Verfahren zur Herstellung eines Allergen-Extraktes und dessen Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung verbesserter therapeutischer und diagnostischer Allergen-Extrakte. Bei diesem Verfahren zur Herstellung der therapeutischen und diagnostischen Antigen- oder Allergen-Extrakte werden Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie physiologisch aktive Prinzipien enthalten, die Allergene Reaktionen hervorrufen, extrahiert und behandelt, indem man ein aus wässriger Phase und aus bestimmten organischen Lösungsmitteln bestehendes Extraktionssystem anwendet, wobei das organische Lösungsmittel mit dem Allergen eine chemische Wechselwirkung eingeht und die Extraktionsflüssigkeit, die die aktiven Prinzipien enthält, von dem in dieser Flüssigkeit unlöslichen Material trennt und dann die Extraktionsflüssigkeit verdampft und entfernt,
wobei hiedurch das aktive Prinzip in Form eines trockenen Pulvers isoliert wird. Das trokkene Pulver kann dann weiter aufgearbeitet werden, wobei man einen allergenen Extrakt in einer bestimmten Form erhält. Die Form, in der der allergene Extrakt dann hergestellt wird, kann eine der vielen sein, die in der therapeutischen und diagnostischen Immunologie bekannt sind.
Es ist schon lange bekannt, dass verschiedene Individuen charakteristische allergene Reaktionen entwikkeln, wenn sie mit bestimmten natürlich vorkommenden oder synthetischen organischen Teilchen oder Materialien zusammenkommen. Insbesondere treten diese allergenen Reaktionen dann auf, wenn diese Teilchen eingeatmet werden. Beispiele für allergene Reaktionen sind: Niesen, Aktivierung der Schleimdrüsen, lokale Oedeme, Hautausschläge und Blutgefässerweiterungen.
Diese Reaktionen werden normalerweise Heuschnupfen genannt, und selbst dann wenn die Reaktionen des Körpers im allgemeinen nicht zu ernsthaften Schäden führen, können dennoch Komplikationen auftreten, und zwar sowohl physiologischer Art als auch psychologischer Art. Bei einem kleinen Kind führt die ständige Anwesenheit allergener Bedingungen oft zu einer dauernden Deformierung des Körpers, und insbesondere die Gesichtszüge können verändert werden. Es sei auch auf die psychologischen Einflüsse eines ständig vorhandenen Unbehagens hingewiesen. Asthmatische Zustände sind auch mit allergenen Reaktionen eng verbunden, und sie können auch zu wesentlich schwerwiegenderen Komplikationen führen. Die medizinische Wissenschaft anerkennt nun die Heuschnupfenkrankheit als ein ernstes Leiden, das mit Sorgfalt und gründlich behandelt werden muss.
In dieser Beziehung wurde schon vor einiger Zeit bekannt, dass Extrakte der oben angegebenen allergenisch aktiven oder antigenisch aktiven Substanzen bei einer subkutanen Injektion diese allergenen Reaktionen lindern können. Der genaue physiologische Mechanismus dieser Behandlung, die in der Fachwelt als Hyposensitivierung bezeichnet wird, wurde bisher noch nicht vollständig und befriedigend erklärt. Verschiedene Theorien wurden jedoch aufgestellt, die Erklärungsversuche sind.
Eine derartige Theorie nimmt an, dass die Bildung von sogenannten blockierenden oder neutralisierenden Antikörpern durch die Injektion der Extrakte hervorgerufen wird, während eine andere Theorie behauptet, dass eine derartige Behandlung die Bildung einer Vereinigung zwischen dem Antigen oder dem Allergen und dem Antikörper in dem freizirkulierenden Blut eher begünstigt, als dies in dem unter Schockeinwirkung stehenden Gewebe möglich ist.
Bei der Herstellung von derartigen Allergen-Extrakten war es bisher üblich, die angreifende organische Substanz, die die allergene Reaktion hervorruft, einfach mit einer physiologisch annehmbaren wässrigen Extraktionsflüssigkeit zu extrahieren, beispielsweise einer Salzlösung oder leicht alkalischen Salzlösung. Nach der Abtrennung der Extraktionsflüssigkeit von dem Rückstand wurde diese Lösung, die das aktive Prinzip enthielt, sterilisiert und einfach als solche verwendet, nachdem man natürlich eine geeignete Serienverdünnung dieser Lösung durchgeführt hatte. Bei derartigen Extraktionsverfahren wird die physiologisch annehmbare Extraktionsflüssigkeit ausgewählt, und man nimmt an, dass sie die strukturelle Unangreifbarkeit des Antigenmoleküls schützt.
In neuerer Zeit wurde jedoch ein Verfahren entwickelt, das zu vollständigeren wirksameren Allergen Extrakten führt. Dieses Verfahren ist in den USA-Patentschriften Nrn. 3 148 121 sowie 3 148 122 beschrieben. Das dort beschriebene Verfahren umfasst in kurzen Zügen die Behandlung der gesamten nicht entfetteten allergenen Substanz mit einer wässrigen Extraktionsflüssigkeit, die ein heterocyclisches tertiäres Amin enthält, worauf dann die flüssige Phase, die das aktive Prinzip enthält, von dem Rückstand entfernt wird und der Rückstand verworfen wird. Dann wird zur Entfernung des heterocyclischen tertiären Amins von dem aktiven Prinzip Wasser und eine Alaunlösung zu dem Extrakt zugegeben, damit das aktive Prinzip daraus ausgefällt wird.
