CH575956A5

CH575956A5 -

Info

Publication number: CH575956A5
Application number: CH1751972A
Authority: CH
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1972-12-01
Filing date: 1972-12-01
Publication date: 1976-05-31

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur halbsynthetischen Herstellung von Vincristin.

Das Vinblastin und das Vincristin, die zytostatischen Alkaloide von Vinca rosea L. (Catharantus roseus G. Don), sind seit ungefähr 10 Jahren bekannt und haben sich in der klinischen Erfahrung als die stärksten Chemotherapeutika gegen Krebs erwiesen. Vor allem die mit Vincristin erreichten Ergebnisse sind beachtenswert, da diese Verbindung z.B. auch bei Leukämie im Kindesalter von lebensrettender Wirkung ist (Haggard, M. E.: Vincristine therapy for acute leukemie in children; Cancer Chemother. Reports, 52, 477/1968).

Es ist bekannt, dass das Vincristin in dem ausserordentlich komplizierten Alkaloidspektrum von Vinca rosea L. nur in verschwindend geringen Mengen vorhanden ist. Aus dem ungefähr 70 verschiedene Alkaloide enthaltenden Gesamtalkaloidgemisch ist kaum ein Zehntel Prozent Vincristin herstellbar, was auf den Ausgangsstoff bezogen 3-5 mg Wirkstoff pro kg getrocknete Pflanzenteile bedeutet. Die Herstellung des Vincristins in diesen Mengen wird durch die in der US-Patentschrift Nr. 3 205 220 sowie die in der ungarischen Patentschrift Nr. 160 967, Verfahren zur selektiven Gewinnung von Vinblastin, Vinleurosin, Vincristin und ihrer Salze , beschriebenen Verfahren ermöglicht.

Im Hinblick auf den unermesslichen pharmazeutischen Wert des Vincristins ist es verständlich, dass im Interesse seiner billigeren Herstellung in grösseren Mengen auf der ganzen Welt bedeutende Forschungen durchgeführt werden.

Es ist bekannt, dass das gemeinsame Zerfallsprodukt von Vinblastin und Vincristin, das N-Desmethylvinblastin, durch Formylierung mittels bekannter Methoden zu Vincristin umgesetzt werden kann (US-Patentschrift Nr. 3 354 163). In der Beschreibung wird erwähnt, dass das Vinblastin in bekannter Weise durch ein biologisches Oxydationsverfahren mit Peroxydase-Enzym in Gegenwart von Wasserstoffperoxid zu Desmethylvinblastin oxydiert werden kann, welches danach durch eines der bekannten Formylierungsverfahren zu Vincristin umsetzbar ist. In der Beschreibung wird jedoch kein Beispiel angeführt und bezüglich der biologischen Oxydation des Vinblastins und deren Ausbeute ein weiterer Hinweis nicht gegeben.

Bei eigenen, zur Oxydation des Vinblastins durchgeführten Experimenten wurde überraschenderweise gefunden, dass bei der mit Chromsäure oder einem ihrer Salze bei niedriger Temperatur vorgenommenen Oxydation des Vinblastins oder eines seiner Säureadditionssalze, vorteilhaft des Sulfates, die N Methylgruppe des Vinblastins unmittelbar zu einer Formylgruppe umgesetzt werden kann.

Diese selektive Oxydation steht in Widerspruch zu den bisherigen Kenntnissen (US-Patentschrift Nr. 3 354 163) und war für den Fachmann nicht zu erwarten, weil das Vinblastinmolekül mehrere empfindliche Gruppen enthält, die wesentlich leichter oxydierbar sind als die erwähnte N-Methylgruppe.

Die Erfindung ist also ein Verfahren zur halbsynthetischen Herstellung von Vincristin und kann dadurch gekennzeichnet werden, dass das Vinblastin oder eines seiner Salze, vorzugsweise das Sulfat, bei niedriger Temperatur mit Chromsäure oder einem ihrer Salze oxydiert, aus dem neutralisierten oder alkalisch gemachten Reaktionsgemisch das Produkt extrahiert, das Extrakt zur Trockne eingedampft, gegebenenfalls formyliert, aus dem trockenen Rückstand das Vincristin und gegebenenfalls das N-Desmethylvinblastin isoliert und aus dem isolierten Produkt bzw. den isolierten Produkten gegebenenfalls ein Salz, zweckmässig das Sulfat, gebildet wird. Gegebenenfalls wird das erhaltene Salz bzw. werden die erhaltenen Salze umkristallisiert.

