CH520709A

CH520709A - Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinderivaten

Info

Publication number: CH520709A
Application number: CH590962A
Authority: CH
Inventors: Gordon Cox James Stuart; Fazackerley Harry; Derek Cocker John
Original assignee: Glaxo Lab Ltd
Priority date: 1961-05-16
Filing date: 1962-05-16
Publication date: 1972-03-31
Also published as: DE1795484A1; DE1745624A1; NO133673B; SE317380B; JPS3917936B1; DE1795727A1; AT265513B; AT265520B; NO133673C; DE1795484B2; FR2030M; DE1745624C3; DK128611B; CH554371A; BE617687A; CH565184A5; DE1745624B2

Description

Verfahren zur Herstellung von C ephalosp orinderivaten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinderivaten, insbesondere von neuen Derivaten des Cephalosporins C und verwandter Verbindungen.

Die Konstitution des Cephalosporins C kann durch folgende Struktur wiedergegeben werden:
EMI1.1
worin R die Gruppe -(CH2)3.CH(NH2)CoOH bedeutet und in derselben Weise wird die Struktur der neuen nachfolgend aufgeführten Derivate bezeichnet.

Cephalosporin C und verwandte Verbindungen reagieren mit bestimmten Verbindungen von hochnucleophiler Natur wie nachfolgend beschrieben, indem die Acyloxygruppe des Cephalosporinmoleküls unter Bildung neuer Derivate ersetzt wird. Diese Derivate besitzen antibakterielle Aktivität, welche in vielen Fällen derjenigen des Stamm-Cephalosporins überlegen ist.

Diese neuen Verbindungen besitzen im allgemeinen den bedeutenden Vorteil, einer verbesserten Stabilität gegenüber Abbau in vivo, was sich z. B. durch Tierversuche ergibt, im Vergleich mit den entsprechenden Acetoxyverbindungen. Da die letzteren eine Aktivität gegenüber penicillinresistenten Organismen besitzen, ist dies sehr wichtig. Die Verbindungen besitzen ebenfalls Bedeutung als Zwischenprodukte zur Umwandlung in andere Cephalosporinderivate.

Die Erfindung betrifft nun einVerfahren zur Herstellung von Gephalosporin-C-Derivaten der Formel
EMI1.2
worin A den über das S-Atom gebundenen Rest eines stark nucleophilen S-haltigen Mittels, und zwar eines a) Thioharnstoffes oder substituierten Thioharnstoffes, b) aromatischen oder aliphatischen Thioamides oder c) eines Thiols, z. B. eines Thiophenols oder substituierten Thiophenols, R2 und R3 jeweils Wasserstoffatome oder R2 ein Was serstoffatom und R8 eine Acylgruppe oder eine mit Triaryl substituierte Alkylgruppe bedeuten, oder worin R2 und Ra zusammen einen zweiwertigen Acylrest bilden.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel
EMI2.1
worin Rt ein Acylrest ist, in einem inerten polaren Medium bei pH 5 bis 8 mit einem den Rest A abgebenden Mittel umsetzt.

Da die Gruppe R auch die Gruppe HOOC-CH(NH2) . (cH2)3-CO und die Gruppe Rt eine Acetylgruppe darstellen kann, ist ersichtlich, dass unter die Formel I auch Cephalosporin C als auch dessen Derivate fallen.

R3 kann ganz allgemein eine Acylgruppe darstellen, zum Beispiel eine Alkanoyl-, Alkenoyl-, substituierte Alkanoylgruppe, wie z. B. Aralkanoyl-, Aryloxyalkanoyl-S-Arylthioalkanoyl- und S-Arylthioalkanoylgruppen. Als Acylgruppen kommen vorzugsweise die folgenden Reste in Betracht:
1.) R'(CH2)nCO, worin R' einen Aryl-, Cycloalkyl-, substituierten Aryl- oder substituierten Cycloalkylrest und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten. Als Beispiele dieser Gruppe seien Phenylacetyl, Nitrophenylacetyl und Phenylpropionyl aufgezählt.

2.) CnH2ff+l CO, worin n eine ganze Zahl von L7 bedeutet. Die Alkylgruppe kann geradkettig oder verzweigtkettig und kann gewünschtenfalls durch ein Sauerstoff- oder ein Schwefelatom unterbrochen sein.

Beispiele derartiger Gruppen sind Hexanoyl-, Heptanoyl-, Octanoyl- und Butylthioacetylreste.

3.) CnH2n tCO, worin n eine ganze Zahl zwi- schen 2 und 7 ist. Die Alkenylgruppe kann geradkettig oder verzweigt sein und gegebenenfalls kann sie durch ein Sauerstoffatom oder Schwefelatom unterbrochen sein. Als Beispiele derartiger Gruppen seien Acrylyl-, Crotonyl- und Allylthioacetylgruppen aufgeführt.

4.) R'O CR"R"'.CO, worin R' die unter 1.) angegebene Bedeutung besitzt und R" und R"', die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome oder Alkylgruppen bedeuten. Ein Beispiel einer derartigen Gruppe stellt die Phenoxyacetylgruppe dar.

5.) R'SCR"R"'.CO, worin R', R" und R"' die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen. Beispiele derartiger Thiogruppen sind S-Phenylthioacetyl-, S-Chlorphenylthioacetyl- und S-Bromphenylthioacetylgruppen.

6.) R'(CH2)rnS(CH2)nCR"R"'.CO, worin R', R" und R"' die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, m eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 und n die Zahl 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten. Beispiele derartiger Gruppen sind S-Benzylthioacetyl-, Benzylthiopropionyl- und ,B-Phenäthylthioacetyl- gruppen.

7.) R'CO, worin R' die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt. Als Beispiel derartiger Gruppen seien Benzoyl-, substituierte Benzoyl- und Cyclopentanoylgruppen aufgeführt. Falls die Benzoylgruppe substituiert ist, können die Substituenten auch Alkyl- oder Alkoxygruppen sein und die Substituenten können in den 2- oder 2- und 6-Stellungen stehen. Eine geeignete 2,6-disubstituierte Benzoylgruppe stellt z.B. das 2,6 Dimethoxybenzoyl dar.

Die Umsetzung kann bequemerweise bewirkt werden, indem die Reaktionsteilnehmer in Lösung umgesetzt werden, d. h. die Reaktionsteilnehmer werden in der Lösung bei mässiger Temperatur, z. B. 15-700 C, vorzugsweise 37-500 C, während eines Zeitraums von einigen Stunden oder auch Tagen gehalten, bis das gewünschte Derivat in optimalen Ausbeuten erhalten ist.

Die Reaktion verläuft besonders gut, wenn sie bei einer Temperatur von etwa 37 C während eines eit- raums zwischen 48 und 72 Stunden durchgeführt wird.

Die Reaktionsteilnehmer werden vorteilhafterweise in ein Verhältnis von etwa 1 molaren Äquivalent der Verbindung der allgemeinen Formel II auf 1-10 molare Äquivalente des nucleophilen Reagenses angewandt.

Der ph-Wert der Reaktionslösung wird vorteilhafterweise innerhalb der Grenzen 5,0-8, bevorzugt 6-7, gehalten. Erforderlichenfalls sollte der pH-Wert der Lösung auf den gewünschten Wert durch Zugabe eines Puffermittels, z. B. Natriumacetat oder bei Verwendung eines Alkalisalzes des Cephalosporins der allgemeinen Formel II durch Zugabe von z. B. Essigsäure eingestellt werden.

Da die Reaktion nach einem polaren oder ionischen Mechanismus abzulaufen scheint, ist es notwendig, ein stark polares Medium anzuwenden, damit die Reaktion bei messbarer Geschwindigkeit abläuft. Das am allgemeinsten geeignete Lösungsmittel besteht aus Wasser, jedoch kann in den Fällen, bei welchen das nucleophile Mittel in Wasser nicht sehr löslich ist, ein Gemisch aus Wasser und einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit, z. B. Dimethylformamid, Aceton oder Äthanol angewandt werden; geeignete Verhältnisse für derartige Lösungsmittelmischungen sind 50:50 (v/v) oder 30:70 (v/v). Nichtwässrige polare Lösungsmittel, wie z. B. Aceton, können ebenfalls angewandt werden.

Das Reaktionsprodukt kann aus dem Reaktionsgemisch, welches z. B. unverändertes Cephalosporin oder andere Substanzen enthalten kann, durch eine Vielzahl von Methoden, z. B. Kristallisation, Ionophorese, Papierchromatographie oder Chromatographie auf Ionenaustauschharzen abgetrennt werden.

Gegebenenfalls kann in einigen Fällen die erhaltene Verbindung dann mit einem weiteren nucleophilen Mittel behandelt werden, um einen Ersatz des ersten nucleophilen Mittels zu bewirken. Dies kann bei bestimmten nucleophilen Mitteln von Vorteil sein.