Das gefällte Material wird dann mehrere Male mit Wasser gewaschen, um das gesamte heterocyclische tertiäre Amin und den Überschuss an Alaun zu entfernen, und dann wird das ausgefällte Material schliesslich in einem physiologischen annehmbaren Trägermaterial erneut suspendiert, beispielsweise in einer Phosphatpufferlösung.
Anfänglich wurde angenommen, dass die Zugabe des heterocyclischen tertiären Amins bei dem Verfahren nur zu einem vollständigeren Allergen-Extrakt führte, da die aminlöslichen Bestandteile in dem Extrakt zusätzlich zu den wasserlöslischen eiweiss artigen oder kohlehydratartigen Fraktionen enthalten waren. Jetzt nimmt man aber an, dass die reaktive chemische Struktur des heterocyclischen tertiären Amins eine strukturelle Modifizierung des Antigenmoleküls hervorrufen kann, die zu einem allergenen Behandlungsextrakt führt, der wirksamer ist und ziemlich frei von konstitutionellen Nebenreaktionen.
Obwohl diese Extraktion unter Anwesenheit eines heterocyclischen Amins und die Fällung mit Alaun zu Allergen-Extrakten führt, die in der Folge auf Grund der Tatsache, dass Pyridin das bevorzugte heterocyclische Amin ist, das bei dem Verfahren angewandt wird, PEAP-Extrakte genannt werden, und obwohl dieses Verfahren wirksam ist und gewisse Vorteile aufweist, hat es sich dennoch während der letzten Jahre herausgestellt, dass bestimmte Einschränkungen bestehen. In diesem Zusammenhang wurde gefunden, dass diese Art des Extraktes nicht zu Hauttestzwecken verwendet werden kann. Dies ist für den Arzt, der klinisch Allergien behandelt, im allgemeinen nicht wünschenswert, da diese Ärzte es vorziehen, den gleichen Extrakt sowohl für die Diagnose als auch für die Behandlung verwenden zu können.
Wenn nämlich bei einem Behandlungsverfahren der gleiche Extrakt sowohl für die Hauttestung als auch für die Behandlung verwendet wird, dann geht man sicher, dass bei der Behandlung genau dasjenige Antigen angewandt wird, von dem sich herausgestellt hat, dass es zu der allergenen Hautreaktion führt. Die oben beschriebene Einschränkung der PEAP Extrakte dürfte auf die Unlöslichkeit des Niederschlages und/oder die Bildung eines Komplexes zwischen dem mit dem heterocyclischen tertiären Amin extrahierten Antigen und dem Alaun, der zur Fällung des Antigens aus der Extraktionsflüssigkeit verwendet wird, zurückzuführen sein.
Ausserdem sind die Arbeitsverfahren, die bei der Herstellung von PEAP-Antigenen unter Anwendung der bisher bekannten Verfahren erforderlich sind, ziemlich langdauernd, und die Ausbeuten lassen zu wünschen übrig. Die Ausbeuten liegen im allgemeinen bei etwa 50 S der Protein-Stickstoffeinheiten (PNU), die ursprünglich extrahiert wurden.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, einen vielseitiger anwendbaren und wirksameren Allergen-Extrakt herzustellen als die Produkte, die bisher mit Hilfe der bekannten wässrigen Extraktionsverfahren und PEAP-Extraktionsverfahren erhältlich waren.
Ferner war man bestrebt, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung allergener Testextrakte und langwirksamer Behandlungsextrakte zu entwickeln, bei dem ein übliches Allergen-Extraktionsverfahren anwendbar ist.
Ferner sollte ein wässrig-organisches Lösungsmittel-Ex- traktionsverfahren angewandt werden, durch das im wesentlichen alle antigenen Materialien bei der Aufarbeitung desselben gewonnen werden können.
Es wurde gefunden, dass diese Vorteile dadurch erreicht werden können, dass man (1) die allergen aktive Substanz mit einer Extraktionsflüssigkeit extrahiert, die eine Mischung aus einer wässrigen Phase und einem organischen Lösungsmittel ist, wobei die aktiven Prinzipien in der Extraktionsflüssigkeit gelöst und mit ihr behandelt werden, wobei ein Rückstand aus inaktiven unlöslichen Materialien verbleibt, dann (2) die flüssige Phase abtrennt, die die Extraktionsflüssigkeit und die aktiven Prinzipien aus dem unlöslichen Rückstand enthält und (3) die aktiven Prinzipien aus der Extraktionsflüssigkeit durch Abdampfverfahren abtrennt, wobei ein beständiger, im wesentlichen trockener allergen aktiver, pulverförmiger Extrakt zurückbleibt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Extraktes einer Substanz, die allergisches Reagieren hervorrufen kann, wobei der Extrakt das physiologisch aktive Prinzip des Allergens enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Allergen enthaltende Material mit einer Extraktionsflüssigkeit vermischt, die Wasser und ein basischen Stickstoff enthaltendes organisches Lösungsmittel, das mit dem Allergien eine chemische Wechselwirkung eingeht, enthält, dass die Extraktionsflüssigkeit von dem darin unlöslichen Material entfernt wird, man das unlösliche Material verwirft und die extrahierte Flüssigkeit eindampft, damit man das aktive Prinzip dieser Substanz in Form eines stabilen allergen-aktiven Pulvers erhält.
