CH557330A

CH557330A - Verfahren zur herstellung von cystin-haltigen peptiden oder ihren derivaten.

Info

Publication number: CH557330A
Application number: CH995971A
Authority: CH
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1971-07-07
Filing date: 1971-07-07
Publication date: 1974-12-31
Also published as: CS179386B2; HU169664B

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Cystinhaltigen Peptiden.

Cystin kann auf zwei Arten in Peptide oder Proteine eingebaut sein: in cyclischen Cystinpeptiden bildet die Disulfidbrücke des Cystins mit dem Rückgrat der Peptidkette (oder einem Teil davon) einen Ring; in offenkettigen Cystinpeptiden verknüpft sie zwei sonst voneinander getrennte Ketten. Beispiele von in der Natur vorkommenden cyclischen Cystinpeptiden sind Oxytocin, Vasopressin, Wachstumshormon, Calcitonin, Proinsulin. Offenkettige Cystinpeptide sind z.B. oxidiertes Glutathion, Igsulin.

Die vorliegende Erfindung betrifft vor allem die Herstellung von offenkettigen asymmetrischen Cystinpeptiden, d.h. von Peptiden, in welchen zwei verschiedenartige Peptidketten durch eine Cystinbrücke miteinander verbunden sind. Bei dem Verfahren wird die in den Ausgangsmaterialien vorliegende Aminosäurekonfiguration nicht verändert.

Nach bekannten Verfahren können Cystinpeptide hergestellt werden, indem man in den zwei zu verbindenden, Cysteinreste enthaltenden Aminosäuresequenzen, in welchen die Mercaptogruppen geschützt sind, beispielsweise durch Carbobenzoxy- oder Benzylgruppen oder durch die Tritylgruppe, die Mercapto-Schutzgruppe abspaltet, Benzyl beispielsweise mit Natrium in flüssigem Ammoniak, Trityl z.B. mittels Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff oder mit 10-n. Salzsäure, und dann die beiden, die freien Mercaptogruppen enthaltenden Peptide zum Disulfid oxidiert, beispielsweise mit 1.2-Dijodäthan oder mit Sauerstoff (Luft). Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass neben dem gewünschten gemischten Cystinpeptid jeweils auch die zwei symmetrischen Cystinpeptide gebildet werden.

Es sind auch Verfahren bekannt, bei welchen das gemischte Disulfid gezielt gebildet wird. So kann die Thiolseitenkette des Cysteins einer der zu verbindenden Komponenten in die S-Sulfonsäure (Buntesalz) übergeführt und diese mit der zweiten Komponente (mit der Cysteinkette als freies Thiol) unter Bildung des gemischten Disulfides umgesetzt werden. In einem anderen Verfahren wird das Thiol des Cysteins der einen Kette zuerst in das S-Thiocyanat übergeführt und dieses mit der zweiten Cysteinkette umgesetzt. Bei einem weiteren Verfahren werden Cystinmonosulfoxid-Derivate mit Cysteinderivaten umgesetzt.

Die Durchführung dieser Verfahren ist aufwendig und bei empfindlichen Peptiden führen sie zu Nebenreaktionen und beeinträchtigen dementsprechend die Ausbeute.

Es ist bekannt. dass bei der Umsetzung von Sulfenylthiocarbonaten mit Thiolen gemischte Disulfide gebildet werden [J. Amer. Chem. Soc. 92, 7629 (1971)].

Es wurde nun gefunden, dass Cystein bzw. Cysteinpeptide oder deren Derivate, in denen die Mercaptogruppe durch eine Trityl- oder Acylamidomethylgruppe geschützt ist, mit Sulfenylhalogeniden der Formel I Hal-S-CO-OR3, worin Hal für ein Halogenatom und R3 für einen gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoffrest steht, zu entsprechenden Verbindungen, in denen die Mercaptogruppe durch eine Thiocarbonatgruppe substituiert ist, umgesetzt werden können, ohne dass eine vorherige Abspaltung der Mercaptoschutzgruppen erforderlich ist. Diese Reaktion kann durch folgendes Formelschema veranschaulicht werden:
R-S-Trt oder + Hal-S-CO-OR3+ R-S-S-CO-OR3
R-S-Acylm Trt bedeutet die Tritylgruppe (Triphenylmethyl). Acylm steht für eine Acylamidomethylgruppe, beispielsweise eine Gruppe, wie sie im Schweizer Patent Nr. 517705 beschrieben ist.