Bevorzugte Cephalosporin-Verbindungen der allgemeinen Formel II sind Cephalosporin C und sein Benzylanaloges (R3 = Phenylacetyl), insbesondere in Form ihrer Alkalisalze, beispielsweise des Natriumsalzes. Wie sich jedoch aus den nachfolgenden Beispielen ergibt, ergaben sich auch bei anderen derartigen analogen Verbindungen mit einer vorteilhaften Aktivität.

Zu geeigneten nucleophilen Mitteln der Gruppe (a), den Thioharnstoffen, gehören Verbindungen der Formel
EMI3.1
worin R4, R5, R6 und R7, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome oder Alkyl-, Cycloalkyl-, Alkenyl-, Aryl-, oder Aralkylgruppen, sowie substituierte Gruppen von diesen Typen bedeuten oder worin R4 und R6 zusammen eine Alkylengruppe, z. B.

eine Äthylengruppe bilden. Beispiele derartiger Thioharnstoffe sind Thioharnstoff selbst, N-Phenylthioharnstoff, N,N'-Diphenylthioharnstoff und Sithylenthioharn- stoff.

Besonders bevorzugt wird es, Thiole zu verwenden, einschliesslich von Aminothiolen und substituierten Aminothiolen als nucleophile Mittel der Gruppe (c).

Beispiele derartiger nucleophiler Mittel sind 2-Aminoäthanthiol, 2-Amino-2-methylpropan- 1 -thiol, 3 Dimethylaminopropan-l-thiol und 2-Piperidinoäthan1-thiol.

Die als nucleophile Mittel in Form ihrer Metallsalze verwendeten Anionen liegen vorzugsweise in Form ihrer Alkalisalze, z. B. der Natriumsalze vor.

Wie vorstehend aufgeführt, sind die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhältlichen Verbindungen neu. Die neuen Verbindungen können in die folgenden allgemeinen Klassen eingeteilt werden, die den vorstehend aufgeführten Klassen der nucleophilen Mittel entsprechen: (a) Solche mit der allgemeinen Formel:
EMI3.2
worin R2, R3, R4, R5, R6 und R7 die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen: (b)solche mit der allgemeinen Formel:
EMI3.3
worin R2, RS, R4 und R5 die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen und R8 einen aliphatischen oder aromatischen Rest bedeutet; (c) solche mit der allgemeinen Formel:

:
EMI3.4
worin R2 und R3 die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen und R9 einen aromatischen oder substituierten aromatischen Rest bedeuten, sowie deren Alkalimetallsalze.

Zu dieser Unterklasse gehören Verbindungen, die sich von in dem Kern mit einer Amino- oder einer substituierten Aminogruppe, z. B. einer Alkylamino- oder Dialkylaminogruppe, substituierten Thiophenolen ableiten. Einfache Beispiele derartiger Thiophenole sind o- und p-Aminothiophenol. Dazu gehören auch Verbindungen, die sich von Thiophenolen ableiten, welche eine konjugierte Elektronen-anziehende Gruppe, d. h.

eine derartige Gruppe in o- oder p-Stellung oder gegebenenfalls in mehr als einer derartigen Stellung enthalten. Beispiele dieser Art nucleophiler Mittel sind die verschiedenen Nitrothiophenole, z. B. o-Nitrothiophe nol und o,p-Dinitrothiophenol.

Unter dem Ausdruck Elektronen-anziehende
Gruppe , der in der organischen Chemie bekannt ist, wird ein Substituent verstanden, welcher Elektronen stärker als Wasserstoff anzieht, (siehe z. B. A. M.

Remick Electronic Interpretatione of Organic Chemi stry , John Wiley & Sons Inc., New York, 1943).

Beispiele für Elektronen-anziehende Gruppen, die in den bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwende ten nucleophilen Mitteln vorhanden sein können, sind
Nitrogruppen, Nitrosogruppen, Carbonylgruppen,
Carboxylgruppen, Cyanogruppen und Trifluormethyl gruppen.

(d) (1) solche mit der Formel
EMI4.1
worin R2 und R3 die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen und R11 eine aliphatische oder vorzugsweise substituierte aliphatische Gruppe bedeutet, sowie deren Alkalimetallsalze; (2) solche mit der Formel
EMI4.2
worin R12 einen heterocyclischen Ring bedeuten, sowie deren Salze. Wichtige Mitglieder der Unterklasse sind Verbindungen, die von heterocyclischen Verbindungen mit geeigneten Substituenten herstammen und die aus 5- oder 6-gliedrigen Ringen und aus heterocyclischen Verbindungen dieser Art, welche an 6-gliedrige carbocyclische Ringe, z. B. Benzolringe, gebunden sind, sich ableiten. Heteroatome, die in dem Ring vorhanden sein können, sind Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff, wobei mindestens einer davon Stickstoff sein muss.

Üblicherweise ist die Mercaptogruppe an ein Kohlenstoffatom des heterocyclischen Rings gebunden und ein heterocyclisches Stickstoffatom steht anstossend an dieses Kohlenstoffatom, Der heterocyclische Ring kann andere Substituenten, z. B. N-Alkylgruppen, ketonischen Sauerstoff und dergleichen enthalten. In diese Unterklasse fallen deshalb Derivate des Thiazolins, Hydantoins, Imidazols, Thiazols, Oxazols und dergleichen, jedoch enthält es keine cyclischen Thioharnstoffe.

Beispiele heterocyclischer nucleophiler Mittel, welche verwendet werden können, sind somit 2-Mercaptothiazolin, 2-Mercaptohydantoin, 1-Methyl-2-merc apto imidazol, 2-Mercapto-imidazol, 2=Mercapto-benzimid- azol, 2-Mercapto-beIlzthiazol, 2-Mercapto-benzoxazol und 2-Mercapto-pyridin.

Als Beispiele für die Gruppe R12 seien aufgeführt:
EMI4.3

EMI5.1

EMI5.2
Selbstverständlich können, obwohl diese heterocyclischen Verbindungen als Thiole (Mercaptoverbindungen) oder Thionverbindungen aufgeführt sind, diese als Thion-, Mercaptozwitteriontautomere vorliegen und es werden auch derartige tautomere Formen umfasst. Es sei bemerkt, dass die heterocyclischen Verbindungen als Mercapto- oder Thionverbindungen aus Gründen der Herkömmlichkeit beschrieben sind.

Die vorstehend aufgeführten Verbindungen besitzen im allgemeinen antibakterielle Aktivität, wenn mindestens eine Acylgruppe an der Aminogruppe in der 7-Stellung vorhanden ist und einige dieser Verbindungen zeigen eine überlegene antibakterielle Aktivität gegenüber bestimmten Organismen, als es das Stamm Cephalosporinderivat selbst tut. Verbindungen von besonderer Bedeutung sind die gegebenenfalls substituierten Thiouronium- und Azidderivate. Verbindungen, deren 7-Stellung durch eine unsubstituierte Aminogruppe besetzt ist, sind besonders wertvoll als Zwischenprodukte zur Herstellung von Cephalosporinanalogen.

Ein Verfahrensprodukt von besonderer Bedeutung ist z. B. das Thiouroniumderivat des Benzylcephalosporins und kann durch folgende Formel wiedergegeben werden:
EMI5.3
Das Ultraviolettspektrum dieser Verbindung zeigt folgende Werte: 10 260(ru, E01' 189.

Es zeigt markante biologische Aktivität gegenüber Staph.aureus und V.subtilis. Die Aktivität dieses Derivates gegenüber Staph. aureus war gegenüber derjenigen des Stamm-Cephalosporin C, Benzylcephalosporin und dem Thiouroniumsalz des Cephalosporin C überlegen.

Es zeigte sich, dass es nicht nur eine signifikante Aktivität gegen penicillinsensitive Stämme von Staph.

aureus besass, sondern auch eine markante Aktivität gegen wichtige Stämme von penicillinresistenten Stämmen von Staph- aureus. Weiterhin erwies es sich höchst resistent gegenüber Staphylokokken-Penicillinase ebenso wie natürlich Cephalosporin C und Benzylcephalosporin. Eine andere Verbindung, die ebenfalls wichtig ist, stellt das Thiouroniumsalz des Cephalosporins C dar, welches sich gegenüber Staph. aureus und B. subtilis aktiver erwies als Cephalosporin C.