Vorzugsweise ist das beim erfindungsgemässen Verfahren angewandte, basischen Stickstoff enthaltende organische Lösungsmittel ein heterocyclisches tertiäres Amin, insbesondere eines mit einem Siedepunkt von unter 1200 C, beispielsweise Pyridin, Chinolin, Lutidin, Collidin oder Picolin. Die Extraktionsflüssigkeit kann einen pH-Wert von 7,5 bis 12 aufweisen, und das Abdampfen derselben kann dadurch erreicht werden, dass man sie auf eine Temperatur von etwa 50 bis 850 C erhitzt. Das Abdampfen der Extraktionsflüssigkeit kann unter vermindertem Druck oder durch Sprühtrocknen erreicht werden.
Die Art der chemischen Wechselwirkung, die zwischen dem Allergen und dem basischen Stickstoff enthaltenden organischen Lösungsmittel stattfindet, ist noch nicht ganz geklärt. In einigen Fällen jedenfalls dürfte zwischen dem Antigen und dem organischen Lösungsmittel eine Komplexreaktion ablaufen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Extraktes, der die Form eines stabilen allergen aktiven Pulvers aufweist, zur Herstellung eines Testextraktes. Bei dieser Verwendung wird das Pulver in einer physiologisch annehmbaren Flüssigkeit in der erforderlichen Konzentration gelöst oder suspendiert.
Bei dieser speziellen Verwendung des allergen aktiven Pulvers wird als physiologisch annehmbare Flüssigkeit vorzugsweise ein wässriges Lösungsmittelsystem verwendet. Die dabei erhaltene Flüssigkeit kann sterilisiert werden, beispielsweise indem man sie durch ein Bakterienfilter filtriert. Man kann dem so erhaltenen Testextrakt auch eine Aluminiumverbindung zugeben, vorzugsweise Kaliumaluminiumsulfat, wodurch die aktiven Prinzipien des Extraktes in eine unlösliche Form übergeführt werden. Die so unlöslich gemachten aktiven Prinzipien können dann isoliert und in einer physiologisch annehmbaren wässrigen Flüssigkeit erneut suspendiert werden.
Zum Vergleich des erfindungsgemässen Verfahrens mit dem bisher bekannten Verfahren sei nochmals darauf hingewiesen, dass bei dem bisher bekannten PEAP Verfahren ein Alaunfällungsschritt als wesentlicher Schritt bei dem Herstellungsverfahren für den Allergen Extrakt angewandt wurde, denn nur unter Anwendung dieses Fällungsschrittes in dem bisher bekannten Verfahren konnten die aktiven Prinzipien von dem physiologisch unerwünschten tertiären Amin der Extraktionsflüssigkeit getrennt werden.
Es wurde nun unerwarteterweise gefunden, dass dieser Schritt, d. h. die Fällung des Antigens aus der wässrigen Lösung, die das heterocyclische tertiäre Amin enthält, unter Verwendung von Alaun vollständig umgangen werden kann, obwohl gerade dieser Fällungsschritt bisher für das PEAP-Verfahren als wesentlich angesehen wurde. Diese Umgehung des Fällungsschrittes wird erreicht, indem man die aktiven Prinzipien aus der Extraktionsflüssigkeit durch ein Abdampfverfahren abtrennt, ehe die aktiven Prinzipien bis zur endgültigen Dosierungsform verdünnt werden. Der Abdampfschritt wird in der Folge näher beschrieben.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist auf alle allergen aktiven Substanzen anwendbar, sowohl auf solche natürlichen Ursprungs als auch auf synthetisch hergestellte. Zu derartigen Substanzen gehören verschiedene Staubarten, wie z. B. üblicher Staub, der sich in Wohnungen findet und mit Hilfe von Staubsaugern eingesammelt wird, sowie Staubarten, die in Herstellungsbetrieben auftreten, wie z. B. Sägemehl. Ferner gehören zu den allergen aktiven Substanzen Epithelzellen wie z. B.
Materialien, die von Katzen, Hunden, Pferden oder Kaninchen abgestossen werden, Federn, wie z. B. Gänse federn und Hühnerfedern, Samen, wie z. B. Baumwollsamen und Kapok, Insekten sowie von Insekten stammende Produkte, wie z. B. Bienen, Hornissen, Moskitos und deren Sekrete, Pollen von Bäumen, Gräsern und Unkräutern, wie z. B. Ambrosiaceae, Obstgartengras, Ahornbäumen, P appelbäumen, ferner Schimmelarten, wie z. B. Aspergillus niger und Alternaria, komplexe synthetische Chemikalien, wie z. B. Antibiotika und ähnliche Materialien.
