Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Peptiden, welche mehr als eine Cystin-Disulfidbindung enthalten, z.B. Insuline, Proinsuline, Wachstumshormone, Ribonuclease, Lysozym, Apamin, Relaxine, Somato medine, Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder Wachstumsfaktor für epidermales Gewebe (EGF), sowie Fragmente oder synthetische Analoge dieser Naturstoffe oder Abkömmlinge davon, z.B. beim Insulin Verbindungen, bestehend aus A- und B-Kette, die durch Peptidketten oder nicht-peptidische Brükken miteinander verknüpft sind.
Bei der synthetischen Herstellung solcher Peptide stellt sich das Problem, die Cystein-haltigen Aminosäuresequenzen so zu oxidieren, dass die Disulfidbindungen zwischen den gewünschten Cysteinresten gebildet werden.
Durch Anwendung der bekannten selektiv abspaltbaren Mercapto-Schutzgruppen konnte das Problem bisher nicht in befriedigender Weise gelöst werden. Alkalisch oder hydrogenolytisch abspaltbare Gruppen sind schon deswegen nicht günstig, weil unter den Abspaltungsbedingungen eine teilweise Zersetzung des Peptids, speziell an der Disulfidbindung, eintritt. Bei den sauer abspaltbaren Schutzgruppen ist eine ausreichende Selektivität schwer zu erreichen. Eine grosse Schwierigkeit besteht auch darin, dass dann, wenn man mittels selektiv abspaltbarer Mercapto-Schutzgruppen die für die erste Disulfidbindung erforderlichen Mercaptogruppen freigesetzt und durch Oxidation daraus die Disulfidbindung gebildet hatte, eine weitere, durch eine andere Schutzgruppe noch geschützte Mercaptogruppe nach Abspaltung der Schutzgruppe mit der Disulfidbindung unter Disproportionierung des Moleküls reagieren kann.
Es wurde nun ein Verfahren gefunden, nach dem Peptide oder Peptidderivate mit mehr als einer Disulfidbindung in überraschender vorteilhafter Weise hergestellt werden können
Das Verfahren beruht auf der selektiven Abspaltbarkeit von Mercapto-Schutzgruppen in Gegenwart von polyhalogenierten Niederalkanolen, besonders 2,2,2-Trifluoräthanol oder 1,1, 1,2,2,2-Hexafluor-2-propanol.
Als Mercaptoschutzgruppen für Cysteinreste sind solche vom Aralkyltypus, z.B. Trityl, und Acylaminomethylgruppen, z.B. Acetylaminomethyl, bekannt. Diese Gruppen können in vorteilhafter Weise mit Jod abgespalten werden, wobei gleichzeitig Oxidation zum Cystinrest eintritt, vgl. die britischen Patente 1 259 017 und 1 329 860. Es wurde nun gefunden, dass man diese beiden Arten von Mercaptoschutzgruppen sehr gut selektiv abspalten kann, wenn man das die beiden Arten von Schutzgruppen enthaltende Cysteinpeptid in den genannten polyhalogenierten Verbindungen, besonders 2,2,2-Trifluor äthanol oder auch 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol, mit Joc behandelt. Dabei werden nur die beiden Aralkyl-geschützten Cysteinreste zum Cystin oxidiert, während die Acylaminomethylschutzgruppe unverändert erhalten bleibt.
Man erhält also ein Peptidderivat mit einer Cystin-S-S-Brücke an der gewünschten Stelle, das noch einen oder zwei Acylaminomethyl-geschützte Cysteinreste enthält. Die zweite Disulfidbindung kann nach Entfernung der polyhalogenierten Verbindung in an sich bekannter Weise, z.B. durch Behandlung mit Jod, hergestellt werden. Man kann aber auch andere bekannte Oxidationsmittel zur Bildung der Disulfidbrücke aus den Acylaminomethyl-geschützten Mercaptogruppen verwenden, z.B.