Andere wichtige Verfahrensprodukte, welche eine etwas ähnliche Aktivität wie die Verbindung der Formel XI aufweisen sind: 1) 7-Benzylthioacetamidocephalosporin-thiouronium salz
EMI6.1
2) 7-Allylthioacetamidocephalosporin-thiouroniumsalz
EMI6.2
3) 7-A-Benzylthiopropionamidocephalosporin-thiouroniumsalz
EMI6.3
4) 7-ss-Phenylpropionamidocephalosporin-thiouroniurnsalz
EMI6.4
5) 7-Pentancarboxamidocephalosporin-thiouroniumsalz
EMI6.5
6) 7-n-Butylthioacetamidocephalosporin-thiouroniumsalz
EMI7.1
7) 7-p-Chlorphenylthioacetamidocephalosporin-thiouroniumsalz
EMI7.2
8) 7-ss-Phenäthylthioacetamidocephalosporin-thiouroniumsalz
EMI7.3
9) 7-Phenylacetamidocephalosporin-mercaptopyridinderivat
EMI7.4
10) <RTI

ID=7.2> 7-Phenylacetamidocephalosporin-N-äthyl-thiouroniumsalz
EMI7.5
11) 7-Phenylacetamidocephalosporin-mercaptobenz oxazolderivat
EMI8.1

Die erfindungsgemäss erhaltenen Verbindungen können hydrolysiert werden, insbesondere diejenigen, die direkt aus Cephalosporin C erhalten wurden, wobei die entsprechenden 7-Aminocephalosporansäurederivate erhalten werden, die die folgende Formel besitzen
EMI8.2
worin Z den Rest eines starken nucleophilen Mittels, wie sie oben definiert wurden, bedeutet. Diese Derivate stellen wichtige Zwischenprodukte zur Herstellung von Acylderivaten dar, z. B. von Phenylacetylderivaten.

Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen können auf irgendeine übliche Weise, gegebenenfalls zusammen mit anderen antibiotisch wirksamen Substanzen, zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten verwendet werden.

So können die Verbindungen zu injizierbaren Präparaten in Lösung oder Suspension in einem geeignete ten Medium, z. B. sterilem, pyrogen-freien Wasser verarbeitet werden. Andererseits können sie mit festen Trägerstoffen vermischt und dann gegebenenfalls zu Tabletten gepresst oder in Kapseln abgefüllt werden.

Sie können auch mit geeigneten Grundlagen zur Herstellung von Suppositorien vermischt werden.

Einige der erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen besitzen eine niedrige Löslichkeit und es wurde gefunden, dass die Löslichkeit dieser Verbindungen verbessert werden kann, wenn ein physiologisch verträgliches, wasserlösliches Amid als Löslichkeitsaktivator zugesetzt wird.

Das wasserlösliche, verwendbare Amid muss physiologisch verträglich sein und darf infolgedessen keine unzulässigen toxischen Effekte bei den angewandten Verhältnissen hervorrufen.

Bevorzugt werden Harnstoff oder Nicotinamid verwendet, da diese Substanzen physiologische Substanzen darstellen und im Fall von Harnstoff der Körper mit einem genügenden Entfernungsmechanismus für dasselbe versehen ist, während Nicoünamid ein Glied des B-Komplexes der Vitamine ist. Jedoch können andere wasserlösliche Amide, z. B. Acetamid ebenfalls verwendet werden, welche keine unzulässigen toxischen Effekte hervorrufen. Es sei bemerkt, dass die Verabreichung eines wasserlöslichen Amides, insbesondere parenteral, Anlass zu einigen Nebeneffekten, wie z. B.

Verminderung des Blutdruckes geben kann, jedoch können derartige kleine Nebeneffekte in vielen Fällen hingenommen werden. Im allgemeinen wird die Verwendung von Amiden, welche Feststoffe bei 200 C sind, bevorzugt.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen eignen sich sowohl für die orale als auch für die parenterale Applikation, sie sind von besonderer Bedeutung zur Herstellung von injizierbaren Präparaten für die intramuskuläre oder subcutane Injektion. Die Präparate können auch als trockene Gemische des antibiotischen Materials zusammen mit dem Amid hergestellt werden, wobei diese Gemische zur Auflösung oder Dispersion in pyrogen-freiem Wasser vor der Injektion geeignet sind. Die für die orale Applikation bestimmten Präparate können Trägerstoffe, wie z. B. Geruchsmittel und Süssungsmittel, enthalten.

Lösungen und Suspensionen der aktiven Substanzen können auch weitere löslichmachende Substanzen enthalten, insbesondere physiologisch verträgliche wasser-mischbare organische Lösungsmittel für das aktive Material, z. B. Alkohol, Propylenglycol, Dimethylformamid, Dimethylacetamid und dergleichen. Es sei bemerkt, dass einige dieser Substanzen zur parenteralen Verabreichung nicht geeignet sind, während sie für orale Verabreichung geeignet sind und umgekehrt.

Die Verfahrensprodukte können zusammen mit anderen antibakteriellen Antibiotika, insbesondere den Penicillinen, z. B. Penicillin G und/oder den Tetracyclinen als Komponenten in den pharmazeutischen Präparaten enthalten sein.

In den nachfolgenden Beispielen wurden die folgenden Tests und Versuchs anordnungen angewandt.

Papierchromatographie
Phosphat-gepufferte Papiere
Wasserfreies Dinatriumhydrogenphosphat (7,05 g) in 2,5 Liter Wasser (0,02 Mol) wurde mit Phosphorsäure auf pH 6 eingestellt; Whatman-Papiere No. 1( 30 X 50 cm) wurden in die vorstehende Lösung eingetaucht und bei 37 C über Nacht getrocknet.

Natriumacetat-gepufferte Papiere
Hydratisiertes Natriumacetat (13,6 g) in 1 Liter Wasser (0,1 M) wurde mit Essigsäure auf pH 5 eingestellt; Whatman-Papiere No. 1 (30 x 30 cm) wurden in die vorstehende Lösung eingetaucht und getrocknet.

Die Papierchromatogramme wurden auf den phosphat-gepufferten Papieren in (A) Butan-1-ol-.2ithanol- Wasser (4:1:5; Volumen) und (B) Propan-l-ol-Wasser (7:3; Volumen) laufen gelassen. Ebenso wurden die Natriumacetat-gepufferten Papiere in Essigsäureäthylester-Natriumacetat-System (Essigsäureäthylester gesättigt mit Natriumacetat-Puffer pH 5,0) laufen gelassen.

Elektrophorese
Die Elektrophorese wurde auf Whatman 3MM Papier bei 17 v/cm (während 2,54 Stunden, falls nichts anderes angegeben ist) in wässriger Collidinacetatlösung (0,05 M bezüglich Acetat) pH 7,0 und Pyridinacetatlösung (0,05 M bezüglich Acetat) pH 4,0 laufen gelassen.

Die Ergebnisse der Elektrophorese sind ausgedrückt als der von den Derivaten erzielte Abstand in Beziehung zu dem Abstand von Cephalosporin C oder gegebenenfalls Benzylcephalosporin C unter denselben Bedingungen. Ein positiver (+) Wert bedeutet Wanderung der Anode, d. h. das Molekül ist negativ geladen, während ein negativer (-) Wert eine Wanderung gegen über der Kathode bedeutet, d. h. positive Ladung.

Die Glieder der Benzylcephalosporinreihe sind als dunkle Flecken zu sehen, wenn das Papier vor eine Quelle für Ultraviolettlicht (R 230-300 m) gebracht wird (Benzylcephalosporinderivate geben natürlich keine Färbung mit Ninhydrin). Sie liessen sich auch mittels Bioautographen auf Agarplatten, die mit S.

aureus C864 (Oxford H-Stamm), B. subtilis ATCC 6633 oder V. cholerae C833 (abgeschwächter Laboratoriumsstamm) inoculiert waren, feststellen.

Die Glieder der Cephalosporin-C-Reihe liessen sich als dunkle Flecken sehen, wenn das Papier von einer Quelle für Ultraviolettlicht (230-300 m,u) gebracht wurde und erscheinen als dunkle Flecken, wenn das Papier mit Ninhydrin besprüht wird. Sie lassen sich auch mittels Bioautographen auf Agarplatten, die mit S. aureus C864 (Oxford H-Stamm) oder B. subtilis ATCC 6633 inoculiert sind, feststellen.

Beispiel 1 (a) Herstellung des Thiouroniumsalzes von Cephalosporin C
5 g des Natriumsalzes von Cephalosporin C wurden zusammen mit 8 g Thioharnstoff in 200 ccm destilliertem Wasser gelöst und im Dunkeln bei 37 einige Tage stehen gelassen. Der Verlauf der Reaktion wurde durch Papierchromatographie verfolgt. Nach 4-5 Tagen zeigte sich, dass wenig Cephalosporin C übrig war. Die erhaltene Lösung wurde mit 1000 ccm Aceton behandelt und auf 0 C abgekühlt. Der ölige, sich bildende Niederschlag wurde durch Zentrifugation abgetrennt und es ergab sich bei weiterer Behandlung mit Aceton ein blassbrauner fester Stoff (3,7 g). Unter denselben Bedingungen blieb eine Lösung von Thioharnstoff (Konzentration 4 g/1000 ccm) klar.