Bezugnehmend auf die Extraktionsflüssigkeit, die am Anfang verwendet wird, um die aktiven Prinzipien oder die allergenaktiven Substanzen zu lösen, zu behandeln und von den inaktiven Rückständen zu entfernen, die dann verworfen werden, wurde nun gefunden, dass die beim erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt verwendete Flüssigkeit eine Mischung einer wässrigen Phase und einer organischen Lösungsmittelphase enthält. Dieser zuletzt genannte Bestandteil der Extraktionsflüssigkeit kann ein basisches stickstoffenthaltendes Lösungsmittel enthalten, das einen Siedepunkt aufweist, der ausreichend tief ist, so dass eine Verdampfung dieses Lösungsmittels möglich ist, ohne dass die strukturelle Integrität des behandelten Allergens zerstört wird.
Diese Siedepunktsbegrenzung wird in der Folge noch näher erläutert, wenn der Abdampfungsschritt genauer beschrieben wird. Allgemein gesprochen sei jedoch darauf hingewiesen, dass das organische Lösungsmittel einen Siedepunkt von weniger als etwa 1200 C aufweist sen soll, ausgenommen dann, wenn ein Abdampfverfahren, wie z. B. eine Sprühtrocknung, angewandt wird, bei dem das Allergen nur momentan höheren Temperaturen unterworfen wird. Vorzugsweise enthält der organische Lösungsmittelanteil der Extraktionsflüssigkeit ein Amin und insbesondere ein heterocyclisches tertiäres Amin, wie z. B. Pyridin, Pyridinderivate, beispielsweise Lutidin, Chinolin, Collidin, Picolin und ähnliche Materialien. Zusätzlich zu der Eigenschaft, dass das organische Lösungsmittel einen entsprechenden Siedepunkt haben soll, soll es auch noch vorzugsweise mit Wasser mischbar sein.
Obwohl der genaue chemische Einfluss des organischen Lösungsmittels auf das Antigenmolekül oder dessen Struktur nicht mit einem bestimmten Grad an Sicherheit bekannt ist, wird dennoch angenommen, dass die stark polare oder basische Natur der oben angegebenen Lösungsmittel dazu führt, dass diese mit dem Antigen reagieren, um eine Verbindung mit demselben zu bilden, oder dass sie in irgendeiner Weise die komplexe Molekularstruktur des Proteins, Kohlehydrats, Lipoproteins oder Polypeptides, die die Basis für die allergene Natur der den Patienten störenden Substanz darstellen, ändern.
Die Extraktionsflüssigkeit, d. h. die wässrige Phase, kann lediglich destilliertes Wasser sein, oder vorzugsweise eine Salzlösung oder eine alkalische wässrige Lösung. In dieser Beziehung können Natriumbicarbonat, Natriumchlorid, Natriumhydroxyd und Phosphatpuffer oder ähnliche Materialien verwendet werden. Wenn Substanzen, die eine alkalische Natur aufweisen, wie z. B. heterocyclische tertiäre Amine, in der Extraktionsflüssigkeit verwendet werden, dann kann dieser zweite wässrige Bestandteil auch aus einem Puffer bestehen, der den pH-Wert auf einen neutraleren Wert einstellt.
Der erhaltene pH-Wert der schliesslich verwendeten Extraktionsflüssigkeit wird eingestellt, indem man die das organische Amin enthaltende Lösungsmittelphase und die wässrige Phase vermischt. Dabei kann der pH-Wert im Bereich von 7,5 bis 12,0 liegen, und vorzugsweise wird er auf den engeren pH-Bereich von 9,0 bis 12 eingestellt. Da eine grosse Vielzahl an allergenen Substanzen mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens gewonnen werden kann, kann der pH-Wert der Extraktionsflüssigkeit und die Zusammensetzung derselben ziemlich variiert werden. Beispielsweise ist es bekannt, dass die Pollen von Ambrioceae (ragweed) einen Gehalt an einem hohen und toxischen Fett oder Lipoid aufweisen, das gegebenenfalls wesentlich an der allergenen Natur dieser Substanz beteiligt ist.
Wenn man die Pollen dieses Unkrautes extrahiert, kann es möglich sein, dass es wünschenswert ist, das Verhältnis der organischen Lösungsmittelphase zur wässrigen Phase zu erhöhen, um sicherzugehen, dass das gesamte Lipoidmaterial in Lösung geht. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass gleiche Anteile an organischer Lösungsmittelphase und wässriger Phase in der Extraktionsflüssigkeit zu einer weiten Anwendungsfähigkeit derselben führen.
Das Extraktionsverfahren wird im allgemeinen so durchgeführt, dass man die die Krankheit hervorrufende allergene Substanz mit der Extraktionsflüssigkeit vermischt, nachdem vorher verunreinigende Bestandteile physikalisch entfernt wurden. Dann lässt man die Mischung bei einer Temperatur von etwa 20 bis 250 C bis zu 11 Tage lang entweder unter Rührung oder ohne Rühren stehen. Der Rückstand wird dann von der flüssigen Phase getrennt, die zu diesem Zeitpunkt die behandelten und in Lösung gebrachten aktiven allergenen Prinzipien enthält, indem man den unlöslichen Rückstand sich absetzen lässt, die Mischung filtriert oder ein Filtrationsverfahren durchführt, beispielsweise eine Vakuumfiltration.
