CH551949A

CH551949A - Procede pour la preparation des polypeptides.

Info

Publication number: CH551949A
Application number: CH1712872A
Authority: CH
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1972-11-23
Filing date: 1972-11-24
Publication date: 1974-07-31
Also published as: BE791783A

Description

Cette invention est orientée vers des nouvelles protéines ou des nouveaux polypeptides de poids moléculaires intermédiaires entre ceux de l'insuline et du glucagon, ainsi que vers leur procédé de préparation.

La protéine actuelle, extraite habituellement du pancréas de bovins, est représentée (en utilisant les abréviations de nomenclature normales pour les polypeptides: voir 67 JACS 1524, 1530) par la formule Nn2-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Gln-Tyr-Pro-Gly-Asp.Asp-Ala-
6 12 Thr-Pro.Glu-Gln-Mét-Ala.Gln-Tyr-Ala.Ala-Glu-Leu.Arg.

18 24 25
EMI1.1

Comme il est entendu dans la technique des polypeptides naturels, toutes les parties amino-acides sont de la forme isomère optique lévogyre.

Le polypeptide correspondant provenant du pancréas de porcins est identique à celui qui est représenté ci-dessus, si ce n'est que, en position 6, là où le polypeptide de bovins présente une glutamine, le polypeptide de porcins présente une valine. De même, le polypeptide d'origine ovine diffère de celui d'origine bovine en ce qu'il présente une sérine, en position 2, là où le polypeptide d'origine bovine présente une proline; et le polypeptide d'origine humaine diffère du polypeptide d'origine bovine en ce qu'il présente une asparagine en un point que l'on pense être en position 23, mais qui est peut-être la position 15, là où le polypeptide d'origine bovine présente une glutamine, en plus d'une différence représentée par le remplacement d'une glutamine par une valine en position 6 comme dans la substance d'origine porcine.

Ces différences spécifiques mineures sont bien connues dans la technique des extraits glandulaires: les substances présentent des comportements chimiques et pharmacologiques similaires et, à l'utilisation, on peut substituer l'une à l'autre, ou bien on peut utiliser un mélange.

Ainsi, sous une forme de représentation, la protéine obtenue par le procédé selon l'invention a la constitution suivante: NH2-Ala-X-Leu-Glu-Pro-Y-Tyr-Pro -Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-
6 12 13 Pro-Z-Gln-Mèt-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Z'-Leu-Arg-Arg-Tyr-
24 25
EMI1.2
où, dans les modes de réalisation particuliers, X, Y, Z et Z' ont ces significations
Protéine X Y Z Z'
Bovine Pro Gln Glu Glu
Porcine Pro Val Glu Glu
Ovine Sér Gln Glu Glu
Humaine Pro Val Glu Asn ou
Pro Val Asn Glu
Le procédé selon l'invention de production de ladite protéine consiste à broyer la glande pancréatique d'un animal jusqu'à obtention d'un état d'émulsion approximatif dans un solvant non miscible à l'eau; à mettre ladite glande en contact d'alcool aqueux acidifié jusqu'à un pH d'environ 2,8; à séparer les substances tissulaires insolubles par filtration;

à ajuster la solution à un pH de 8 à 8,5 en ajoutant un hydroxyde de métal alcalin; à séparer, à ce pH, de la préparation concentrée résultante une partie des graisses et le phosphate d'ammonium par précipitation; à ajuster jusqu'à un pH d'environ 5,2 à l'aide d'un acide; à diluer cette solution par un mélange de diéthyléther et d'éthanol; puis à laisser ce mélange au repos pendant 12h ou plus pour faire précipiter et recueillir lesdits polypeptides.

Le produit du procédé selon cette invention est présent à des concentrations faibles dans l'insuline cristallisée du commerce; il est présent à des concentrations plus élevées dans l'extrait pancréatique brut obtenu dans la séparation de l'insuline, et connu dans la technique sous le nom de gâteau salin . Le produit est présent dans la liqueur mère du procédé de cristallisation alcaline de l'insuline, et en a été extrait. Il peut également être extrait du pancréas lui-même, et d'extraits liquides bruts de pancréas.

Pour préparer le produit par le procédé de cette invention, on peut partir de préférence de pancréas entier soigneusement disséqué du corps d'un animal fraîchement tué, par exemple en vue de la production de viande. La glande est rincée et immédiatement mise au réfrigérateur. Si elle doit être conservée plus longtemps qu'une durée minimale elle doit être maintenue à l'état congelé. La quantité de glande utilisée n'est pas essentielle mais pour obtenir un rendement convenable de 30-50 milligrammes de produit, il est nécessaire d'en avoir environ 10 kilogrammes.

Toutes les opérations subséquentes décrites ci-après sont effectuées
avec élégance, dans les conditions d'hygiène, et avec l'asepsie nécessaire, à 4" C 40C+0,50. Les solvants et substances similaires sont introduits à la température indiquée.