Der blassbraune Feststoff, der das gesamte biologisch aktive Material enthielt, wurde in 50 ccm Wasser gelöst und durch eine Säule (26,0 X 2,5 cm) von Dowex1 (X 8) im Acetatzustand gegeben. Das Thiouroniumsalz wurde rasch aus der Kolonne gelöst und erscheint meist mit der Lösungsmittelfront. Die Kolonne wurde mit Wasser eluiert und 25 ccm-Fraktionen gesammelt.

Die Untersuchung dieser Fraktionen durch Papierchromatographie zeigte, dass nur Spuren von Thioharnstoff in den Lösungen des Thiouroniumsalzes vorhanden waren und dass das gesamte unumgesetzte Cephalosporin C entfernt war. Die wässrigen Lösungen, die die Thiouroniumverbindung enthielten, wurden gefriergetrocknet, wobei sich ein cremefarbiger fester Stoff (2,58 g) ergab. Dieses Material wurde weiterhin durch Extraktion mit absolutem Methanol zur Entfernung des vorhandenen Natriumacetates gereinigt, wobei die Thiouroniumverbindung als flockiger, fester Stoff (2,18 g) erhalten wurde.

Ultraviolett-Absorption (in H2O) # max. sehr breit 2590-2640 A E 1% 161.

1cm
Das Thiouroniumsalz wurde als weisser mikrokristalliner Feststoff durch vorsichtige Ausfällung aus einer wässrigen Lösung mittels Methanol erhalten.

Ultraviolett-Absorption (in H2O) 2 marx. sehr breit 2590-2640 A EI1C01m0 189.

Bei der Elektrophorese auf Papier zeigte das Produkt, wie zu erwarten, keine Änderung bei pH 7,0 oder pH 4,0.

Bei Papierchromatographie in Butan-1-ol-äthanol Wasser war der Rf-Wert ( > 0,02) des Salzes niedriger als derjenige des Cephalosporins C (0,03). In gleicher Weise war der Rf-Wert in Propanol-Wasser niedriger (0,11) im Vergleich zu Cephalosporin C (0,22). Durch Papierchromatographie wurde festgestellt, dass sich bei saurer Hydrolyse sowohl a-Aminoadipinsäure als auch Thioharnstoff ergibt.

Aus diesen Eigenschaften ergibt sich, dass die Acetoxygruppe in dem Cephalosporin C durch den Thiouroniumrest ersetzt wurde.

(b) Saure Hydrolyse des
Cephalosporin-thiouroniumsalzes
50 mg Cephalosporin-thiouroniumsalz wurden in 2 ccm Salzsäure von verschiedenen Stärken (a) n/10, (b) ln, (c) 2n, (d) 3n, (e) 4n, (f) 5n gelöst und 1. bei Raumtemperatur von ca. 250 C und 2. bei 37 C einige Tage stehen gelassen. Aliquote Teile von 10,ul wurden in geeigneten Zwischenräumen entnommen.

Die Reaktionen wurden durch Papierchromatographie und Elektrophorese verfolgt. In allen Fällen wurde die Thiouroniumverbindung (Rf 0,11) in ein schneller wanderndes Material (Rf 0,20) verwandelt, welches sehr schwach biologisch aktiv sowohl gegenüber S.

aureus und B. subtilis war und leicht unter U. V. Licht als dunkle Zone (wie sämtliche Cephalosporinderivate) sich feststellen liess. Beim Besprühen der Chromatogramme mit (a) wässrigem Pyridin und anschliessend (b) mit einer Acetonlösung von Phenylacetylchlorid ergab dieses rascher wandernde Material (Rf 0,20) ein sehr biologisch aktives Material. Ähnliche Verfahren wurden angewandt, um dieses Material nach der Elektrophorese festzustellen, bei welcher es sich schneller zu der Kathode bei pH 4,0 bewegte als das Cephalosporinthiouroniumsalz.

Aufgrund direkter Analogie mit Cephalosporin ist dieses Material das 7-Aminocephalosporan-thiouroniumsalz. Aus diesen Vorversuchen ergab es sich, dass geeignete Bedingungen für die Herstellung von 7-Ami nocephalosporan-thiouroniums alz (d. h. des Thiouroniumkernes) vorliegen, wenn das Thiouroniumsalz mit 2 bis 3 n Salzsäure 34 Tage lang behandelt wird.

(c) Abtrennung des Thiouroniumkernes aus der sauren
Hydrolyse des Cephalosporin-C-thiouroniumsalzes
Die Säule und die Puffer wurden entsprechend dem Verfahren von Hirs, Moore und Stein, J. Biol.

Chem. 1952, 195, 669 hergestellt.

500 mg Cephalosporin-C-thiouroniumsalz wurden in 20 ccm 2n Salzsäure gelöst und 3 Tage stehen gelassen. Der pH-Wert der Lösung wurde dann auf pH 4,0 mit Natriumhydrogencarbonat eingestellt. Die Lösung wurde dann biologisch bei diesem Punkt untersucht und es zeigte sich, dass etwa 30 /o der ursprünglichen biologischen Aktivität noch vorhanden waren.

Diese Lösung wurde durch eine Kolonne (2,5 30 cm) von Dowex -50 (NH4-Zustand) gegeben und mit einem Ammonium-Formiat-Puffer (pH 4,05, 0,2 M) eluiert.

Fraktionen von 10 ccm wurden gesammelt und entsprechend ihrer Ultraviolettabsorption analysiert. Es wurden 60 Fraktionen gesammelt, von denen die Fraktionen 8-28 die Gipfelfraktion enthielten. Die Untersuchung dieses Materials nach der Gefriertrocknung zeigte, dass es unverändertes Cephalosporin-C-thiouroniumsalz zusammen mit anderen Hydrolyseprodukten enthielt. Es war kein Thiouroniumkern in irgendeiner dieser Fraktionen vorhanden.

Fortgesetzte Eluierung der Säule mit Ammonium acetatpuffer (pH 6,8, 0,2 M) ergaben den Kern als breiten Gipfel (Fraktionen 70-90). Diese Lösung, welche den Tniouroniumkern enthielt, was durch Papierchro matographie und Bioversuch nach der Besprühung mit Pyridin und Phenylacetylchlorid gezeigt wurde, wurde unter Verwendung eines grossen Überschusses von Phenylacetylchlorid phenylacetyliert, wobei der pH-Wert der Lösung bei 7 durch Zugabe von Natriumhydrogencarbonat gehalten wurde. Die erhaltene Lösung enthielt Benzylcephalosporin-thiouroniumsalz als einzig aktives Material. Direkte Isolierung des Kerns war nicht möglich in diesem Fall, da nicht der gesamte Ammoniumacetatpuffer entfernt werden konnte.

Bei den Beispielen 6-8 wurde das folgende Versuchsverfahren angewandt.

250 mg (0,5 mMol) des Natriumsalzes von Cephalosporin C wurden in 10 ccm einer wässrigen Lösung des in einer Menge von 5 mMol verwendeten nucleophilen Reagenses gelöst. Der pH-Wert der Lösung lag zwischen 5,0 und 7,5 und wurde erforderlichenfalls auf einen Wert innerhalb dieses Bereiches durch Zugabe von Essigsäure eingestellt. In bestimmten Fällen, wo die Löslichkeit in Wasser niedrig war, z. B. bei Diphenylthioharnstoff, wurde die Reaktion in 50 6/obigem (v/v) Dimethylformamid durchgeführt. Das Gemisch wurde bei 370 C gehalten und nach entsprechenden Zwischenräumen, z. B. 24, 48 und 72 Stunden wurden 5 oder 10,ul-Proben auf Papier aufgetragen zur Analyse sowohl durch Elektrophorese als auch durch Chromatographie.

Durch Bioautographien ergaben sich die neuen Substitutionsprodukte und das restliche Cephalosporin C. Ähnliche Ergebnisse wurden nach der Besprühung mit Ninhydrin erhalten.

Die Elektrophoreseergebnisse sind als Wanderungsabstand des Derivates in Beziehung zu der Stamm Cephalosporin-Verbindung unter denselben Bedingun- gen angegeben. Ein positiver (+) Wert bedeutet Wanderung zu der Anode, d. h. das Molekül ist negativ geladen, während ein negativer (-) Wert Wanderung zur Kathode bedeutet, d. h. das Molekül ist positiv geladen. Die Ergebnisse dieser Beispiele sind in Tabellenform nachfolgend wiedergegeben.