Der Rückstand wird dann verworfen, und die erhaltene flüssige Phase ist eine klare, oft leicht bernsteinfarben oder grüngefärbte Lösung des Reaktionsproduktes der das organische Lösungsmittel enthaltenden wässrigen Extraktionsflüssigkeit und des Antigens.
In der Arbeitsstufe, die nun in der Folge beschrieben wird, unterscheidet sich das erfindungsgemässe Verfahren besonders deutlich von dem bisher bekannten PEAP-Verfahren, bei dem Kaliumaluminiumsulfat, nämlich Alaun, dann der Lösung zugegeben wird, um eine Fällung zu erreichen, und damit eine Entfernung des Antigenprinzips oder aktiven allergenen Prinzips von der physiologisch nicht annehmbaren Extraktionsflüssigkeit zu bewirken.
Der Unterschied des erfindungsgemässen Verfahrens von dem bisher bekannten PEAP Verfahren besteht darin, dass die Abtrennung des aktiven Prinzips aus der Extraktionsflüssigkeit durch Eindampfverfahren erreicht wird, d. h. die flüssige Phase wird einem solchen physikalischen Zustand unterworfen, der bewirkt, dass die flüssige Phase in eine Gasphase umgewandelt wird, und dass die nichtflüchtigen aktiven Prinzipien abgetrennt werden, indem man die gasförmige Phase von den aktiven Prinzipien abdiffundieren lässt oder entfernt.
Dieser wichtige Abdampfungsschritt des erfindungsgemässen Verfahrens kann nach bekannten Methoden durchgeführt werden, die dazu dienen, um ein Lösungsmittelsystem von einer in diesem gelösten Substanz zu befreien. Beispiele für derartige Methoden sind unter anderem die Gefriertrocknung, die Sprühtrocknung, die Vakuumtrocknung, die Anwendung eines rotierenden Vakuumtrocknungsapparates und ähnliche Methoden.
Die Temperaturen, die bei diesem Trockenschritt angewandt werden, können von dem Minimum, das benötigt wird, um die Extraktionsflüssigkeit bei dem angewandten Druck zu entfernen, bis zu einer Temperatur von etwa 950 C liegen. Die zuletzt genannte Temperatur ist diejenige, die bei Sprühtrocknungsverfahren angewandt wird, wo ein thermisch labiles Antigen nur momentan einer derartig hohen Temperatur unterworfen wird. Der Druck, der in dem Abdampfungssystem angewandt wird, hängt in gleicher Weise von dem speziellen Verfahren, das angewandt wird, ab, und er kann im Bereich von Atmosphärendruck oder etwas darüber liegendem Druck bis hinunter zu 30 mm Quecksilbersäule variieren, wobei der zuletzt genannte Druck derjenige ist, der bei Gefriertrocknungsverfahren angewandt wird.
Es wurde auch gefunden, dass zur Entfernung der letzten Spuren der wässrig-organischen, zur Extraktion verwendeten Flüssigkeit es vorteilhaft ist, das im wesentlichen trockene teilchenförmige Antigen, das man nach dem Abdampfverfahren erhalten hat, in einem Vakuumexsikkator etwa 24 Stunden lang stehen zu lassen. Dieser Arbeitsschritt kann bei Zimmertemperatur oder bei einer Temperatur von bis zu 450 C durchgeführt werden. Das Ergebnis des obigen Arbeitsverfahrens ist ein trockenes, teilchenförmiges, allergen-aktives oder antigen-aktives Material, das mit einer sehr reaktiven Extraktionsflüssigkeit behandelt worden war, und im wesentlichen alle aktiven Prinzipien der ursprünglichen angreifenden Substanz enthält, und ausserdem ist dieser Antigenextrakt bezüglich des schliesslich beabsichtigten Verwendungszweckes sehr variabel, wie später noch näher beschrieben werden wird.
Man sieht auch, dass bei diesem Verfahren praktisch kein allergenaktives Material verloren gegangen ist, während bei dem bekannten Verfahren, bei dem eine Alaunfällung aus dem wässrig-organischen Lösungsmittelextrakt durchgeführt wird, ein wesentlicher Anteil des ursprünglich extrahierten Proteinstickstoffes verloren geht. So ist es gelungen, die Ausbeute und die Vollständigkeit der Extraktion durch das erfindungsgemässe Verfahren wesentlich zu erhöhen.
Es sei ferner darauf hingewiesen, dass das erfindungsgemässe Verfahren in keiner Weise auf komplizierte natürlich vorkommende Antigenmischungen eingeschränkt ist, sondern dass es auch bei einem Extrakt angewandt werden kann, der einem Arbeitsverfahren unterworfen worden war, durch das die verschiedenen Antigenfraktionen getrennt werden, bevor die Behandlung und/oder der Abdampfschritt durchgeführt wird.