Acylamidomethyl ist z.B. eine Gruppe der Formel -CH2-NH-CO-R4, worin CO-R4 den Acylrest einer Carbonsäure, wie einer aliphatischen, aromatischen, araliphatischen oder heterocyclischen Carbonsäure oder eines Kohlensäurederivates, wie einen Kohlensäureester- oder Carbaminsäurerest bedeutet. In erster Linie ist R4 ein gegebenenfalls substituierter Niederalkylrest, z.B. Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl oder tert.Butylrest, der als Substituenten z.B. Halogenatome wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, Trifluormethyl oder die Nitrogruppe enthalten kann. Weiter ist R4 beispielsweise ein gegebenenfalls substituierter Cycloalkylrest mit 3-8, vorzugsweise 5-6.

Ringatomen wie der Cyclopentyl- oder Cyclohexylrest oder ein gegebenenfalls substituierter aromatischer oder araliphatischer Rest, worin der aromatische Ring vorzugsweise der Benzolring ist, vor allem gegebenenfalls substituiertes Phenyl oder Benzyl, z.B. unsubstituiertes oder im Phenylrest durch Niederalkyl. Niederalkoxy, Halogen oder Nitro substituiertes Phenyl oder Benzyl, oder ein gegebenenfalls wie erwähnt substituierter, vorzugsweise monocyclischer Heterocyclylrest, z.B.

Thienyl- oder Furylrest. Hal bedeutet ein Halogenatom wie Fluor, Brom, in erster Linie Chlor. R stellt den Rest des Cysteins bzw. eines Cysteinpeptids oder eines Derivates davon dar; die Konfiguration dieser Verbindungen ist D; D, L oder vor allem L.

R3 steht für einen gegebenenfalls substituierten Kohlenwasser stoffrest. wie in der deutschen Offenlegungsschrift 1 568632 beschrieben, z.B. für unsubstituiertes oder durch Halogenatome oder Niederalkoxygruppen substituiertes Alkyl mit 1-18, vorzugsweise
1-6 Kohlenstoffatomen wie Methyl, Äthyl, Propyl. n-Butyl, n-Octyl, n-Octadecyl, 2-Chloräthyl, 2-Methoxyäthyl, Cycloalkyl wie Cyclopentyl oder Cyclohexyl, Aralkyl, besonders Phenylniederalkyl, wie Benzyl oder 2-Phenyläthyl.

Weiter wurde gefunden, dass ein durch die Gruppe -S :COOR3 substituiertes Cystein bzw. Cysteinpeptid oder Derivat davon mit Cystein bzw. einem cysteinhaltigen Peptid oder einem Derivat davon, wobei die Mercaptogruppe dieser zweiten Cysteinkomponente in freier Form vorliegt, zur entsprechenden Cystinverbindung umsetzt werden kann. Es ist nicht notwendig, dass die -SCOOR3-Gruppe unmittelbar vor der weiteren Umsetzung mit der zweiten Cysteinkomponente in die erste Cysteinkomponente (S-Trityl- oder S-Acylamidomethyl-geschützt), eingeführt wird. Sie kann vielmehr auf einer frühern Stufe der Peptidsynthese durch die beschriebene Reaktion in diese geschützten Cysteinderivate eingeführt werden. Zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese kann eine -SCOOR3-geschützte Cysteinverbindung zu weiteren Peptidaufbauschritten verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Cystinpeptiden oder ihren Derivaten, bei dem man Cystein sowie die weiteren zu ihrem Aufbau notwendigen Aminosäuren bzw. deren Derivate in beliebiger zeitlicher Reihenfolge unter Bildung der Peptidbindungen miteinander kondensiert, wobei die von dieser Reaktion auszuschliesseden reaktiven Gruppen intermediär geschützt werden, und das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die SH-Gruppe des Cysteins mit einer Trityl- oder Acylamidomethylgruppe schützt und auf beliebiger Stufe der Synthese a) die so geschützte SH-Gruppe durch Umsetzung mit einem Sulfenylhalogenid der Formel I, Hal-S-CO-OR3, worin Hal für ein Halogenatom und R3 für einen gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoffrest steht, in eine SCOOR3 Gruppe umwandelt und diese b) mit Cystein,

einem Cysteinpeptid oder einem Derivat davon mit freier SH-Gruppe reagieren lässt.

Das Verfahren hat den Vorteil, dass mit Trityl oder Acylamidomethyl geschütztes Cystein bzw. Cysteinpeptide oder Derivate davon selektiv in ein Cystinpeptid übergeführt werden können, ohne dass die Mercaptoschutzgruppe zuvor abgespalten werden muss und dass keine störenden Nebenprodukte, z.B. Säuren, gebildet werden.

Unter Derivaten von Cystein bzw. Cysteinpeptiden oder auch Cystinpeptiden werden hier entsprechende Verbindungen verstanden, die noch weitere für die Synthese erforderliche Schutzgruppen enthalten können.