Tabelle I Beispiel Nucleophiles Reaktions- Rf-Wert Elektrophorese Formel d. Derivates
Mittel medium auf Ceph. pH 4,0 pH 7,0 (in allen Fällen
Cbezogen R2 =H,R5 =
HOOGCH(NH2) (CH2)S-CO-) 2 Thioharnstoff H2O 0,53 - 0,19 - 0,26 Formel III
R4, R5, R6 und R7 = H 3 Phenylthio- H20 1,39 - - Formel III harnstoff Reaktion R4 = Phenyl durchgeführt Rs, R6 und bei500 C R7 = H
Tabelle l (Fortsetzung) Beispiel Nucleophiles Reaktions- Rf-Wert Elektrophorese Formel d.

Derivates
Mittel medium auf Ceph. pH 4,0 pH 7,0 (in allen Fällen
C bezogen R = H, R3 = HOO & H(NH2)- (CH2)a-CO-) 4 Diphenylthio- Dimethyl- 2,43** - - Formel III harnstoff formamid/H2 R4 = Phenyl (70: 30 v/v) R6 = Phenyl
R5 und R7 = H 5 Athylenthio- Dimethyl- 0,64 - - Formel III harnstoff formamid/H20 R4 und R6 (70: 30 v/v) zusammen = Äthylen
R5 und R7 = H 6 Thioacetamid H2O 1,41** - - Formel IV
R4 und R5 = H Rs = Methyl 7 Thiophenol AetOH/H2O 2,17 - - Formel V (50:

50 v/v) R6 = Phenyl 8 2-Amino- H2O 0,42 +0,33 +0,35 Formel VII äthanthiol Rtt= -C2H4-NH ** Reaktionslösung enthält auch weitere biologisch aktive Verbindungen.

Beispiel 9 (a) 72 mg des Natriumsalzes des Benzylcephalosporins wurden zusammen mit 128 mg Thioharnstoff in 3 cbm destilliertem Wasser gelöst und im Dunkeln bei 370 C einige Tage stehen gelassen. Nach 3 Tagen wurde der gebildete weisse Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt.

Dieses Material wurde mit Aceton und Äther gewaschen und ergab einen weissen, festen Stoff (28,9 mg).

Eine weitere Menge (etwa 5 mg) dieses Materials wurde aus der Mutterlaugen erhalten. Dieser Feststoff ergab einen einzigen biologisch aktiven Flecken bei der Chromatographie im Propanol/Wasser-System (7:3; Volumen). Rf-Wert = 0,74. R-Wert Benzyl ceph. = 0,91.

Die Untersuchung der Mutterlauge durch Chromatographie zeigte das Vorhandensein von unverändertem Natriumsalz des Benzylcephalosporins (Rf 0,81), von Thioharnstoff (Rf 0,50) und geringer Mengen des Benzylcephalosporin-thiouroniumsalzes (Rf. 0,74). Das auf diese Weise erhaltene Benzylcephalosporin-thiouroniumsalz war in Wasser sehr spärlich löslich ( < 5 mg/ccm).

Bei der Papierelektrophorese ergab sich, dass es keine Ladungsänderung bei pH 7,0 erhält.

Ultraviolettspektrum (in H2O) A max. 2600 A E 1% 189.

1 cm (b) Bei der Phenylacetylierung eines entsprechend Beispiel 1 (b) erhaltenen Gemisches in wässrigem Aceton (50 v/v) unter Verwendung eines grossen Über- schusses von Phenylacetylchlorid, d. h. den Bedingungen, die zur Umsetzung mit dem Cephalosporinkern verwendet wurden, ergab sich eine Lösung, die das Benzylcephalosporin-thiouroniumsalz, das durch seinen Rf-Wert im Vergleich mit einer authentischen Probe identifiziert wurde, zusammen mit anderem biologisch aktiven Material, z. B. dem Cephalosporin-C-thiouroniumsalz und N-Phenylacetyl-cephalosporin-C-thiouroniumsalz enthielt. Die Gesamtausbeute der Umwandlung von Cephalosporin-C-thiouroniumsalz in das Benzylcephalosporin-thiouroniumsalz liegt in der Grösenordnung von 4 o/o.

Beispiele 10-23
Herstellung der
Glieder der Cephalosporin-C-Reihe
250 mg (0,5 mMole) des Natriumsalzes von Cephalosporin C wurden in einer wässrigen Acetonlösung (50 v/v; 10 ccm) des nucleophilen Mittels (1,5 mMol, d. h. 3 molare Äquivalente) gelöst. Der pH-Wert der Lösung betrug zwischen 5,0 und 7,5 und wurde erforderlichenfalls auf einen Wert innerhalb dieses Bereiches durch Zugabe von Essigsäure oder Natriumbicarbonat eingestellt. Das Gemisch wurde bei 37 oder 500 C gehalten und nach entsprechenden Zwischenräumen, z. B. 24, 48 und 72 Stunden usw, wurden 5 oder 10,ul-Proben zur Analyse sowohl durch Elektrophorese als auch durch Chromatographie entnommen. Bei Bioautographien ergab sich das neue Substitutionsprodukt und restliches Cephalosporin C.

Ähnliche Ergebnisse wurden nach Besprühen mit Ninhydrin erhalten.

Beispiele 24-41
Herstellung der Glieder der Benzylcephalosporin-C-Reihe
Aufgrund der durchschnittlich grösseren mikrobiologischen Aktivität der Benzylcephalosporin-C-Reihe und auch der bequemeren Untersuchung wegen wurden verdünntere Lösungen als im Vorstehenden angewandt, z. B. wurde 7-Phenylacetamido-cephalosporansäure (Benzylcephalosporin C) als Natriumsalz in einer Menge von 10 mg in einer wässrigen Acetonlösung (50 v/v; 2 ccm) des nucleophilen Mittels (3 molare Aquivalente) gelöst. Die Reaktion wurde wie bei den vorstehenden Beispielen durchgeführt mit der Ausnahme, dass aliquote Teile von etwa l,ul zur Chromatographie und Elektrophorese verwendet wurden.

Die Ergebnisse sind in tabellarischer Form in den nachfolgenden Tabellen II und III wiedergegeben. In den Tabellen bedeutet P. W. das System Propanol/ Wasser und B. E. W das System Butanol/Sithanol/Was- ser.

Tabelle II
Nucleophile Substitution von Cephalosporin C
R Ceph.-C-Wert Elektrophorese Beispiel Nucleophiles Mittel P. W. B. E. W. pH 4,0 pH 7,0 10 Athylenthioharnstoff 0,63 von Ceph. -0,27 -0,67
C nicht trennbar 11 2-Mercaptothiazolin 1,55 4,11 - 12 2-Mercaptohydantoin 1,64 5,35 - 0,77 - 0,20 13 1-Methyl-2-mercaptoimidazol 0,75 von Ceph. -0,15 +0,52
C nicht trennbar 14 2-Mercapto-imidazol 0,79 von Ceph.

-0,16 +0,39
C nicht trennbar 15 2-Mercaptobenzimidazol 2,0 4,6 -0,39 +0,22 16 2-Mercaptobenzothiazol 2,0 8,0 + 0,65 + 0,54 17 2-Mercaptobenzoxazol 1,9 8,0 +0,79 +0,50 18 2-Aminothiophenol 2,4 10,0 +0,80 +0,74 19 4-Aminothiophenol 2,25 10,0 + 0,04 +0,53 20 4-Nitrothiophenol 1,75 8,0 +0,93 +0,69 21 2,4-Dinitrothiophenol 2,0 4,0 +0,63 +0,55 22 2-Aminoäthanthiol 0,44 0,2 +0,22 + 0,25 23 3-Dimethylaminopropanthiol 0,55 0,4 -0,50 -0,08
Tabelle III
Nucleophile Substitution von Benzylcephalosporin C Beispiel Nucleophiles Mittel R-Benzyl-Ceph.-C-Wert Elektrophorese
B. E. W. Ät.