In dieser Stufe kann der trockene teilchenförmige oder pulverförmige Extrakt weiter verarbeitet werden, um einen allergenen Extrakt in einer der verschiedenen Formen, in denen die allergenen Extrakte eingesetzt werden, zu erhalten. So kann das Pulver einfach mit einem physiologisch annehmbaren wässrigen Lösungsmittelsystem behandelt werden und sowohl als diagnostischer Hauttestungsextrakt als auch als Extrakt zur hyposensitivierenden Behandlung verwendet werden.
Derartige physiologisch annehmbare Flüssigkeiten sind beispielsweise gepufferte Kochsalz-Lösung oder Evan Lösung, Coca-Lösung, die Natriumbicarbonat, Natriumchlorid und Phenol enthalten, oder eine Glycero Kochsalz-Lösung oder Stier-Lösung, Rohrzucker-Lösung oder Ungar-Lösung, phosphatgepufferte Lösungen und ähnliche Materialien. Diese Lösungen weisen im allgemeinen einen pH-Wert von um 7 auf und können einen pH-Wert von bis zu 7,5 besitzen.
Ein zweites Verfahren zur weiteren Aufarbeitung des trockenen pulverförmigen Extraktes kann so durchgeführt werden, dass man denselben mit einer wässrigen Lösung behandelt und dann eine Aluminiumverbindung zusetzt, beispielsweise Kaliumalaun oder Aluminiumhydroxyd, um das Antigen in eine unlösliche Form überzuführen und eine therapeutische Dosierungsform zu gewinnen, bei der die Freisetzung der aktiven Komponente langsam erfolgt. In dieser Beziehung wurde unerwarteterweise gefunden, dass der unlöslich gemachte Niederschlag, oder das Absorptionsprodukt, bei dem der wässrige Extrakt, der aus den nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten gewonnenen Extrakt bereitet wurde, wesentlich besser ist als die bisher mit Alaun gefällten Antigene, die aus entfetteten, rein wässrigen extrahierten Lösungen ausgefällt worden waren.
Während die bisher bekannten Präparate ein gelatineartiges Aussehen haben und pharmazeutisch nicht an nehmbar sind, sind die unter Verwendung der erfindungsgemäss hergestellten Extrakte erzeugten Präparate homogene Suspensionen eines teilchenförmigen Materials und haben ein pharmazeutisch angenehmes Aussehen.
Es sei darauf hingewiesen, dass es auch nicht zu erwarten ist, dass die Ausbeute des Niederschlages aus dem wiedervereinigten Extrakt bei der Verwendung einer Aluminiumverbindung, um das Antigen unlöslich zu machen, wesentlich höher ist als diejenige, die bei dem bisher bekannten PEAP-Verfahren erhalten wurde.
Beispielsweise können Ausbeuten von etwa 40 bis 50 % erreicht werden, wenn man das bisher bekannte PEAP Verfahren anwendet, während beim erfindungsgemässen Verfahren Ausbeuten von etwa 80 bis 90 % erhalten werden. Diese Ausbeute ist auf den Proteinstickstoffgehalt berechnet und die Extraktionsflüssigkeit, im Vergleich zu dem Proteinstickstoffgehalt, in dem unlöslich gemachten Niederschlag oder dem Absorptionsprodukt.
Bei diesem unlöslich machenden Arbeitsverfahren kann eine stöchiometrische Menge an Aluminiumverbindung zugegeben werden, und die Suspension kann auf ihre geeignete Stärke einfach durch zusätzliche wässrige Flüssigkeit verdünnt werden. Es ist auch möglich, einen Überschuss an Aluminiumverbindung zuzusetzen und das gefällte oder absorbierte Produkt von dem darüberstehenden Material zu entfernen, zu waschen und erneut in einer physiologisch annehmbaren wässrigen Flüssigkeit zu suspendieren.
Um sicherzugehen, dass der allergene Extrakt steril ist, ist es üblich, eine Lösung, die einen thermisch empfindlichen Antigenextrakt enthält, durch ein Bakterienfilter zu filtrieren, wobei derartige Bakterienfilter üblicherweise Seitzfilter, Mikroporfilter, Millipore -Filter oder Membranfilter genannt werden. Derartige Arbeitsverfahren sind bekannt und in vielen Literaturstellen beschrieben. Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann eine derartige Sterilisierung in jeder beliebigen flüssigen Phase erreicht werden, solange das Antigen sich in Lösung befindet. Beispielsweise kann entweder der anfängliche wässrig-organische Lösungsmittelextrakt oder der wässrige wieder hergestellte Extrakt durch Filtrieren sterilisiert werden.
Natürlich sieht man, dass durch das Sprühtrocknungsverfahren eine Sterilisierung des erhaltenen Produktes erreicht werden kann, so dass dann ein derartiger Filtrierungsschritt nicht mehr notwendig ist.
Bezugnehmend auf die Art der Verwendung des nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Präparates sei darauf hingewiesen, dass derartige Arbeitsverfahren ebenso für den Fachmann bekannt sind und im wesentlichen in zwei Kategorien zerfallen. Diese sind: (1) Testextrakte oder diagnostische Extrakte und (2) B ehandlungsextrakte oder therapeutische Extrakte.