Im Sinne der Erfindung wird so vorgegangen, dass das Vinblastin oder eines seiner Salze, zweckmässig das Sulfat, in einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, vorzugsweise in einem Gemisch von Eisessig und Aceton, gelöst, die Lösung auf unter 0OC, zweckmässig auf - 30 bis 900C, gekühlt und die Lösung bei dieser Temperatur unter intensivem Rühren und Kühlen mit gekühlter Chromsäure bzw. einer mit einem organischen Lösungsmittel, zweckmässig mit Essigsäureanhydrid bereiteten Lösung eines Salzes der Chromsäure versetzt und das Reaktionsgemisch bis zu 15 Minuten, vorzugsweise 8 Minuten, stehen gelassen wird.

Danach wird mit Ammoniak, der auf - 40 bis -500C gekühlt ist, bis zu pH 8-9 vorsichtig alkalisch gemacht, mit Wasser verdünnt und mit einem organischen Lösungsmittel, zweckmässig mit Methylenchlorid, in mehreren Schritten bis zur Abwesenheit von Alkaloid extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, anschliessend getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Die amorphe, rohe Vinblastinbase, die als Verunreinigung N Desmethylvinblastin enthält, wird chromatographisch gereinigt. Die chromatographische Reinigung wird auf einer mit Benzol getränktes Aluminiumoxyd enthaltenden Säule vorgenommen. Das rohe Vincristin wird in Benzol gelöst und auf die Säule aufgebracht. Eluiert wird zuerst mit einem Benzol Chloroform-Gemisch im Verhältnis 2: 1, dann im Verhältnis 1 : 1. Die einzelnen Fraktionen werden mittels Papier- bzw.

Dünnschichtchromatographie identifiziert, die das Vincristin bzw. das N-Desmethylvinblastin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Das Vincristin bzw. das N-Desmethylvinblastin wird gegebenenfalls zu einem Salz, vorzugsweise zum Sulfat, umgesetzt und gewünschtenfalls durch Umkristallisation gereinigt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens wird so vorgegangen, dass der nach der Oxydation durch Aufarbeitung des Oxydationsgemisches gewonnene rohe Vincristin-Trockenrückstand mit einem Gemisch aus Ameisensäure und Essigsäureanhydrid formyliert wird. Der trockene Rückstand der Formylierungsreaktion, der auch das N-Desmethylvinblastin in Form von Vincristin enthält, wird aus dem Reaktionsgemisch durch dessen Neutralisierung, Extraktion mit Methylenchlorid, Waschen und Eindampfen unter vermindertem Druck gewonnen und mittels Chromatographie gereinigt. Das Vincristin wird gewünschtenfalls zu einem Salz, vorzugsweise zum Sulfat, umgesetzt und gewünschtenfalls durch Umkristallisieren gereinigt.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Beispiel 1
10 g (0,011 Mol) Vinblastinsulfat werden in 2200 ml Azeton gelöst, 500 ml Eisessig zugesetzt und die Lösung auf - 60 C gekühlt. Gleichzeitig werden 4,96 g (0,0494 Mol) Chromsäure in 1860 ml Essigsäureanhydrid gelöst, die Lösung ebenfalls auf -60oC gekühlt und anschliessend unter Rühren in die Lösung des Vincristinsulfates eingetropft. Nach achtminütigem Rühren werden 4400 ml konzentrierten Ammoniaks, der auf - 40 bis -50OC gekühlt wurde, zugetropft, bis die Lösung einen pH-Wert von 8 hat. Die Temperatur der Lösung darf während des Neutralisierens nicht über + 50"C ansteigen.