Ac. * pH 4,0 pH 7,0 24 Athylenthioharnstoff von Benzyl- 0,08 - 0,17 0,58
Ceph.-C nicht trennbar 25 2-Mercaptothiazolin 1,15 3,06 - 0,20 -1,20 26 2-Mercaptohydantoin 1,17 0,09 - 01,20 - 01,56 27 1-Methyl-2-mercaptoimidazol von Benzyl- 0,41 -0,14 +0,31
Ceph.-C nicht trennbar 28 2-Mercapto-imidazol 1,15 0,25 --0,22 - 0,19 29 2-Mercaptobenzimidazol 1,25 1,9 -0,17 +0,18 30 2-Mercaptobenzothiazol 1,25 3,5 +0,45 +0,29 31 2-Mercaptobenzoxazol 1,25 3,3 +0,66 +0,48 32 2-Aminothiophenol 1,20 3,35 +0,27 +0,54 33 4-Aminothiophenol 1,25 3,4 +0,0 +0,0 34 4-Nitrothiophenol 1,20 3,35 +0,65 +0,73 35 <RTI

ID=13.14> 2-Aminoäthanthiol 0,80 0,05 -0,27 -0,25 36 3-Dimethylaminopropanthiol 0,75 0,05 - 0,27 - 0,25 37 2-Mercapto-4-methylpyrimidin 1,1 3,0 +0,73 +0,55 38 2,-Amino-5-mercapto-1,3,4-thiadiazol 1 0,3 +0,72 +0,52 39 2-Mercaptopyridin 1,15 3,6 - +0,3 40 Athylthioharnstoff 1,0 0 0 41 Isopropylthioharnstoff 1,0 0 0 * Ät. Ac. = Essigsäureäthylester
Beispiel 42
Herstellung des 2-Mercaptobenzoxazolderivates von Cephalosporin 5 G Cephalosporin C in 75 ccm Wasser wurden unter Rühren zu einer Lösung von 5 g 2-Mercaptobenzoxazol in 215 ccm Aceton und 60 ccm Wasser zugegeben und der pH-Wert von 5 mit n-Natriumhydrogencarbonat auf 6,6 gestellt.

Das Gemisch (ca. 60 v/v Aceton) wurde bei 37 C vier Tage gehalten, wobei sich bei Papierchromatographie das Vorhandensein nur noch geringer Mengen Cephalosporin C ergab. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei 0 auf 2 Liter mit Aceton verdünnt.

Filtrierung nach 3 Stunden ergab einen ziemlich weissen festen Stoff (4 g Ausbeute, 80 6/0 Gewicht/ Gewicht Cephalosporin C), der durch Papierchromatographie einen Gehalt einer kleinen Menge (ca. 5 0/5) Cephalosporin C ergab. Das rohe Substitutionsprodukt zeigte die chromatographischen und elektrophoretischen Eigenschaften, die in Tabelle II (Beispiel 17) aufgeführt sind. Es war in Wasser stark löslich.

Beispiel 43
Herstellung des 2-Mercaptobenzthiazolderivates von Benzylcephalosporin C
435 mg des Natriumsalzes von Benzylcephalosporin C in 4 ccm Wasser wurden zu einer Lösung von 496 mg 2-Mercapto-benzothiazol in 6 ccm Aceton gegeben und der auftretende pH-Wert auf 7,0 mit n Natriumhydrogencarbonat eingestellt. Das Gemisch wurde bei 500 C während 65 Stunden gehalten, wo praktisch das gesamte Ausgangsmaterial umgesetzt war (Papierchromatographie). Das Aceton wurde dann im Vakuum entfernt und die hinterbleibende wässrige Suspension mit 10 ccm Wasser behandelt und mit Essigsäureäthylester bei pH 6 in Gegenwart von gesättigtem Natriumchlorid (5ccm) extrahiert. Ein ziemlich weisser, fester Stoff (A) wurde während der Extraktion abgetrennt.

Die hinterbleibende wässrige Lösung nach dieser Extraktion wurde auf pH 2 eingestellt und weiterhin mit Essigsäureäthylester extrahiert. Der Extrakt bei pH 6 (486 mg) enthielt unverändertes nucleophiles Mittel und das gewünschte Substitutionsprodukt. Der Extrakt bei pH 2 (65 mg) enthielt Spuren von unver ändertem Benzylcephalosporin.

Der Feststoff (A) (unlöslich in Aceton; 136 mg) bestand aus dem gewünschten Substitutionsprodukt mit den in Tabelle III (Beispiel 30) aufgeführten chromatographischen und elektrophoretischen Eigenschaften und war chromatographisch homogen.

Beispiel 44
Herstellung des 1-Methyl-2-mercapto imidazolderivates von Benzylcephalosporin C 100mg des Natriumsalzes von Benzylcephalosporin C wurden in 1 ccm Wasser gelöst und mit einer Lösung von 85 mg (3 molare Äquivalente) von 1 Methyl-2-mercaptoimidazol in 1 ccm Aceton behandelt. Die erhaltene Lösung wurde bei 370 C einige Tage stehen gelassen, wobei die Reaktion durch Papierchromatographie verfolgt wurde. Nach 4 Tagen wurde der Überschuss des nucleophilen Mittels aus dem Reaktionsgemisch durch Extraktion mit Chloroform (2
X 1 ccm) entfernt und der pH-Wert der hinterbleibenden wässrigen Lösung auf ca. 2,5 entweder mit Phosphorsäure oder mit Amberlite IR.120 (H+) eingestellt, Durch Extraktion mit Essigsäureäthylester (3 X 2 ccm) wurde das restliche unveränderte Benzylcephalosporin C entfernt.

Die hinterbleibende wässrige Lösung, die das neue Substitutionsprodukt enthielt, wurde auf pH 7 mit Natriumhydrogencarbonat oder Deacidite G(CO3") eingestellt und gefriergetrocknet.

Durch Untersuchung mittels Papierchromatographie und Elektrophorese ergab sich nur ein biologisch aktives Material, d. h. das Benzylcephalosporin-thio- imidazoliniumsalz, obwohl unterschiedliche Mengen anorganischer Salze vorhanden waren, je nachdem, ob Ionenaustauschharze zur Einregelung des pH-Wertes verwendet wurden. Das Benzylcephalosporin-thloimid- azoliniumsalz war sowohl gegenüber S. aureus als auch
V. cholerae aktiv.

Beispiel 45 (a) Herstellung von Phenoxymethylcephalosporin
500 mgm 7-Aminocephalosporans äure (7ACA) (E te/m = 260 marx. = 300 m, gelöst in 25 ml 3 0/obiger NaHCO3 (5 molare Äquivalente) wurden mit 16 mol Aceton behandelt. Die Lösung wurde auf unterhalb 5 C abgekühlt und mit einem Magnetrührer gerührt, während 376 mg Phenoxyacetylchlorid, gelöst in 10 ml Aceton tropfenweise im Verlauf von 30 Minuten zugegeben wurden. Die Lösung wurde im Verlauf einer Stunde auf Raumtemperatur gebracht.

Das Aceton wurde im Vakuum entfernt und die wässrige Schicht mit 2 X 25 ml ather extrahiert. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 4,0 mit 3n H2SO4 wurde der Überschuss an Phenoxyessigsäure extrahiert mit 1 X 50 ml Benzol. Schliesslich wurde der pH-Wert der wässrigen Schicht auf 2,0 eingestellt und dann mit 3 X 50 mm Essigsäureäthylester extrahiert.

Diese Extrakte wurden zusammengegeben, 10 Minuten über Na2SO4 getrocknet und das Volumen im Vakuum eingeengt, wobei sich 724 mg eines Öls ergaben. Dieses wurde in einem minimalen Volumen Aceton (etwa 3 ml) aufgenommen und dazu 326 mg Natrium 2-äthylhexoat (1,1 molares Äquivalent) in wässrigem Aceton zugegeben. Die Lösung wurde 1 1/2 Stunden kalt gehalten und das Produkt durch Filtration abgetrennt, mit trockenem Aceton gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 470 mg.

1. U.V. Amjn zu = 235
Elol, -126
1 cm max. = 263 E 1% = 190
1cm
2. Chromatographie: Propanol/Wasser (7: 3) RF = 0,73
Essigsäureäthylester/pH 5 Puffer RF = 0,33
3. Elektrophorese: bei pH 4,0 und 7,0 Rceph.c = 1,0 (b) Herstellung der Phenoxymethylcephalosporin thiouronium-Verbindung 200mg des Natriumsalzes von Phenoxymethylcephalosporin und 240 mg Thioharnstoff wurden in 2 ml H2O gelöst und im Dunkeln 3 Tage bei 370 C gehalten. Beim Abkühlen der Lösung auf 0 C wurde ein Niederschlag erhalten, der bei 0 C filtriert und mit wenig eiskaltem Wasser gewaschen wurde.

Der Fest stoff wurde in einem Vakuum-Exsiccator über Nacht getrocknet, wobei sich 67,2 mg Feststoff ergaben.

1. U.V.: Schulter bei 258-265 mjt #max. = 237 m A min = 230 r9u
2. Chromatographie:
Propanol/H2O 0,665
Essigsäureäthylester/Puffer 0
3. Elektrophorese:
Keine Bewegung bei pH 4,0 und 7,0
Beispiel 46 (a) Herstellung von n-Heptylcephalosporin 500mg von 7ACA in 25 ml 3 0/oigem NaHCO3 und 16 ml Aceton gelöst. Die Lösung wurde auf unterhalb 5 C abgekühlt und 0,73 ml (2,5 molare Äquivalente) Caprylylchlorid in 10 ml trockenem Aceton tropfenweise im Verlauf von 30 Minuten zugegeben.