Die Testextrakte oder diagnostischen Extrakte weisen in erster Linie eine wässrige Natur auf und werden so verwendet, dass man einen Tropfen des speziellen Extraktes auf die Haut des zu testenden Menschen oder Tieres aufbringt und die Oberfläche der Haut unter dem Extrakt aufschürft. Nach einem ziemlich kurzen Zeitraum entsteht ein Hautausschlag oder eine Hautreaktion, und diese zeigt deutlich an, dass die getestete Person auf das spezielle Antigen, das in dem Test verwendet wird, allergisch ist. Andere Testverfahren sind die intrakutane Injektion des Extraktes und die nachfolgende Beobachtung eines Knötchens. Testungen der Bindehaut, Riechtests und Einatmungstests können auch verwendet werden, indem man das trockene Pulver einsetzt, das von der anfänglichen Extraktion stammt, und manchmal wird behauptet, dass derartige Tests charakteristischer und genauer sind als die Hauttestung.
Die zweite Kategorie dieser Extrakte, nämlich die B ehandlungsextrakte oder therapeutischen Extrakte, können wässrige Extrakte, aluminiumgefällte Extrakte, Depotextrakte und ähnliche Extrakte sein. Die Anwendung derartiger Behandlungesextrakte besteht darin, dass man subkutan eine ausserordentlich verdünnte Lösung des Antigens injiziert und dann täglich oder wöchentlich Injektionen mit allmählich ansteigenden Konzentrationen durchführt. Auf Grund der sehr weiten Bereiche der Empfindlichkeit der verschiedenen Personen und der verschiedenen Freisetzungseigenschaften der verschiedenen therapeutischen Formen des Antigens wird vom Arzt ein bestimmtes Behandlungsschema je nach der zu behandelnden Person ausgewählt.
Bezüglich der Dosierung und der Wirksamkeit des Extraktes können die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Materialien konzentriert oder verdünnt werden, bis man eine bestimmte Grundstärke des anfänglichen Extraktes erhält und die gewünschte Endstärke des endgültigen Extraktes. Das üblichste, jedoch nicht vollständig zufriedenstellende Verfahren zur Standartisierung der Extrakte besteht darin, dass man die Lösung auf ihre Protein-Stickstoffeinheiten analysiert (PNU). Der Nachteil dieses Verfahrens ist offensichtlich derjenige, dass alle Antigenen-Fraktionen des Extraktes nicht notwendigerweise Eiweissnatur besitzen müssen, sondern auch Kohlehydrate, Lipoide oder andere, nicht Stickstoff enthaltende Moleküle sein können.
Bezüglich der Wirksamkeit des Extraktes besteht die übliche Ausführung darin, dass man die Behandlungsextrakte in Konzentrationen von 10 bis etwa 5000 PNU standartisiert, je nach dem Zusammenhang zwischen den antigenen Eigenschaften und dem Gehalt an Proteinstickstoff. Behandlungsextrakte werden im allgemeinen so eingestellt, dass sie 10 bis 20000 PNU aufweisen, wobei die Extrakte geringerer Konzentration in den Anfangsphasen der Hyposensitivierungstherapie eingesetzt werden und die stärkeren Extrakte zu Erreichung oder Aufrechterhaltungsdosierung in grösseren Zeitintervallen angewandt werden.
Die Erfindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Herstellung eines trockenen pulverförmigen Extraktes
Eine Extraktionsflüssigkeit, die eine Mischung von 25 ml Pyridin und 250 ml 0,1 normaler Natronlauge enthält, wurde hergestellt, und 50 g einer Mischung der Pollen von hohen und niedrigen Ambriosaceae (high ragweed, low ragweed) wurden zugegeben. Man liess die Mischung 5 Tage lang bei Zimmertemperatur stehen, wobei während dieser Zeit hie und da einmal gerührt oder geschüttelt wurde. Die klare überstehende flüssige Phase enthielt das aktive Prinzip der Pollen und wurde dekantiert, und der Rückstand wurde verworfen.
Das überstehende Material wurde dann in einen Vakuumrotationseindampfer (Schnellverdampfer) gegeben, der mit einem Kühler ausgestattet war, und man erhitzte auf 500 C, bis die flüssige Phase entfernt worden war. Man erhielt dabei ein im wesentlichen trokkenes bräunliches Pulver. Das Pulver wurde dann in einen Vakuumexsikkator gegeben, und man liess es unter Vakuum über Nacht stehen. Das so erhaltene fliessfähige Pulver enthielt keine Spuren an Lösungsmittel.
Beispiel 2
Herstellung eines diagnostischen Extraktes
Eine Lösung, die das Pollenantigen der in Beispiel 1 beschriebenen Pflanze enthielt, wobei der Gehalt an Antigen 10000 PNU pro ml war, wurde hergestellt, indem man 393,2 mg des getrockneten Pulvers, das nach Beispiel 1 hergestellt worden war, zu 100 ml Wasser bei 500 C zugab. Der pH-Wert der erhaltenen Lösung war 7,4. Diese Lösung wurde dann durch ein Milliporfilter filtriert, um sie zu sterilisieren. Das Filtrat wurde analysiert, und es zeigte sich, dass es 9100 PNU pro ml des speziellen Antigens enthielt.