Als Aminoschutzgruppen sind beispielsweise zu nennen Benzyl, Trifluormethyl, Phthyloyl, p-Toluolsulfonyl, oder vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls im aromatischen Rest durch Halogenatome, Niederalkyl- oder Niederalkoxy- oder Niedercarbalkoxygruppen substituierte Carbobenzoxygruppen, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p'-Methoxy-phenylazo)benzyloxycarbonyl, Tolyloxycarbonyl, 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-Tolyl-isopropyloxycarbonyl- und vor allem 2-p (Biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl (vgl. franz. Patent-Nr. 1554051), ferner aliphatische Oxycarbonylgruppen wie z.B. Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert. Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und in erster Linie tert. Butyloxycarbonyl.

Die Reaktion kann auch durchgeführt werden, wenn die Aminogruppen als Salze, z.B. als Hydrochloride vorliegen.

Die Carboxylgruppen können z.B. durch Amidierung oder Veresterung geschützt sein. Als Ester sind z.B. diejenigen von Methanol, Äthanol, Benzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, 2,4,5-Trichlorphenol, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, oder vor allem von tert. Butanol oder Silanol, z.B.

Trimethylsilanol zu nennen. Hydroxygruppen, z.B. von Serinoder Tyrosinresten, können z.B. durch Verätherung, beispielsweise mit Benzylalkohol oder vorzugsweise mit tert. Butanol geschützt sein. In Argininresten kann die Guanidinogruppe beispielsweise durch die Tosylgruppe geschützt sein. Die bei dem vorliegenden Verfahren erhaltenen, Schutzgruppen aufweisenden Disulfid Peptide können direkt für die Synthese von Peptiden mit längerer Aminosäurekette verwendet werden oder, wenn erwünscht, können die Schutzgruppen in bekannter Weise, z.B. durch Hydrolyse oder Hydrogenolyse abgespalten werden.

Bei der Herstellung des Sulfenylthiocarbonat-Derivates können beispielsweise folgende Lösungsmittel verwendet werden: Kohlenwasserstoffe wie Petroläther, Hexan, Benzol, Toluol; chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Chloroform, Dichlor äthan; Alkohole wie Methanol, Äthanol, Äther wie Diäthyläther und Tetrahydrofuran. Die Zugabe eines Acceptors für den bei der Reaktion entstehenden Halogenwasserstoff, z.B. Triäthylamin, ist nur nötig, wenn stark säurelabile Gruppen im Peptidderivat dies erfordern. Die Umsetzung findet bei Temperaturen von ca.

-20 bis + 60"C statt, wird aber vorzugsweise bei 0 C durchgeführt.

Bei der Umsetzung des Sulfenylthiocarbonat-Derivates mit der Thiolkomponente können nebst den oben erwähnten Lösungsmitteln auch Eisessig sowie wässerige Essigsäure verwendet werden.

Die Umsetzung kann bei den genannten Temperaturen, vorzugsweise Raumtemperatur, durchgeführt werden.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. Die Rf-Werte beziehen sich auf Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-Platten.

Folgende Abkürzungen werden verwendet: tBu = tert. Butyl BOC = tert. Butyloxycarbonyl Trt = Trityl Bpoc = 2-(p-Biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl Acm = Acetylaminomethyl SCM = Methoxycarbonylsulfenyl (-S-CO-OCH3) Me =CH3.

DCHA = Dicyclohexylammoniumsalz.

Die Beispiele zeigen die Herstellung von geschützten Fragmenten von Insulin im Bereich der Disulfidbrücke A20-B19.

Beispiel 1:
BOC-Cys-Asn-OtBu
BOC-Val-Cys-Gly-Glu(OtBu)2
1.) BOC-Cys(SCM)-Asn-OtBu a) aus BOC-Cys(Trt)-Asn-OtBu.

Zu 700 mg Cl-S-CO-OCH3 in 2 ml CHC13 werden bei 0 C 3,2 g BOC-CysTrt)-Asn-OtBu in 15 ml CHC13 und 5 ml MeOH gegeben. Nach 45 Minuten bei 0- C werden 150 ml CHCl3 zugegeben und die Lösung mit Wasser extrahiert. Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird im Wasserstrahlvakuum eingedampft. Das dabei anfallende Öl ist ein Gemisch von BOC-Cys(SCM)-Asn-OtBu und Triphenylmethyl-methyl äther. Letzterer braucht nicht abgetrennt zu werden, da er in der folgenden Umsetzung zu keinen Nebenreaktionen Anlass gibt.

b) aus BOC-Cys(Acm)-Asn-OtBu
700 mg Cl- S-CO-OCH3 und 2,32 g BOC-Cys(Acm) Asn-OtBu werden wie unter a) beschrieben umgesetzt und analog aufgearbeitet. Es resultieren 2,4 g dünnschichtchromatographisch reines BOC-Cys(SCM)-Asn-OtBu. Rf= 0.4 in Chloroform Methanol (9:1).