On broie finement la glande jusqu'à un état d'émulsion
approximatif, et on met la glande broyée en contact avec de
l'alcool aqueux acidifié jusqu'à un pH d'environ 2,8. On agite la suspension résultante et ensuite on élimine les substances tissulaires insolubles par filtration. La fraction intéressante est dans la solution. Pour obtenir le pH nécessaire, on peut utiliser l'acide phosphorique, L'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique ainsi
que d'autres acides. De même, bien que l'méthanol soit le solvant de choix, on peut utiliser d'autres solvants organiques miscibles à l'eau, parmi lesquels l'acétone, d'autres cétones solubles dans l'eau, I'acétaldéhyde, d'autres aldéhydes solubles dans l'eau, etc.

On ajuste la solution acide, exempte de tissu, à pH 8-8,5 en ajoutant judicieusement l'hydroxyde de métal alcalin ou, de préférence, de l'ammoniaque aqueux. A ce pH, il précipite de la préparation concentrée résultante certains corps gras et du phosphate d'ammonium. On sépare la solution soit par décantation, soit par filtration, soit par les deux procédés.

On ajuste ensuite le pH de la solution résultante à une valeur d'environ 5,2 avec, par exemple, L'acide acétique. Ensuite on dilue cette solution avec un mélange de quatre volumes de diéthyléther et de deux volumes d'éthanol. On laisse reposer le mélange pendant une nuit ou bien une durée équivalente ou plus longue, et après ce temps presque toutes les protéines, y compris le présent produit, précipitent. On centrifuge la suspension partielle résultante et on récupère le précipité. On élimine l'eau du précipité sous vide, on le lave à l'éther pour éliminer les corps gras résiduaires s'il y en a, et ensuite on chasse l'éther résiduaire sous vide. A ce moment-là on reprend le produit séché par l'acide acétique molaire.

Diverses protéines se dissolvent dans le milieu acide; on chromatographie alors la solution sur une colonne de Séphadex G-50 (fine), la séparation se faisant approximativement selon la masse moléculaire.

Le glucagon a une masse moléculaire d'approximativement 3500. La nouvelle protéine a une masse moléculaire d'approximativement 4200 - 4231 dans une détermination de la forme bovine - tandis que l'insuline a une masse moléculaire d'approximativement 5800.

En outre, le glucagon contient un fragment tryptophane, qui confère à la molécule la capacité d'être sorbée quelque peu sur
Séphadex. Pour cette raison, la séparation sur Séphadex du glucagon et de la nouvelle protéine est un peu meilleure que ce qu'on attendrait en fonction de la masse moléculaire seule. C'est pourquoi on préfère la présente séparation sur Séphadex.

Par ce procédé, la présente protéine et quelques autres se séparent d'une matière d'aucun intérêt ici. On peut étudier l'élut par absorption ultraviolette, tout pic d'élution de protéine étant mis en évidence par une forte absorption à 276280 millimicrons.

Remarquant l'existence d'un tel maximum d'absorption, on change le moyen utilisé pour recueillir des substances, et, facultativement, on change après avoir observé le début d'un autre maximum d'absorption. Dans un autre mode opératoire, on change le moyen utilisé pour recueillir les substances en fonction de la durée, et l'observation visuelle ou un graphique par rapport à la durée indiquent quels sont les divers échantillons recueillis qui ont un intérêt. La fraction contenant la présente protéine contient habituellement aussi de l'insuline et du glucagon.

Dans un mode de réalisation préféré, on lyophilise ensuite le
mélange pour obtenir une substance sèche. On reprend alors cette
substance sèche dans un tampon de tris(hydroxyméthyl)amino
méthane 0,01 M, d'éthylènediaminetétraacétate tétrasodique
0,001 M et d'urée 7 M, le pH (initialement égal à environ 11)
de la solution résultante étant ajusté à environ 9,0 à l'aide de HCI.

Lorsque la substance sèche a été totalement dissoute dans
une quantité minimale suffisante de tampon, on chromatographie
la solution résultante sur une colonne de diéthylaminoéthyl
cellulose, en utilisant d'autres portions de la même solution
tampon comme éluant.

Dans cette élution, des traces de substances indésirables sans
intérêt ici sont tout d'abord éluées, puis le glucagon. Après le
glucagon, la protéine de cette invention est nettement éluée.

Dans le mode de réalisation préféré décrit ici, I'insuline demeure
fixée dans la colonne chromatographique. Si on le désire, on peut
l'éluer à l'aide de solutions salines plus concentrées, mais ceci
ne fait pas partie de l'invention.

Ensuite on chromatographie l'élut dans la solution tampon
sur une colonne de Séphadex G-25 (grossiers avec une solution
aqueuse d'acide acétique à 2% comme éluant. Dans cette étape
on sépare presque complètement les constituants des tampons
non aqueux. On lyophilise de nouveau la solution résultante; le
produit séché restant à la fin de la lyophilisation est la protéine
de l'invention.

L'exécution élégante des différentes étapes détaillées ici conduit
avec certitude au produit. Cependant, on peut ultérieurement le
caractériser rapidement si on le désire, de la manière suivante.