Phenyljodosoacetat oder Bromate, wie Kaliumbromat. Die Acylaminomethyl-geschützten Mercaptogruppen können auch elektrochemisch, z.B. an einer Gold-, Platin- oder Kohle Anode zum Disulfid oxidiert werden. Weiter kann man die Acylaminomethylgruppe durch Einwirkung von Schwermetallionen, z.B. Quecksilber(II)- oder Silberionen, abspalten und die dabei erhaltenen Mercaptide durch Oxidation, z.B. mit Jod, Kaliumferricyanat oder anderen Oxidationsmitteln, in die Disulfidverbindung überführen. Die Bildung der zweiten Disulfidbrücke braucht nicht unmittelbar anschliessend an die Bildung der ersten Disulfidbrücke (aus den Aralkyl-geschützten Mercaptogruppen) vorgenommen zu werden, sondern kann zu einem beliebigen Zeitpunkt der Peptidsynthese, z.B.
nach Verländerung einer oder beider Aminosäureketten, erfolgen.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher dadurch gekennzeichnet, dass man in einer oder zwei cysteinhaltigen Aminosäuresequenzen, in welchen Disulfidbindungen hergestellt werden sollen, zwei zu verbindende Cysteinreste je einzeln durch eine Mercaptoschutzgruppe Rl vom Aralkyltypus, zwei weitere Cysteinreste je einzeln durch eine Acylaminomethylgruppe R2 schützt, die Schutzgruppen Rl durch Behandlung mit Jod in Gegenwart eines polyhalogenierten Niederalkanols, oder in einem Gemisch davon mit einem Jodlösungsmittel entfernt, wobei gleichzeitig die Disulfidbindung zwischen diesen Cysteinresten, die durch R1 geschützt waren, gebildet wird, und zu einem beliebigen Zeitpunkt, z.B.
nach Fortsetzung der Peptidsynthese mit dem erhaltenen Cystinpeptidderivat nach Entfernung des polyhalogenierten Niederalkanols die zweite Disulfidbrücke bildet.
Das Verfahren hat den Vorteil, dass in einfacher Weise eine gute selektive Oxidation der Cysteingruppen erreicht wird. Die Selektivität zeigt sich darin, dass z.B. S-Trityl-geschützte Cysteinreste mit Jod bei Zimmertemperatur in Gegenwart des erwähnten polyhalogenierten Niederalkanols praktisch momentan (in 10 sec.) in 100%iger Ausbeute in Cystin übergeführt werden, während Acetylaminomethyl-geschützte Cysteinreste unter diesen Umständen gänzlich unverändert bleiben.
Unter Mercapto-Schutzgruppen Rl vom Aralkyltypus sind Gruppen zu verstehen, in denen das mindestens einen Arylrest tragende Kohlenstoffatom an den Schwefel der Mercaptogruppe gebunden ist. Ein Arylrest kann monocyclisch oder bicyclisch (z.B. Naphthyl) sein; vor allem ist er ein unsubstituierter oder substituierter, z.B. durch einen oder mehrere Reste aus der Gruppe von Niederalkyl-, Niederalkoxy und Halogen substituierter, Phenylrest. Der aliphatische Teil des Aralkylrestes ist vor allem ein Niederalkyl- oder Cycloalkylrest mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen. Ausser dem Arylrest enthält Rl z.B.
mindestens noch einen cyclischen Rest, der entweder ein Arylrest wie angegeben oder ein Cycloalkylrest mit 5-7 Kohlenstoffatomen ist. Als Beispiele der Reste Rl sind zu nennen Phenylcyclopentyl, Phenylcyclohexyl(PCH), Phenylcycloheptyl, Thienyl(2)-cycloheptyl, p-Methoxyphenyl-cyclohexyl(MPCH), 1, 1-Diphenyläthyl, 1,1-[Di-(p-Tolyl)]-äthyl, insbesondere aber Triphenylmethyl(Trt).
Unter der Acylaminomethylgruppe R2 ist eine Gruppe der Formel -CH2-NH-CO-R zu verstehen, worin CO-R den Acylrest einer Carbonsäure, wie einer aliphatischen, aromatischen, araliphatischen oder heterocyclischen Carbonsäure oder eines Kohlensäurederivates, wie einen Kohlensäureester- oder Carbaminsäurerest bedeutet. In erster Linie ist R ein gegebenenfalls substituierter Niederalkylrest, z.B. Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl oder tert.Butylrest, der als Substituenten z.B. Halogenatome, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, Trifuormethyl oder die Nitrogruppe enthalten kann.