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
585 mg BOC-Cys(Acm)-OH und 377 mg H-Asn-OtBu werden in 10 ml Essigester und 5 ml Dimethylformamid bei 0 C mit 452 mg Dicylohexylcarbodiimid versetzt und 24 Stunden bei dieser Temperatur reagieren gelassen. Es wird abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit l-n. Zitronensäure, I-n. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Kristallisation aus Essigester und n-Hexan liefert BOC-Cys(Acm)-Asn-OtBu vom F. 97-100 C.
EMI2.1

1,45 g BOC-Cys(SCMWAsn-OtBu und 1,85 g BOC-Val-Cys Gly-Glu(OtBu)2 werden in 30 ml CHC13-MeOH (1:1) gelöst und 45 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Die Lösung wird dann im Wasserstrahlvakuum bei 35"C eingedampft und der resultirende Schaum zweimal mit je 5 ml Petroläther verrieben. Es werden 3,0 g dünnschichtchromatographisch reines Produkt der obigen Formel als farbloses Pulver erhalten. Rf= 0,47 in Chloroform-Methanol (9:1).

Das als Ausgangsmaterial verwendete BOC-Val-Cys-Gly Glu(OtBu)2 kann wie folgt hergestellt werden:
Zu 1,72 g BOC-Val-Cys(Trt)-Gly-Glu(OtBu)2 in 20 ml Essigester und 10 ml Methanol werden 700 mg Quecksilber (II)acetat gegeben und 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Durch die klare Lösung wird dann während 15 Minuten ein Strom von H2S geleitet, vom ausgeschiedenen Quecksilbersulfid abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der resultierende Schaum besteht aus BOC-Val-Cys-Gly-Glu(OtBu)2 [Rf= 0,55 in Chloroform-Methanol (1:1)] und Triphenylmethyläther. Letzterer stört bei der folgenden Umsetzung nicht.

Beispiel 2:
EMI2.2

1. H-Cys(SCM)-Asn-OtBu.HCI a) aus H-CysTrt)-Asn-OtBu-HCl.

Zu 670 mg Cl-S-CO-OCH3 in 10 ml Methanol werden bei 0 C 1,82 g H-Cys(Trt)-Asn-OtBu.HCI in 15 ml Methanol gegeben. Nach 45 Minuten bei 0 C fällt man mit 250 ml Äther aus, dekantiert ab und trocknet den Rückstand im Wasserstrahlvakuum bei 35 C. Es resultieren 1,2 g dünnschichtchromatographisch reines H-Cys(SCM)-Asn-OtBu.HCI als gelbliches Pulver.

Rf= 0,32 in Chloroform-Methanol (8:2).

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
7,76 g Trt-Cys(Trt)-Asn-OtBu werden in 60 ml Eisessig und 15 ml Wasser eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen.

Es werden dann 45 ml Wasser zugegeben, vom ausgeschiedenen Triphenylcarbinol abfiltriert und das Filtrat bei 40"C und 0,01 Torr. eingedampft. Der Rückstand wird in 200 ml Essigester aufgenommen und die Lösung mit l-n. Bicarbonat und Wasser extrahiert. Die Essigesterphase wird über Natriumsulfat getrocknet, im Wasserstrahlvakuum auf ca. 30 ml eingeengt, mit 10 ml l-n.

HCI in Essigester versetzt und dann vollständig zur Trockne eingedampft. Es resultieren 5,7 g dünnschichtchromatographisch reines H-Cys-(Trt)-Asn-OtBu.HC1 Rf= 0,55 in Chloroform Methanol (8:2).

b) aus H-Cys(Acm)-Asn-OtBu.HCI aus 1,6 g H-Cys(Acm)-Asn-OtBu.HCI und 790 mg Cl-S-CO OCH3 werden wie unter a) beschrieben 1,5 g H-Cys(SCM) Asn-OtBu.HC1 erhalten.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: x Trt-Cys-(Acm)-OH
Zu einer Lösung von 2,3 g H-Cys(Acm)-OH und 2,8 ml Triäthylamin in 50 ml Dimethylformamid werden 4,2 g Tritylchlorid in 20 ml Dimethylformamid gegeben und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wird dann auf ca. 10 ml eingeengt, in 100 ml Essigester und 50 ml Wasser aufgenommen und mit l-n. Zitronensäure auf pH 3 gestellt. Die Essigesterphase wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Kristallisation aus Chloroform-Petroläther gibt Trt-Cys(Acm)-OH vom F. 143-145"C.