Une première étape de caractérisation préférée est l'analyse
de l'aminoacide terminal en N. On fait réagir une partie du
produit d'une manière connue avec le chlorure de 1-diméthyl-
aminonaphtalène-5-sulfonyle: ce composé forme un produit d'addi
tion terminale en N. On hydrolyse le produit d'addition, ce qui
sépare l'aminoacide terminal sous forme dudit produit d'addition.

On partage ensuite celui-ci par chromatographie en couche mince
et on recherche en lumière ultraviolette une tache fluorescente
unique du produit d'addition du chlorure de l-diméthylamino
naphtalène-5-sulfonyle et de l'alanine.

Lorsque les résultats de cette expérience sont satisfaisants,
on examine le produit par électrophorèse sur gel et disque de
polyacrylamide dans un tampon de tris-borate en partant d'une
concentration en produit égal à 0,1%. Après deux heures sous
un courant d'électrophorèse constant de 2 milliampères, on colore
le gel avec du Bleu Brillant Coomassie à une concentration d'en
viron 0,025% dans une solution aqueuse d'acide trichloracétique
à 10%. Cette expérience devrait avoir pour résultat une zone
bleue unique d'intensité importante, représentant la seule pré
sente protéine.

Si cette expérience donne des résultats satisfaisants, on peut, si on le désire, soumettre l'échantillon à une analyse partielle ou totale de la séquence d'aminoacides.

Le produit isolé, sec, est une substance cristalline blanche qui se décompose à la chaleur avant que l'on puisse déterminer sa température de fusion nette. L'analyse a une série d'étapes soustractives (Edman) qui conduit à la formule développée attribuée ci-dessus.

Le produit a divers effets biologiques. Il augmente la mobilité de l'intestin, provoque la constriction du canal cholédoque et le relâchement de la vésicule biliaire.

Il est utile comme laxatif vétérinaire ne nécessitant pas d'ingestion orale. Utilisé dans ce but, il est administré de toute manière connue par laquelle le polypeptide non dénaturé entre dans la circulation sanguine. L'administration de la substance entraîne l'expulsion involontaire du contenu du côlon. Lorsqu'on désire obtenir des effets rapides, on administre le composé par voie intraveineuse. Lorsqu'on désire un effet plus prolongé, à démarrage plus lent, on l'administre par voie sous-cutanée dans une région bien alimentée à circulation périphérique et sous forme d'un composé retard d'où il est lentement mobilisé par la circulation sanguine.

On ajuste les doses posologiques en fonction des espèces animales, de l'importance de la réponse désirée et d'autres facteurs qu'on a l'habitude de prendre en considération dans la détermination des doses posologiques. A titre d'indication, on peut dire que les propriétés du produit de cette invention se sont bien manifestées chez des chiens auxquels on a fait des injections intraveineuses de 5 à 50 microgrammes par kilogramme de poids corporel. Des doses aussi faibles que 0,5 microgramme par kilogramme sont également efficaces.

Claims

REVENDICATION

Procédé de production de polypeptides de formule: NH2-Ala-X-Leu-Glu-Pro-Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr 1 6 12 13 Pro-Z-Gln.Mét-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Z'-Leu-Arg-Arg-Tyr- 18 24 25 EMI2.1 qui satisfait au moins à l'une des définitions suivantes: X= Pro, Y= Gln, Z= Glu, Z'=Glu,ou X = Pro, Y = Val, Z = Glu, Z' = Glu, ou X= Sér, Y= Gln, Z= Glu, Z' = Glu, ou X = Pro, Y = Val, Z = Glu, Z' = Asn, ou X = Pro, Y = Val, Z = Asn, Z' = Glu caractérisé en ce qu'il consiste à broyer la glande pancréatique d'un animal jusqu'à ce qu'elle soit à l'état presque émulsionné dans un solvant non miscible à l'eau, à mettre ladite glande en contact avec une solution aqueuse d'alcool acidifié à un pH d'environ 2,8, à séparer les substances tissulaires insolubles par filtration,

à ajuster le pH de la solution à une valeur de 8 à 8,5 en ajoutant un hydroxyde de métal alcalin, à séparer à ce pH, de la préparation concentrée résultante, certains corps gras et du phosphate d'ammonium par précipitation, à ajuster un pH d'environ 5,2 avec un acide, à diluer cette solution avec un mélange de diéthyléther et d'éthanol, puis à laisser reposer ce mélange pendant une durée de 12 heures ou plus pour faire précipiter et récupérer lesdits polypeptides.

SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé de production de polypeptides selon la revendication, caractérisé en ce que le polypeptide a la formule suivante: NH2-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Gln-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr 1 6 12 13 Pro-Glu-Gln-Mét-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Glu-Leu-Arg-Arg- 18 24 25 EMI3.1 2. Procédé de production de polypeptides selon la revendication, caractérisé en ce que le polypeptide a la formule suivante: NH2-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr- 1 6 12 13 Pro-Glu-Gln-Mét-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Glu-Leu-Arg-Arg- 18 24 25 EMI3.2