 5 a) 1,3 g BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)   Thr(tBu)-Cys(TRI)-VaI-Leu-OH    (vgl. Beispiel 1, unter
17), 2,2 g des in Beispiel 1 unter 59 beschriebenen Tritosylats der Sequenz 10-32, 0,1 ml N-Methylmorpholin und 200 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 20 ml frisch destilliertem Dimethylformamid 1 Stunde bei 450 gerührt. Dann werden 250 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Man rührt unter Stickstoff 3 Stunden bei 450, gibt dann weitere 100 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt wieder 5 Stunden bei   450.    Dann kühlt man auf   0     und gibt das Reaktionsgemisch zu 1 Liter peroxydfreiem Äther. Man belässt 5 Stunden bei 00, nutscht den feinen Niederschlag ab, wäscht ihn mit Äther, trocknet ihn und zerreibt ihn mit 100 ml Wasser. Man nutscht ab und trocknet im Exsikkator.

  Das dabei erhaltene Rohprodukt (etwa 3,5 g) wird zur Reinigung einer Gegenstromverteilung über 750 Stufen im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10 :   3 : 3:    7; K-0,5) unterworfen. Die Einheitlichkeit der erhaltenen Fraktionen wird mittels Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten (Systeme 108 und 53) geprüft und die einheitlichen Fraktionen werden vereinigt. Man trocknet zur Vertreibung des Ammoniumacetats 18 Stunden im Hochvakuum bei 400. Ausbeute: 1,1 g.



   b) Man löst 610 mg des unter a) erhaltenen geschützten Dotriacontapeptidamids in 15 ml eiskalter   95 % iger    Trifluoressigsäure, lässt die Lösung unter Stickstoff sich auf 250 erwärmen und lässt 2 Stunden stehen. Dann giesst man (zum Abfangen der Triphenylcarboniumionen) die intensiv gelbe Lösung in ein Gemisch von 300 g Eis und 300 ml   5 % iger    wässriger Pyridinlösung, extrahiert das ausgefallene Triphenylcarbinol mit peroxydfreiem   Ather,    gibt zur wässrigen Lösung 50 ml Eisessig und filtriert zur Entfernung von Trifluoracetat-Ionen über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II, schwach basisch, Acetatform. Dabei wird über die Oberfläche der Lösungen Stickstoff geleitet, alle verwendeten Lösungsmittel wurden vorher mit Stickstoff entgast.

  Das Eluat, das mit Natriumprussidlösung eine stark violette Färbung zeigt, wird lyophilisiert und der Rückstand zur Entfernung von Pyridinacetat am Hochvakuum bei 400 getrocknet. Das Rohprodukt wird direkt weiter verarbeitet.



   c) Man löst 250 mg H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly   Pro-Glu-Thr-Pro-NHW,    in 100 ml Wasser, stellt die erhaltene Lösung durch Zugabe von 2n wässrigem Ammoniak auf pH = 6,5 und leitet so lange Luft durch, bis mit Natriumnitroprussid-Reagens keine freien SH-Gruppen mehr nachzuweisen sind. Dann dampft man am Rotationsverdampfer unter Zusatz von n-Octanol im Vakuum bei 400 zur Trockne ein, löst den Rückstand in 0,1n wässriger Ameisensäure und chromatographiert ihn an einer Säule (2,4.85 cm) Bio-Gel P6. Man verfolgt die   Elu-    tion mittels eines UV-Spektrophotometers. Man lyophilisiert die erhaltenen Fraktionen und prüft ihre Reinheit mittels Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxydplatten (Systeme 52 und 104).

  Die Fraktionen, die Thyrocalcitonin (vermischt mit Sulfoxid) enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 210 mg.



  Das Produkt (Thyrocalcitonin) zeigt die folgenden Rf Werte:    Rf45    = 0,33; Rf52 = 0,59;   Ruft04    = 0,56.



   Das Sulfoxid von I weist folgende Rf-Werte auf:    Rf45    = 0,30;   Rfs2    = 0,54;   Ruf104    = 0,50.



   PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung neuer Peptide der For   mell   
EMI38.1     


<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala    Tyr-Try-Arg-A sn-LewAsn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-    Gly-Met[oder   Met(O)]-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-    Pro-OH oder entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest durch den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin- oder Norleucinrest ersetzt sind, oder ihrer C-terminalen Amide oder Säureadditionssalze dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren, wobei das Prolin auch als Amid vorliegen kann bzw.

   deren aktivierte Derivate unter intermediärem Schutz von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen und unter Bildung der Disulfid brücke zwischen   Cysl    und Cys7 durch Oxydation, kondensiert.



   UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschlie ssende Carboxylgruppen durch die tert.-Butylgruppe schützt.



   2. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Hydroxylgruppen durch die tert.-Butylgruppe schützt.



   3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminogruppe am   Cystein-    Rest durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe schützt.



   4. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man das C-terminale Amid der Verbindung der Formel I herstellt.



   5. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man aus
EMI38.2     


<tb>   H-Cys-Ser-Asn-Leu-S <SEP> er-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-    <SEP> 
<tb>    Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg- Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-ProNlI2,    worin die a-Aminogruppe durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die   r-Carboxylgruppe    durch die tert. Butylgruppe und gegebenenfalls die Hydroxylgruppen der Seitenketten durch tert.-Butylgruppen geschützt sind, die Schutzgruppen durch saure Hydrolyse abspaltet.

 

     
6. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder einem der    Unteransprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Produkt mit dem   Met2 -Rest    in das entsprechende Sulfoxid überführt.



   PATENTANSPRUCH II
Verwendung von nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch I erhaltenen Peptiden zur Herstellung von 

**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.

Claims (1)