ss Trt-Cys(Acm)-Asn-OtBu
2,17 g Trt-Cys(Acm)-OH und 0,9 g H-Asn-OtBu werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst und bei 00C mit 1,1 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 15 Stunden bei 5O C wird abfiltriert, das Filtrat bei 35"C und 0,01 Torr. eingedampft, der Rückstand in 200 ml Essigester aufgenommen und mit halb gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und das erhaltene Produkt aus Essigester Hexan umgelöst. Rf= 0,25 in Chloroform-Methanol (49: 1).

y H-Cys(Acm)-Asn-OtBu.HCI
2,5 g Trt-Cys(Acm)-Asn-OtBu werden in 25 ml 80%iger Essigsäure wie unter 1 .a) beschrieben, detrityliert und aufgearbeitet.

Es resultieren 1,85 g reines H-Cys(Acm)-Asn-OtBu.HCl.

Rf=0,30 in Chloroform-Methanol (8:2).
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1,25 g H-Cys(SCM)-Asn-OtBu.HCl und 1,56 g BOC-Cys Gly-Glu(OtBu)2 werden in 30 ml Chloroform-Methanol (1:1) eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die klare Lösung wird dann bei 35"C im Wasserstrahlvakuum eingedampft und der Rückstand zweimal mit je 5 ml Petroläther verrieben. Man erhält das dünnschichtchromatographisch reine Produkt als farbloses Pulver. Ausbeute 2,45 g. Rf= 0,50 in Chloroform Methanol (8:2).

Das Produkt kann beispielsweise wie folgt zur Peptidsynthese verwendet werden:
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Zu 620 mg BOC-Tyr-OH in 10 ml Tetrahydrofuran gibt man bei -15 C 2,2 ml l-n. Triäthylamin in Tetrahydrofuran und 2,2 ml l-n. Isobutylchlorocarbonat in Tetrahydrofuran. Nach 10 Minuten bei -10 C werden 1,69 g.
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und 0,28 ml Triäthylamin in 15 ml Tetrahydrofuran zugegeben und 1 Stunde bei -10 C und 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Lösung wird abfiltriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in 200 ml Essigester aufgenommen und mit 0,1-n. Zitronensaüre, 0,1-n.

Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und der Rückstand aus Essigester-Hexan umgefällt. Es resultieren 1,9 g reines Produkt der obigen Formel. Rf= 0,46 in Chloroform-Methanol (9:1).

Beispiel 3:
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0,83 g H-Cys(SCM)-Asn-OtBu.HCI und 1 ,7 g Bpoc-Leu Val-Cys-Gly-Glu(OtBu)2 werden in 20 ml Chloroform Methanol (1:1) gelöst und die Lösung nach 1 Stunde bei 20 C eingedampft. Der Rückstand wird aus Methanol-Äther umgefällt.

Rf= 0,45 in Chloroform-Methanol (8:2).

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: a) Bpoc-Leu-Val-OMe
36,9 g Bpoc-Leu-OH und 13,9 ml Triäthylamin in 300 ml Acetonitril werden bei -10 C mit 13,3 ml Isobutylchlorocarbonat versetzt. Nach 10 Minuten bei -10"C gibt man 16,8 g HCl.H-Val OMe und 13,9 ml Triäthylamin in 170 ml Acetonitril zu und lässt
1 Stunde bei -10 C und 10 Stunden bei Raumtemperatur stehen.

Es wird dann abfiltriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen, die Lösung mit verdünnter Zitronen säure,0,5-n. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen . Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und der Rückstand aus Essigester-Hexan umgefällt. Rf= 0,45 in Essigester-Hexan (1:1).

b) Bpoc-Leu-Val-OH
39 g Bpoc-Leu-Val-OMe werden in 400 ml Dioxan gelöst,
100 ml Wasser und 130 ml l-n. NaOH zugegeben und 1 Stunde bei 200 C stehen gelassen. Im Rotationsverdampfer dampft man dann bei 300 C das Dioxan weitgehend ab, gibt je 300 ml Eiswasser und Chloroform hinzu und versetzt unter Rühren bei 0 C mit 130 ml l-n. HCI. Die Chloroformlösung wird abgetrennt und dreimal mit halb gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat und Abdampfen des Lösungsmittels erhält man Bpoc-Leu-Val-OH in dünnschichtchromatographisch reiner Form. Rf= 0,40 in Chloroform-Methanol (7:3).

c) Bpoc-Leu-Val-Cys(Trt)-Gly-Glu(OtBu)2
Zu 4,5 g Bpoc-Leu-Val-OH und 6,6 g H-Cys(Trt)-Gly Glu(OtBu)2 in 100 ml Dimethylformamid gibt man bei 0 C 2,47 g Dicyclohexylcarbodiimid und 1,6 g l-Hydroxybenzotriazol.