Das alkalisch gemachte Reaktionsgemisch wird mit 10 Liter Wasser verdünnt und mit Methylenchlorid bis zur Abwesenheit von Alkaloid extrahiert. Die Methylenchloridphasen werden vereinigt, das bei der Neutralisation entstandene und in die organische Phase übergegangene Ammoniumazetat mit zweimal -3000 ml Wasser ausgewaschen. Danach wird die getrocknete Methylenchloridlösung unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Es werden 8,5 g amorphes, rohes Vincristin erhalten, das als Verunreinigung noch N-Desmethylvinblastin enthält. Das amorphe, rohe Vincristin wird in 30 ml Benzol gelöst und auf einer Säule, die mit Benzol getränktes Aluminiumoxyd enthält, chromatographiert. Zu Beginn wird mit 1300 ml Benzol, danach mit 5500 ml Benzol Chloroform-Gemisch im Verhältnis 2 : 1 und schliesslich mit 4250 ml Benzol-Chloroform-Gemisch im Verhältnis 1: 1 eluiert.

Es werden Fraktionen von je 250 ml aufgefangen. Die einzelnen Fraktionen werden mittels Papier- oder Dünnschichtchromatographie untersucht. Das 2: 1-Benzol-Chloroform-Gemisch löst die als Nebenprodukt der Oxydation entstandene N-Desmethylvinblastin-Verunreinigung heraus, das 1: 1-Gemisch das entstandene Vincristin. Die mittels Papieroder Dünnschichtchromatographie identifizierten, identische Alkaloide enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Auf diese Weise werden 5,9 g amorphes Vincristin bzw. 2,7 g amorphes N-Desmethylvinblastin gewonnen.

Das amorphe N-Desmethylvinblastin wird in 27 ml wasserfreiem Äthanol gelöst und der pH-Wert mit 1 %der äthanolischer Schwefelsäure auf 4 eingestellt, wobei das N-Desmethylvinblastinsulfat kristallin ausfällt. Es werden 2,5 g N Desmethylvinblastinsulfat erhalten. Dies wird in 13 ml Methanol gelöst und der Lösung 60 ml wasserfreies Äthanol zugesetzt. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur eine Stunde stehen gelassen, danach das auskristallisierte N-Desmethylvinblastinsulfat abfiltriert. Ausbeute: 2,2 g (0,0024 Mol) N Desmethylvinblastinsulfat (20%).

Aus einem Teil des N-Desmethylvinblastinsulfats wird die Base freigesetzt und aufgrund folgender Angaben identifiziert: Schmelzpunkt: 212-215 C (Boetius), [a]20 = + 15,80 (c = 1, Chloroform).

Das bei der Oxydation des Vinblastins entstandene N Desmethylvinblastin oder dessen Salz kann in bekannter Weise formyliert werden, wobei Vincristin oder dessen Salz erhalten wird.

Die erhaltenen 5,9 g amorphes Vincristin werden in 60 ml wasserfreiem Äthanol gelöst und mit 1 %iger äthanolischer Schwefelsäure auf pH = 4 angesäuert, wobei das Vincristinsulfat kristallin ausfällt. Es werden 5,6 g Vincristinsulfat erhalten. Diese werden in 30 ml Methanol gelöst und der Lösung
120 ml wasserfreies Äthanol zugesetzt. Die Lösung wird bei
Zimmertemperatur eine Stunde stehen gelassen und dann das auskristallisierte Vincristinsulfat abfiltriert. Ausbeute: 5,2 g (0,0055 Mol) Vincristinsulfat (50%).

[a]20 = + 11-120 (c = 1, Wasser) Rf = 0,30 (erscheint mit lebhaft blauer Farbe)
Das Produkt wird durch sein IR-Spektrum identifiziert, das mit dem des Vinblastins verglichen, bei 5,94 11 eine starke
Absorptionsbande aufweist.

Die dünnschichtchromatögraphischen Untersuchungen wurden mit Aluminiumoxyd der Marke G. Merck durchge führt. Eluiert wurde mit 0,5 So Methanol enthaltendem Chloro form, zum Entwickeln wurde konzentrierte Phosphorsäure benutzt, die 1 % Cerammoniumsulfat enthält.

Beispiel 2
5 g (0,0055 Mol) Vinblastinsulfat werden in 1100 ml Aze ton gelöst und 250 ml 99,5 %iger Eisessig zugesetzt, welcher über Chromsäure destilliert wurde und der keine oxydierbaren
Substanzen enthält. Die Lösung wird auf - 60"C abgekühlt.

Gleichzeitig werden 2,48 g (0,0297 Mol) Chromsäure in
930 ml Essigsäureanhydrid gelöst, die Lösung ebenfalls auf 60"C gekühlt und unter Rühren der Lösung des Vinblastinsul fats zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 8 Minuten lang gerührt und dann der pH-Wert durch Zugabe von auf - 40 bis - 50'C gekühlten konzentrierten Ammoniak auf 9 eingestellt.