Die oben beschriebene Lösung wurde dann mit destilliertem Wasser unter sterilen Bedingungen verdünnt, bis sie 1000 PNU pro ml enthielt. Dann wurde ein intrakutaner Test durchgeführt, wobei hiezu 4 Personen verwendet wurden, von denen man wusste, dass sie gegenüber den Pollen dieser speziellen Pflanze empfindlich sind. Eine zweite Lösung, die einen Gehalt an 5000 PNU/ml aufweist, wurde hergestellt, und es wurden intrakutane Hauttests mit zwei Personen durchgeführt, von denen man wusste, dass sie normal reagierten und nicht allergisch gegen die Pollen der genannten Pflanze waren. Die dabei erhaltenen Ergebnisse werden in der Tabelle 1 veranschaulicht. Von den in dieser Tabelle angeführten Patienten wusste man, dass die Patienten 1 bis 4 gegenüber den Pollen empfindlich waren, während die Patienten 5 und 6 gegenüber den Pollen nicht empfindlich waren.
In Tabelle 1 erfolgte die Beurteilung der Reaktionen der einzelnen Personen nach dem folgenden Schema: 0 = negative Reaktion, keine Hautreaktion (wheal) 1+ = schwache Reaktion 5 mm Hautreaktion mit Ery them (Hautrötung) 2 + = mässige Reaktion 10 mm Hautreaktion mit Ery them 3+ = deutliche Reaktion 15 mm Hautreaktion mit Ery them und Pseudopodie (Erhebung der Haut) und
Jucken möglich 4+ = deutliche Reaktion, 20 mm Hautreaktion mit Ery them, Erhebung der Haut, Jucken und Schmerzen
Tabelle 1
Empfindlichkeit
Patient 1000 PNU/ml. 5000 PNU/m1.
1 2+
2 2+
3 3+
4 2+
5 0
6 0
Beispiel 3
Das Verfahren des Beispiels 1 wurde durchgeführt, wobei man einen trockenen pulverförmigen Extrakt der Pollen der gleichen Pflanze herstellte. Dieser wurde mit destilliertem Wasser unter sterilen Bedingungen behandelt und bis zur jeweiligen Verdünnung verdünnt. Dieser Extrakt ist geeignet für die Hyposensitivierungstherapie von Personen, die gegen die Pollen dieser Pflanze allergisch sind und zur Diagnose von Allergien nach den Hauttests.
Beispiel 4-8
Die Beispiele 1-3 wurden wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass Haushaltsstaub, von Pferden abgestossene Materialien, Hühnerfedern, Kückenfedern, stechende Insekten, ein bestimmtes Gras (Zittergras Phleum pratense; timothy grass) und Birkenpollen anstelle der in Beispiel 1 verwendeten Pollen eingesetzt wurden. Derartige Extrakte werden zur Diagnose von allergischen Reaktionen durch Hauttestung oder zur Hyposensitivierungstherapie verwendet. Die trockenen Pulver können auch zur Diagnose von allergischen Reaktionen nach den Testmethoden der Bindehauttestung und des Riechtestes verwendet werden.
Beispiel 9
Etwa 100 ml des in destilliertem Wasser aufgenommenen Extraktes des Beispiels 3 wurden auf einen pH-Wert von 6,2 durch die Zugabe von verdünnter Schwefelsäure gebracht. Etwa 50 ml einer sterilen 2%igen Kaliumaluminiumsulfatlösung wurden langsam unter ständigem Rühren zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde von der darüberstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren entfernt, er wurde mit aus destilliertem Wasser hergestellter Kochsalzlösung gewaschen und erneut in einem Phosphatpuffer suspendiert, der einen pH-Wert von etwa 7,0 besass. Die erhaltene Ausbeute betrug etwa 80%. Diese allergen-aktive Suspension ist als langsam freisetzender Extrakt zur Hyposensitivierungs-Therapiebehandlung geeignet.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung eines Extraktes einer Substanz, die allergisches Reagieren hervorrufen kann, wobei der Extrakt das physiologisch aktive Prinzip des Allergens enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man das das Allergen enthaltende Material mit einer Extraktionsflüssigkeit vermischt, die Wasser und ein basischen Stickstoff enthaltendes organisches Lösungsmittel, das mit dem Allergen eine chemische Wechselwirkung eingeht, enthält, dass die Extraktionsflüssigkeit von dem darin unlöslichen Material entfernt wird, man das unlösliche Material verwirft und die extrahierte Flüssigkeit eindampft, damit man das aktive Prinzip dieser Substanz in Form eines stabilen allergen-aktiven Pulvers erhält.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ein heterocyclisches tertiäres Amin ist.
2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische tertiäre Amin einen Siedepunkt von unter 1200 C aufweist.
3. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das heterocyclische tertiäre Amin Pyridin, Chinolin, Lutidin, Collidin oder Picolin ist.
4. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktionsflüssigkeit einen pH-Wert von 7,5 bis 12 aufweist.
5. Verfahren nach Unteranspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktionsflüssigkeit ein alkalisches Pyridin enthaltendes Lösungsmittelsystem ist.
6. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Abdampfen der Extraktionsflüssigkeit dadurch
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