Nach 1 Stunde bei 0 C und 15 Stunden bei 200 C filtriert man und dampft das Filtrat bei 40"C und 0,01 Torr. ein. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und mit 0,5-n. Zitronensäure, 0,5-n. Bicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und der Rückstand aus Essigester-Hexan umgefällt. Rf= 0,55 in Chloroform-Methanol (19:1).

d) Bpoc-Leu-Val-Cys-Gly-Glu(OtBu)2
Zu 2,2 g Bpoc-Leu-Val-Cys(Trt)-Gly-Glu(OtBu)2 in 15 ml Essigester und 7 ml Methanol gibt man 0,7 g Quecksilber (II)-acetat und lässt 4 Stunden bei 20"C stehen. Man leitet dann während 15 Minuten einen Strom von Schwefelwasserstoff durch, filtriert und dampft das Filtrat ein.

Das Produkt kann wie folgt zur Synthese von
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verwendet werden:
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Zu 340 mg BOC-Tyr-OH in 5 ml absolutem Tetrahydrofuran werden bei -10 C 1,3 ml l-n. Triäthylamin in Tetrahydrofuran und 1,3 ml l-n. lsobutylchlorocarbonat in Tetrahydrofuran gegeben. Nach 15 Minuten bei -10 C versetzt man mit
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und 1,0 ml 1 -n. Triäthylamin/Tetrahydrofuran in 15 ml Tetrahydrofuran.

Nach 1 Stunde bei 100 C und 15 Stunden bei 20"C filtriert man ab,
7)
BOC-Val-Gln(OtBu)-Ala-Lt
0,46 g BOC-Val-Glu(OtBu)-Ala-Leu-Tyr-NH-NHz in 5 ml Dimethylformamid versetzt man bei -10"C mit 0,75 ml 2-n. HCI in Essigester und 0,72 ml l-n. tert. Butylinitrit in Essigester. Nach 15 Minuten bei -10 C gibt man die Lösung von 0,60 g des unter P) beschriebenen Produktes und 2 ml l-n. Tri äthylamin/Essigester in 7 ml Dimethylformamid zu. Nach 1 Stunde bei-00C und 15 Stunden bei 20"C tropft man die Lösung zu 100 ml gerührtem Wasser, filtriert ab und reinigt den Niederschlag durch Umfällen aus Methanol-Äther.

Rf= 0,35 in Chloroform-Methanol (8:2).

Beispiel 4:
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1.) Trt-Leu-Val-Cys(SCM)-Gly-OH
Eine Lösung von 4,3 g Trt-Leu-Val-Cys(Trt)-Gly-OH undO,515mlDiäthylamin in 35 ml Chloroformund 15 ml Methanol wird bei -10 C mit 0,88 ml Cl-S-CO-OCH3 versetzt. Nach 15 Min. bei -100C werden 0,6 ml Diäthylamin zugegeben, die Kühlung entfernt und nach 5 Minuten mit 150 ml Chloroform verdünnt. Die Lösung wird mit verdünnter Citronensäure und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und dann auf ca, 10 ml eingeengt. Durch Zugabe von Petroläther wird das Trt Leu-Val-Cys(SCM)-Gly-OH ausgefällt. Es wird aus Chloroform Petroläther umkristallisiert; F. 195-200 C (Zersetzung).

Das als Ausgangsmaterial verwendete Trt-Leu-Val-Cys(Trt) Gly-OH kann wie folgt hergestellt werden:
Trt-Cys(Trt)-Gly-OMe
56,24 g Trt-CysCrt)-OSu und 8,01 g Gly-OMe werden in 150 ml Chloroform gelöst. Nach 15 Stunden bei 20"C wird die Lösung eingedampft, der Rückstand in 500 ml Essigester aufgenommen und diese Lösung mit verdünnter Citronensäure und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand durch Umfällen aus Essigester-n-Hexan gereinigt. Rf= 0,70 in Chloroform Methanol (95:5).

H-Cys(Trt)-Gly-OMe
Eine Lösung von 6,8 g Trt-Cys(Trt)-Gly-OMe in 75 ml Methanol wird tropfenweise mit 7,5 ml Wasser und 5,1 ml 2,1-n. Salzsäure versetzt. Nach einer Stunde bei 20"C wird die Lösung auf ca. 20 ml eingedampft, in 150 ml Essigester aufgenommen und mit 0,5-n. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird eingedampft und der Rückstand mit 20 ml Petroläther verrieben. Es resultiert ein dünnschichtchromatographisch einheitliches Öl.

Rf= 0,50 in Chloroform-Methanol (96:5).