Während der Neutralisation darf die Temperatur der Reak tionsmischung nicht über + 50OC ansteigen. Das alkalisch gemachte Reaktionsgemisch wird mit 5000 ml Wasser verdünnt und mit dreimal 1000 ml Methylenchlorid bis zur Abwesenheit von Alkaloid extrahiert. Die Methylenchloridphasen werden vereinigt und mit zweimal 1500 ml Wasser das beim Neutralisieren entstandene und in die organische Phase übergegangene Ammoniumazetat ausgewaschen. Danach wird die Methylenchloridphase getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einem Gemisch von 75 ml konzentrierter Ameisensäure und 12,5 ml Essigsäureanhydrid gelöst und bei Zimmertemperatur 5 Minuten stehen gelassen. Danach wird die saure Lösung mit Wasser auf das Dreifache ihres Volumens verdünnt und ihr pH-Wert mit konzentriertem Ammoniak unter Kühlung auf 9 eingestellt.

Die Alkaloide werden mit dreimal 100 ml Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridphasen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der trockene Rückstand, der das Vincristin enthält, wird in 20 ml Benzol gelöst und auf einer Säule, die mit Benzol getränktes Aluminiumoxyd der Aktivität IV-V enthält, chromatographiert. Zuerst wird mit 500 ml Benzol, dann mit
1000 ml Benzol-Chloroform-Gemisch 9 : 1, darauf mit 700 ml Benzol-Chloroform-Gemisch im Verhältnis 8,5 1,5, danach mit 2300 ml Gemisch im Verhältnis 8 : 2 und schliesslich mit Benzol-Chloroform-Gemisch 1 1 eluiert. Es werden Fraktionen zu je 250 ml aufgefangen.

Das Benzol und die Benzol Chloroform-Gemische im Verhältnis 9 1 und 8,5 : 1,5 dienen der besseren Trennung der Substanzen auf dem Adsorbens; die ersten alkaloidhaltigen Fraktionen erscheinen beim Eluieren mit der ersten Hälfte des Benzol-Chloroform-Gemisches im Verhältnis 8 : 2. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei auf das Gewicht des bei der Oxydation entstandenen Endproduktes Vincristinsulfat bezogen 5-10 % Nebenprodukt erhalten werden. Die Vincristin enthaltenden Fraktionen werden beim Eluieren mit der zweiten Hälfte des 8 : 2-Benzol-Chloroform Gemisches erhalten, das Herauslösen des Vincristins wird mit dem 1: 1-Benzol-Chloroform-Gemisch beendet. Die mittels Dünnschicht- bzw.

Papierchromatographie identifizierten, vincristinhaltigen Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Es werden 3,8 g trockener Rückstand erhalten, der in 40 ml wasserfreiem Äthanol gelöst und die Lösung mit 1 %iger äthanolischer Schwefelsäure auf pH 4 eingestellt wird. Das Vincristin fällt in Form seines Sulfates aus, wird abgetrennt, in 30 ml Methanol gelöst und die Lösung mit 120 ml wasserfreiem Äthanol versetzt. Das Vincristinsulfat kristallisiert bei einstündigem Stehen aus. Das Produkt wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 3,5 g (0,0039 Mol) Vincristinsulfat (70%). Die physikalischen Konstanten des Vincristinsulfats stimmen mit den im Beispiel 1 genannten überein.

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur halbsynthetischen Herstellung von Vincristin, dadurch gekennzeichnet, dass Vinblastin oder eines seiner Salze bei niedriger Temperatur mit Chromsäure oder einem Salz der Chromsäure oxydiert, das Produkt aus dem neutrali sierten oder alkalisch gemachten Reaktionsgemisch extrahiert, der Extrakt zur Trockne eingedampft und aus dem trockenen Rückstand das Vincristin isoliert und aus dem isolierten Pro dukt gegebenenfalls ein Salz gebildet wird.

UNTERANSPRUCH Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Prozess bei einer Temperatur von -30' bis - 90"C in einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, beispielsweise in einem Gemisch von Azeton-Eisessig im Verhältnis 4 : 1, durchgeführt wird.