Die Lösung wurde dann im Verlaufe einer Stunde auf Raumtemperatur gebracht, das Aceton wurde im Vakuum entfernt und die hinterbleibende Lösung 2 X mit 25 ml Äther extrahiert. Der pH-Wert wurde auf 3,0 vor der Benzolextraktion ( 1 X 50 ml) eingestellt und danach weiterhin auf 2,0 vor der Extraktion mit Essigsäureäthylester (3 X 50 ml) gebracht. Die Essigsäure äthylesterschichten wurden dann zusammengegossen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum eingeengt, wobei sich 391 mg eines kristallinen Feststoffes ergaben. Dieser wurde in wenig Aceton gelöst und 170 mg (1,1 molares Aquivalent) Natrium-2-äthylhexoat in wässrigem Aceton zugegeben. Die Lösung wurde eine Stunde in den Eisschrank gestellt und das Produkt durch Filtrieren gesammelt, mit trockenem Aceton gewaschen und getrocknet.

1. U.V.: min. = 220 X max = 263
2. Chromatographie: Butanol/ÄtOH/H20 RF 0,75
Propanol/H20 RF 0,84 Essigsäureäthylester/Puffer R 0,70
3. Elektrophorese: pH 7,0 RCeph.c =1,0 pH 4,0 Rceph.c = 1,04 (b) Herstellung der n-Heptylcephalosporin thiouroniumverbindung
150 mg des Natriumsalzes von n-Heptylcephalosporin und 70 mg Thioharnstoff wurden in 5 ml H2O in der Dunkelheit bei 370 C während 3 Tagen incubiert. Diese Lösung hatte sich am Ende dieser Zeit völlig verfestigt und wurde mit H2O verrieben und das gallertige Material abfiltriert, mit H2O gewaschen und im Vakuum-Exsiccator getrocknet, wobei sich 124 mg eines amorphen Pulvers ergaben.

1. U.V.: Schulter bei 258-265 my, jedoch ist die Probe nicht rein
2. Chromatographie: Propanol/H,O RF = 0,770
Essigsäureäthylacetat/Puffer RF = 0,102
3. Elektrophorese: bei pH 4,0 und 7,0 keine Bewegung
In gleicher Weise wurden verschiedene andere Acylderivate des Cephalosporin-thiouroniumderivates hergestellt. Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen IV und IVa aufgeführt.

Tabelle IV Beispiel Acylgruppe R-Benzyl-Ceph.Wert Elektrophorese
B. E. W. At. Ac. pH 4,0 pH 7,0 47 S-Phenyl-thioacetyl 0,88 0,16 C,H,-S-CH,CO- 48 S-Benzyl-thioacetyl 0,92 0,29 -0,11 -0,14 CssH5-CH2-S . CH2CO- 49 Benzoyl 0,80 0,09 50 2,6-Dimethoxybenzoyl 0,88 - -0,17 (Propanol
Wasser
System)
Tabelle IVa Beispiel Acylgruppe U.V.-Werte max. (m E1iO0!m 51 p-Bromphenylthioacetyl 256-257 290 nicht voll gelöst 52 p-tert.-Butylphenylthioacetyl 245 380 p-(CH3)8. C. C6H4 S. CH2CO- Ebene 53 ss-Benzylthiopropionyl 261-262 200
C6H5CH2.S.CH2.CH2.CO- 54 Phenäthylthioacetyl 260 163 C6H5CH2.CH2.S.CH2.CO- 55 n-Butylthioacetyl 260 207 56 Propargylthioacetyl 260 208
CH=C. CH2. S . CH2.

CO- 57 p-Chlorphenylthioacetyl 254-256 326
Beispiele 58-66 (a) Herstellung des Natriumsalzes von
7-Allylthioacetamido-cephalosporansäure
1,9 g 7-Aminocephalosporansäure (7mMol) wurden in 100 ml Essigsäureäthylester suspendiert und mit 2 g (13,3 mMol) Allylthioacetylchlorid behandelt.

Nach 1,25 stündigem Kochen unter Rückfluss wurde die Lösung von einer geringen Menge unlöslichen Materials abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne gebracht. Die hinterbleibende gummiartige Masse wurde in einem Gemisch aus 20 ml Aceton und 20ml Äther gelöst, filtriert und mit einer 10% oigen Lösung von Natriumäthylhexanoat in n-Butanol (15ml) und anschliessend mit Äther (150 ml) behandelt. Der erhaltene cremefarbene Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet (2,34 g). Die Kristallisation aus wässrigem Aceton ergab das Produkt in Form eines weissen kristallinen festen Stoffes (1,13 g), Ämax (Phosphatpuffer bei pH 6) 260 rqu (e = 9080).

Eine weitere Kristallisation ergab ein Material von AmaX (wie oben (260 m, (e = 9300) [a]D + 1170 (c = 0,87; H2O).

Diese Verfahrensweise wurde auch erfolgreich für Acylierungen von 7-Aminocephalosporansäure mit Cyclopentanoylchlorid, p-Bromphenylthio acetylchlorid, n-Butanoylchlorid, p-Nitrophenylacetylchlorid, n Butancarboxychlorid, n-Pentancarboxychlorid, trans Cinnamoylchlorid und ss-Phenylpropionylchlorid verwendet.

b) Die erhaltenen Natriumsalze wurden dann mit Thioharnstoff entsprechend den vorstehenden Beispielen umgesetzt. Die erhaltenen Thiouroniumsalze hatten die folgenden Eigenschaften:
Tabelle V Beispiel Acylgruppe U.V. Daten
H2O E1% # max (m ) 1.cm 58 Cyclopentanoyl 262,5 224 9 000 59 p-Bromphenylthioacetyl 258 283 60 n-Butanoyl 263 207 61 Allylthioacetyl 261 208 8 730 62 p-Nitrophenylacetyl 270 376 17 000
Tabelle V (Fortsetzung) Beispiel Acylgruppe U.V. Daten µ/m e
H2O 1 cm #max. (m ) 63 n-Butancarboxy 263 233 64 n-Pentancarboxy 263 240 65 trans-Cinnamoyl 278 862 CssH5. CH=CH. CO- 66 ss-Phenylpropionyl 259-262 224 Die Elementaranalysen einiger der vorstehenden Verbindungen sind in Tabelle VI aufgeführt.

Tabelle Vl Beispiel Gefunden Berechnet
C H Br Cl N S C H Br C1 N S 47 C17H18N4O4S3H2O 44,3 4,3 - - 12,3 21,8 44,7 4,4 - - 12,3 21,07 48 C18H2ON4O4S3.H2O 45,5 4,7 - - 12,2 20,9 45,9 4,7 - - 11,9 20,4 49 C17H21CIN406S3 . 2H2O 39,8 4,09 - 6,5 10,8 19,4 40,1 4,2 - 7,0 11,0 18,9 50 C15H2ON4O4S2 . H2O 44,1 5,5 - - 14,2 16,1 44,8 5,5 - - 13,9 15,9 51 Ct7H,7Br . N404S3 39,0 3,6 15,6 - 10,9 18,5 39,5 3,4 15,4 - 10,8 18,6 52 C14H20N4O5S3 . H2O 40,4 4,9 - - 13,2 23,1 40,0 4,8 - - 13,3 22,9 53 C15H22N4O4S2 . ¸H2O 45,8 5,9 - - 13,8 15,1 45,6 5,9 - - 14,2 16,2 54 C18H20N4O4S2 .

H2O 49,4 5,5 - - 12,7 14,4 49,3 5,1 - - 12,8 14,6 55 C19H52N4O4S3 .1/21110 48,0 5,0 - - 11,8 20,7 48,0 4,9 - - 11,8 20,23 56 C,4Ht6N404S3 - H2O 39,9 4,4 - - 13,1 22,9 40,2 4,3 - - 13,4 23,0
Die Aktivität von verschiedenen in den vorstehenden Beispielen hergestellten Verbindungen gegenüber unterschiedlichen Stämmen von S. aureus wurde mit dem Rohrverdünnungsversuch festgestellt und mit verwandten Cephalosporinverbindungen verglichen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen VII, VIII und IX zusammengefasst.