Trt-Leu-Val-Cys(Trt)-Gly-OMe
4,72 g Trt-Leu-Val-OH und 4,35 g H-Cys(Trt)-Gly-OMe in 50 ml Chloroform werden mit 0,4 g l-Hydroxybenzotriazol dampft das Filtrat ein und löst den Rückstand aus Chloroform Äther um. Rf= 0,35 in Chloroform-Methanol (9:1).
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1,5 g des unter a) beschriebenen Produktes werden in 12 ml Eisessig und 3 ml aufgenommen und 1 Stunde bei 45"C gehalten.

Man gibt dann 10 ml Eisessig zu und lyophilisiert. Das resultierende Pulver wird zweimal mit je 5 ml Petroläther verrieben. Rf= 0,40 in Chloroform-Methanol (8:2).
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und 2,26 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 15 Stunden bei 20 C filtriert man ab, verdünnt das Filtrat mit 50 ml Chloroform und wäscht die Lösung mit verdünnter Citronensäure, 0,5-n. Natriumbicarbonat und Wasser. Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird eingedampft und der Rückstand in 30 ml Chloroform-Methanol (1:1) unter Erwärmen gelöst. Nach Zugabe von einigen Tropfen Äther kristallisiert das Produkt aus.

F. 252-254 C.

Trt-Leu-Val-Cys(Trt)-Gly-OH
7,12 g Trt-Leu-Val-Cys(Trt)-Gly-OMe werden in 80 ml Dioxan unter Erwärmen gelöst. Bei 20"C tropft man dann 4,5 ml 2-n. Natronlauge und 10 ml Wasser zu. Nach 50 Minuten bei 200 C engt man die Lösung auf ca. 30 ml ein und versetzt unter Rühren bei 0 C mit 20 ml l-n. Citronensäure und 100 ml Wasser. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxyd und Ätznatron getrocknet. Es resultiert ein dünnschichtchromatographisch reines, weisses Pulver. Rf= 0,60 in Chloroform-Methanol (1:1).
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710 mg Trt-Leu-Val-Cys(SCM)-Gly-OH und 330 mg HCl.H-Cys-Asn-OtBu werden in 5 ml Chloroform und 5 ml Methanol gelöst. Nach einer Stunde bei 20"C wird die Lösung eingedampft und der Rückstand bei 0 C mit 10 ml Wasser verrieben und abfiltriert. Man erhält das dünnschichtchromatographisch reine Produkt als farbloses Pulver. Rf1oo = 0,3.
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210 mg BOC-Tyr-OH, 87 mg N-Hydroxysuccinimid und 0,094 ml N-Äthylmorpholin in 3 ml Dimethylformamid werden bei -10 C mit 155 mg N-Äthylmorpholin versetzt. Nach 2 Stunden bei 200 C werden 680 mg
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in 7 ml Dimethylformamid zugegeben und 15 Stunden bei 20"C stehen gelassen. Man filtriert ab und dampft das Filtrat bei 0,01 Torr und 35"C ein. Umfällen des Rückstandes aus Chloro- form-n-Hexan liefert das dünnschichtchromatographisch reine unter 3.) genannte Produkt. Rf= 0,40 in Chloroform-Methanol (7:3).

Das unter 2.) verwendete Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: H-CysTrt)-Asn-OtBu, HC1
7,76 g Trt-Cys(Trt)-Asn-OtBu werden in 60 ml Eisessig gelöst und tropfenweise 15 ml Wasser zugegeben. Nach einer Stunde bei 20 C gibt man 45 ml Wasser zu, filtriert und dampft das Filtrat ein. Der Rückstand wird in 150 ml Essigester auf genommen und die Lösung mit 0,5-n. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel abgedampft, der Rückstand in 10 ml Essigester gelöst und bei 0 C mit 5 ml 2-n. Chlorwasserstoffin Essigester und 150 ml Petroläther versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Petroläther nachgewaschen. Es resultiert ein dünnschichtchromatographisch einheitliches weisses Pulver. Rf= 0,50 in Chloroform-Methanol (8:2).

H-Cys-Asn-OtBu, HCI 11,10 g H-Cys(Trt)-Asn-OtBu, HCI werden in 80 ml Methanol und 80 ml Essigester gelöst und mit 7,3 g Quecksilber(II)-acetat versetzt. Nach 4 Stunden bei 20 C leitet man während 15 Minuten einen Strom von Schwefelwasserstoff durch die Lösung, filtriert und dampft das Filtrat ein. Der Rückstand wird dreimal mit je 20 ml Petroläther verrieben, das unlösliche zähe Öl in 20 ml Chloroform gelöst und durch Zugabe von 110 ml Petroläther das Produkt als weisses Pulver ausgefällt. Rf= 0,35 in Chloroform-Methanol (1:1).