  1. **WARNUNG** Anfang CLMS Feld konnte Ende DESC uberlappen **. am Hochvakuum bei 400 das Ammoniumacetat abgeriemen.
    Rf0-. = 0,24; Rfioo = 0,25; Rfllo = 0,65 auf Sili cagelplatten.
    Beispiel 5 a) 1,3 g BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu) Thr(tBu)-Cys(TRI)-VaI-Leu-OH (vgl. Beispiel 1, unter 17), 2,2 g des in Beispiel 1 unter 59 beschriebenen Tritosylats der Sequenz 10-32, 0,1 ml N-Methylmorpholin und 200 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 20 ml frisch destilliertem Dimethylformamid 1 Stunde bei 450 gerührt. Dann werden 250 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Man rührt unter Stickstoff 3 Stunden bei 450, gibt dann weitere 100 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt wieder 5 Stunden bei 450. Dann kühlt man auf 0 und gibt das Reaktionsgemisch zu 1 Liter peroxydfreiem Äther. Man belässt 5 Stunden bei 00, nutscht den feinen Niederschlag ab, wäscht ihn mit Äther, trocknet ihn und zerreibt ihn mit 100 ml Wasser. Man nutscht ab und trocknet im Exsikkator.
    Das dabei erhaltene Rohprodukt (etwa 3,5 g) wird zur Reinigung einer Gegenstromverteilung über 750 Stufen im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10 : 3 : 3: 7; K-0,5) unterworfen. Die Einheitlichkeit der erhaltenen Fraktionen wird mittels Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten (Systeme 108 und 53) geprüft und die einheitlichen Fraktionen werden vereinigt. Man trocknet zur Vertreibung des Ammoniumacetats 18 Stunden im Hochvakuum bei 400. Ausbeute: 1,1 g.
    b) Man löst 610 mg des unter a) erhaltenen geschützten Dotriacontapeptidamids in 15 ml eiskalter 95 % iger Trifluoressigsäure, lässt die Lösung unter Stickstoff sich auf 250 erwärmen und lässt 2 Stunden stehen. Dann giesst man (zum Abfangen der Triphenylcarboniumionen) die intensiv gelbe Lösung in ein Gemisch von 300 g Eis und 300 ml 5 % iger wässriger Pyridinlösung, extrahiert das ausgefallene Triphenylcarbinol mit peroxydfreiem Ather, gibt zur wässrigen Lösung 50 ml Eisessig und filtriert zur Entfernung von Trifluoracetat-Ionen über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II, schwach basisch, Acetatform. Dabei wird über die Oberfläche der Lösungen Stickstoff geleitet, alle verwendeten Lösungsmittel wurden vorher mit Stickstoff entgast.
    Das Eluat, das mit Natriumprussidlösung eine stark violette Färbung zeigt, wird lyophilisiert und der Rückstand zur Entfernung von Pyridinacetat am Hochvakuum bei 400 getrocknet. Das Rohprodukt wird direkt weiter verarbeitet.
    c) Man löst 250 mg H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly Pro-Glu-Thr-Pro-NHW, in 100 ml Wasser, stellt die erhaltene Lösung durch Zugabe von 2n wässrigem Ammoniak auf pH = 6,5 und leitet so lange Luft durch, bis mit Natriumnitroprussid-Reagens keine freien SH-Gruppen mehr nachzuweisen sind. Dann dampft man am Rotationsverdampfer unter Zusatz von n-Octanol im Vakuum bei 400 zur Trockne ein, löst den Rückstand in 0,1n wässriger Ameisensäure und chromatographiert ihn an einer Säule (2,4.85 cm) Bio-Gel P6. Man verfolgt die Elu- tion mittels eines UV-Spektrophotometers. Man lyophilisiert die erhaltenen Fraktionen und prüft ihre Reinheit mittels Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxydplatten (Systeme 52 und 104).
    Die Fraktionen, die Thyrocalcitonin (vermischt mit Sulfoxid) enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert. Ausbeute: 210 mg.
    Das Produkt (Thyrocalcitonin) zeigt die folgenden Rf Werte: Rf45 = 0,33; Rf52 = 0,59; Ruft04 = 0,56.
    Das Sulfoxid von I weist folgende Rf-Werte auf: Rf45 = 0,30; Rfs2 = 0,54; Ruf104 = 0,50.
    PATENTANSPRUCH 1 Verfahren zur Herstellung neuer Peptide der For mell EMI38.1 <tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala Tyr-Try-Arg-A sn-LewAsn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser- Gly-Met[oder Met(O)]-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr- Pro-OH oder entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest durch den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin- oder Norleucinrest ersetzt sind, oder ihrer C-terminalen Amide oder Säureadditionssalze dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Aminosäuren, wobei das Prolin auch als Amid vorliegen kann bzw.
    deren aktivierte Derivate unter intermediärem Schutz von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven funktionellen Gruppen und unter Bildung der Disulfid brücke zwischen Cysl und Cys7 durch Oxydation, kondensiert.
    UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschlie ssende Carboxylgruppen durch die tert.-Butylgruppe schützt.
    2. Verfahren nach Patentanspruch I und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von der Reaktion auszuschliessende Hydroxylgruppen durch die tert.-Butylgruppe schützt.
    3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminogruppe am Cystein- Rest durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe schützt.
    4. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man das C-terminale Amid der Verbindung der Formel I herstellt.
    5. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man aus EMI38.2 <tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-S <SEP> er-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala- <SEP> <tb> Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg- Phe-Ser-Gly-Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-ProNlI2, worin die a-Aminogruppe durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die r-Carboxylgruppe durch die tert. Butylgruppe und gegebenenfalls die Hydroxylgruppen der Seitenketten durch tert.-Butylgruppen geschützt sind, die Schutzgruppen durch saure Hydrolyse abspaltet.
    6. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder einem der Unteransprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Produkt mit dem Met2 -Rest in das entsprechende Sulfoxid überführt.
    PATENTANSPRUCH II Verwendung von nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch I erhaltenen Peptiden zur Herstellung von
    schwerlöslichen Zinkkomplexen dieser Peptide, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen Peptide in wässriger Lösung mit einem wasserlöslichen Zinksalz und einem Alkalimetallphosphat, -phyrophosphat und/ oder -hydroxyd umsetzt.
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