Tabelle VII
Minimale
Hemmungskonzentration (g/ml) 5. aureus
C864
Oxford- S. aureus Untersuchte Verbindung Stamm 663 Cephalosporin C 62 62 Cephalosporin-Cthiouroniumsalz 8 Verbindung von Beispiel 10 20 Verbindung von Beispiel 15 - 62 Verbindung von Beispiel 16 - 0,5 Verbindung von Beispiel 17 - 31 Verbindung von Beispiel 18 - 62 Verbindung von Beispiel 19 - 31
Tabelle VIII
Minimale
Hemmungskonzentration (g/ml)
S. aureus
C864
Oxford- S. aureus Untersuchte Verbindung Stamm 663 Benzylcephalosporin 0,16 0,16 Benzficephalosporin- thiouroniumsalz 0,06 0,06 Verbindung von Beispiel 29 0,08 01,04 Verbindung von Beispiel 30 - 0,01 Verbindung von Beispiel 31 0,04 0,04 Verbindung von Beispiel 32 - 0,02 Verbindung von Beispiel 33 - 0,01
Tabelle IX
Minimale
Hemmungskonzentration (glml)
S.

aureus
C864
Oxford- S. aureus Untersuchte Verbindungen Stamm 604 Verbindung von Beispiel 47 0,01 0,08 Verbindung von Beispiel 48 0,02 0,04
Tabelle IX (Fortsetzung)
Minimale
Hemmungskonzentration (ginal)
S. aureus -C864
Oxford- S. aureus Untersuchte Verbindungen Stamm 604 Verbindung von Beispiel 58 31 2,5 Verbindung von Beispiel 59 < 0,01 0,31 Verbindung von Beispiel 60 0,08 0,31 Verbindung von Beispiel 61 0,04 0,15 Verbindung von Beispiel 62 0,01 0,15 Verbindung von Beispiel 63 0,16 0,62 Verbindung von Beispiel 64 0,04 0,16 Verbindung von Beispiel 65 0,5 2,0 Verbindung von Beispiel 66 0,08 0,16 Verbindung von Beispiel 52 0,05 0,62 Verbindung von Beispiel 53 0,01 0,16 Verbindung von Beispiel 54 0,08 0,62 Verbindung von Beispiel 55 0,02 0,16 Verbindung von Beispiel 56 0,04 0,08 Verbindung von Beispiel 57 0,02 0,08 Verbindung von

Beispiel 9 0,06 0,30 Verbindung von Beispiel 39 0,04 0,31 Verbindung von Beispiel 40 0,31 2,5 Verbindung von Beispiel 31 0,04 0,31

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von neuen Cephalospoç rinderivaten der Formel EMI18.1 worin A einen über das S-Atorn gebundenen Rest eines a) Thioharnstoffs oder substituierten Thioharnstoffes, b) aromatischen oder aliphatischen Thioamides oder c) eines Thiols, R2 und R5 jeweils Wasserstoffatome oder R2 ein Wasserstoffatom und R3 eine Acylgruppe oder eine mit Triaryl substituierte Alkylgruppe bedeuten, oder worin R2 und R3 zusammen einen zweiwertigen Acylrest bilden, dadurch gekennzelchnet, das man eine Verbindung der Formel EMI19.1 worin R ein Acylrest ist,

in einem inerten polaren Medium bei pH 5 bis 8 mit einem Rest A abgebenden Mittel umsetzt.

UNTERANSPkÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung verwendet wird, welche die Formel EMI19.2 besitzt, worin R4, R5, R6 und R7 die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome oder gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Alkenyl-, Aryl- oder Aralkylgruppen bedeuten, oder worin R und R6 zusammen eine Alkylengruppe bilden.

2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Äthylenthioharnstoff, Phenylthioharnstoff oder N,N'-Diphenylthiaharnstoff verwendet werden.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel ein Thioacetamid oder ein Thiosemicarbazid verwendet wird.

4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel ein mit einem Amin substituiertes Thiol verwendet wird.

5. Verfahren nach Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass 2-Aminoäthanthiol, 2-Anu.üo-2-methyipropan-1-thiol, -Dirnethylamino- propan-l-thiol oder 2-Piperidinoäthan-1 -thidi verwen- det wird.

6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel aromatische, alicyclische oder stickstoffhaltige heterocyclische Verbindungen, die eine Thiol- oder Thiongruppe enthalten, und weiterhin im Fall von alicyclischen oder aromatischen Verbindungen eine Elektrónen-anziehende Gruppe oder eine basische Gruppe enthalten, verwendet werden.

7. Verfahren nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen verwendet werden, die als elektronenanziehende Gruppe eine Nitro-, Nitroso-, Carbonyl-, Carboxyl-, Cyan- oder Trifinor- methylgruppe enthalten.

8. Verfahren nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen verwendet werden, welche als basische Gruppe eine Aminogruppe oder eine substituierte Aminogruppe enthalten.

9. Verfahren nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine aromatische Verbindung mit einer Thiolgruppe verwendet wird, wobei die Elektro- nen-anziehende Gruppe oder die basische Gruppe in Konjugation mit der Thiolgruppe steht.

10. Verfahren nach Unteranspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Thiol ein gegebenenfalls im Benzolkern substituiertes Thiophenol, z. B. o-Nitr & hiophenol, o,p-Dinitrothiophenol, o-Aminothiophenol oder p-Aminothiophenol, verwendet wird.

11. Verfahren nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine heterocyclische Verbindung mit einer Thiolgruppe, die an dem auf das heterocyclische Stickstoffatom anstossenden Kohlenstoffatom gebunden ist, verwendet wird.

12. Verfahren nach Unteranspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass 2-Mercaptothiazolin, 2-Mercaptohydantoin, 1-Methyl-2-mercapto-imidazol, 2-Mercaptoimidazol, 2-Mercaptohenzimidazoi, 2-Mercapto-benz- thiazol, 2-Mercapto-benzoxazol oder 2-Mercapto-pyridin verwendet wird.

13. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung der Reaktionsteilnehmer in einer Lösung bei einer Temperatur zwischen 15 und 700 C durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Unteranspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur zwischen 37 und 70" C durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Unteranspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur von etwa 370 C während eines Zeitraumes zwischen 48 und 72 Stunden durchgeführt wird.

16. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion unter Verwendung von 1-10 molaren Äquivalenten des den Rest A abge benden Mittels je molares Äquivalent der Verbindung der Formel II durchgeführt wird.

17. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einem pH-Wert zwischen 6 und 7 durchgeführt wird.

18. Verfahren nach Patentanswtich, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Pufferung geregelt wird.

19. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als polares Medium Wasser verwendet wird.

20. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als polares Medium ein Gemisch im Verhältnis von 30:70 (v/v) von Wasser-Dimethylformamid oder Wasser/Äthanol verwendet wird.

21. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als polares Medium ein Gemisch im Verhältnis 50:50 (v/v) von Wasser/Dimethylformamid oder Wasser/Aceton verwendet wird.

22. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das polare Medium aus einem nicht-wässrigen polaren Lösungsmittel besteht.

23. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsprodukt aus dem Reaktionsgemisch durch Ionophorese, Papierchromatographie oder Chromatographie auf einem Ionenaustauschharz abgetrennt wird.

24. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsprodukt aus dem Reaktionsgemisch durch fraktionierte Kristallisierung abgetrennt wird.

25. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel II in der Form eines Alkalisalzes verwendet wird.

26. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen der Formel II verwendet werden, in denen Rt eine niedere Alkanoylgruppe bedeutet.

27. Verfahren nach Unteranspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen verwendet werden, in denen R eine Acetylgruppe bedeutet.

28. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen verwendet werden, in welchen R5 eine Acylgruppe der Formel R (CH2)n - bedeutet, worin R' einen Aryl-, Cycloalkyl-, substituierten Aryl- oder substituierten Cycloalkylrest und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten.

29. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen verwendet werden, in denen R3 eine Acylgruppe der Formel CnH2n+1C darstellt, worin n eine ganze Zahl zwischen 2 und 7 bedeutet und die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigtkettig und gegebenenfalls durch ein Sauerstoffoder Schwefelatom unterbrochen sein kann.

30. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen verwendet werden, in welchen R eine Acylgruppe der Formel CnH2n-1CO - darstellt, worin n eine ganze Zahl zwischen 2 und 7 bedeutet, wobei die Alkenylgruppe geradkettig oder verzweigtkettig und gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom unterbrochen sein kann.

31. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen verwendet werden, worin R9 eine Acylgruppe der Formel Co darstellt, worin R' die in Anspruch 30 angegebene Bedeutung besitzt und R" und R"', die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome oder Alkylgruppen bedeuten.

32. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen verwendet werden, in welchen R eine Acylgruppe der Formel R'CR"R' "'. CO- darstellt.

33. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen verwendet werden, in welchen R3 eine Acylgruppe der Formel R-'CO- darstellt.

34. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen verwendet werden, in welchen R3 eine Acylgruppe der Formel RCfl2 )rnS(CH2)nCRR111 .C 0 , darstellt, worin m eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 und n die Zahl 0 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 bedeuten.

35. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel II Cephalosporin C verwendet wird.

36. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel II Ben zylcephalosporin verwendet wird.

37. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel II die 7-Aminocephalosporansäure verwendet wird.

38. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel II Allylthioacetylcephalosporin verwendet wird.

39. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man im Reaktionsprodukt eine 7-Acylgruppe hydrolysiert oder umacyliert.