Beispiel 5:
BOC-Cys(SCM)-Asn-OtBu
634 mg BOC-Cys(Trt)-Asn-OtBu in 6 ml Chloroform und 3 ml Methanol werden bei 0 C mit 0,18 ml Cl-S-CO-OCH3 versetzt. Nach einer Stunde bei 0CC werden 2,5 ml l-n. Diäthylamin zugegeben und mit verdünnter Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird nach dem Trocknen über Natriumsulfat eingeengt und mit Petroläther versetzt. Der Niederschlag BOC-Cys(SCM)-Asn-OtBu wird aus Chloroform Petroläther kristallisiert. F. 102-104"C.

Die Verbindung kann in ein Beispiel 1 unter 2) beschrieben in das Cystinpeptid übergeführt werden.

Beispiel 6:
BOC-Cys(SCM)-OH, DCHA
Zu 5,37 g BOC-Cys(Trt)-OH, Diäthylammoniumsalz in 35 ml Chloroform und 9 ml Methanol werden 4,2 ml Triäthylamin gegeben, die Lösung auf 0 C abgekühlt und mit 3,5 ml Cl-S-CO- OCH3 versetzt. Nach einer Stunde bei 0 C wird die Lösung mit verdünnter Citronensäure und Wasser gewaschen, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das resultierende Öl wird zweimal mit Petroläther verrieben, in 10 ml Äther aufgelöst und mit 2,5 ml Dicyclohexylamin versetzt. Es werden Kristalle vom F. 145-146 C erhalten.

Diese Verbindung kann wie folgt in das in Beispiel 5 beschriebene Produkt übergeführt werden:
725 mg BOC-Cys(SCM)-OH.DCHA werden in 30 ml Chloroform mit verdünnter Citronensäure und Wasser versetzt, die organische Phase wird abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem Öl eingedampft. Dieses wird in 10 ml Essigester aufgenommen und bei 0 C mit 190 mg H-Asn-OtBu und 226 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 15 Stunden bei 5"C wird abfiltriert, das Filtrat mit 30 ml Essigester verdünnt und die Lösung mit verdünnter Citronensäure, 0,5-n. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen.

Nach Trocknen der Essigesterlösung über
Natriumsulfat und Abdampfen des Lösungsmittels liefert Um kristallisation aus Chloroform-Petroläther das in Beispiel 5 be schriebene Produkt, das in das im Beispiel 1 unter 2.) beschriebene
Cystinpeptid übergeführt werden kann.

Claims

PATENTANSPRUCH:

Verfahren zur Herstellung von Cystinpeptiden oder ihren Derivaten, indem man Cystein sowie die weiteren zu ihrem Aufbau notwendigen Aminosäuren bzw. deren Derivate in beliebiger zeit licher Reihenfolge unter Bildung der Peptidbindungen miteinander kondensiert, wobei die von dieser Reaktion auszuschliessenden reaktiven Gruppen intermediär geschützt werden, dadurch gekenn zeichnet, dass man die SH-Gruppe des Cysteins mit einer Trityl oder Acylamidomethylgruppe schützt und auf beliebiger Stufe der Synthese a) die so geschützte SH-Gruppe durch Umsetzung mit einem Sulfenylhalogenid der Formel I, Hal-S-CO-OR3, worin Hal für ein Halogenatom und R3 für einen gebebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoffrest steht, in eine SCOOR3-Gruppe umwandelt und diese b) mit Cystein, einem Cysteinpeptid oder einem Derivat davon mit freier SH-Gruppe reagieren lässt.

UNTERANSPRÜCHE: 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die SH-Gruppe des Cysteins mit einer Niederalkanoyl amidomethylgruppe schützt.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die SH-Gruppe des Cysteins mit einer Benzoylamido methylgruppe schützt.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die SH-Gruppe des Cysteins mit einer Acetamidomethyl gruppe schützt.

4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die SH-Gruppe des Cysteins mit einer Tritylgruppe schützt.

4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die SH-Gruppe des Cysteins mit einer Tritylgruppe schützt.

5. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unter ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man mit einem Sulfenylhalogenid der Formel I umsetzt, worin Hal ein Chloratom bedeutet.

6. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unteransprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man mit einem Sulfenylhalogenid der Formel I umsetzt, worin R3 für einen Niederalkylrest steht.

7. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unter ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man mit Methoxy carbonylsulfenylchlorid umsetzt.

Anmerkung des Eidg. Amtes für geistiges Eigentum: Sollten Teile der Beschreibung mit der im Patentanspruch gegebenen Definition der Erfindung nicht in Einklang stehen, so sei daran erinnert, dass gemäss Art. 51 des Patentgesetzes der Patentanspruch für den sachlichen Geltungsbereich des Patentes massgebend ist.