Weiter ist R beispielsweise ein gegebenenfalls substituierter Cycloalkylrest mit 3-8, vorzugsweise 5-6, Ringatomen, wie der Cyclopentyl- oder Cyclohexylrest oder ein gegebenenfalls substituierter aromatischer oder araliphatischer Rest, worin der aromatische Ring vorzugsweise der Benzolring ist, vor allem gegebenenfalls substituiertes Phenyl oder Benzyl, z.B. unsubstituiertes oder im Phenylrest durch Niederalkyl, Niederalkoxy, Halogen oder Nitro substituiertes Phenyl oder Benzyl, oder ein gegebenenfalls wie erwähnt substituierter, vor allem monocyclischer Heterocyclylrest, z.B. Thienyl- oder Furylrest.
Vorzugsweise stehtR2 für die Acetylaminomethylgruppe (Acm).
Die Behandlung mit Jod zur Abspaltung der Mercapto Schutzgruppe R1 unter gleichzeitiger Oxidation der Cysteingruppen zur Cystingruppe wird erfindungsgemäss, wie bereits erwähnt, in Gegenwart eines polyhalogenierten Niederalkanols oder eines Gemisches davon mit einem Jodlösungsmittel vorgenommen. Das Gemisch soll vorzugsweise mindestens 40 Gew. % des halogenierten Niederalkanols enthalten. Wenn Wasser im Gemisch vorhanden ist, soll dessen Gewichtsanteil höchstens 20% betragen.
Polyhalogenierte Niederalkanole sind solche mit höchstens 5 Kohlenstoffatomen und mindestens 2, vorzugsweise 3, Halogenatomen, wie Brom- oder Chlor-, besonders aber Fluoratomen, beispielsweise 1,1,1 Trifluor-2-propanol, 2,2,2-Trichloräthanol, 1,1,1,3,3,3 -Hexafluor-2-propanol und insbesondere 2,2,2-Trifluoräthanol. Als Jodlösungsmittel sind vor allem halogenierte Kohlenwasserstoffe, besonders chlorierte Niederalkane, wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Tetrachloräthan zu nennen, ferner z.B. Niederalkanole, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Eisessig, Essigester, Dioxan, Acetonitril oder Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid. Die Umsetzung mit Jod erfolgt unter an sich bekannten Reaktionsbedingungen, z.B.
wie im Schweizer Patent Nr. 498 805 beschrieben. Vorzugsweise arbeitet man bei Zimmertemperatur, doch können auch, je nach Art des Peptids, niedrigere oder höhere Temperaturen z.B. von 0 bis 100"C, angewendet werden.
Die Reaktion findet bei saurem pH statt, das durch den bei der Reaktion gebildeten Jodwasserstoff erreicht wird. Wenn erwünscht, kann das pH mittels Puffer auf 4-5 eingestellt werden. Wenn die Reaktion bei einem pH über 4 durchgeführ wird, sollten in der Peptidsequenz gegebenenfalls vorhandene Seitenkettenhydroxylgruppen des Tyrosins geschützt werden, z.B. durch die tert.Butyläthergruppe, um eine Jodierung zu vermeiden.
Zweckmässig wird ein Überschuss an Jod verwendet. Das Jod kann in fester oder gelöster Form mit der Peptidlösung vermischt werden. Aus der erhaltenen Lösung kann das überschüssige Jod beispielsweise durch Extraktion oder z.B. mit Thiosulfat oder Ascorbinsäure entfernt werden, oder man kann aus der Lösung das Peptid ausfällen und abtrennen.
Die Abspaltung der R2-Schutzgruppe unter gleichzeitiger Bildung der zweiten Disulfidbrücke kann in an sich bekannter Weise, z.B. mit Jod, wie im Schweizer Patent Nr. 517 705 beschrieben, vorgenommen werden. Man kann wässrige, wässrig-organische oder organische Lösungsmittel mit Ausnahme von polyhalogenierten Niederalkanolen verwenden, vorteilhaf reine oder wässrige Essigsäure.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren können in den als Ausgangsstoffen verwendeten Aminosäuresequenzen die
Aminogruppen protoniert vorliegen oder durch übliche Ami noschutzgruppen geschützt sein. Auch Hydroxyl- und Carb oxylgruppen können, wenn erwünscht, in geschützter Form vorliegen. Stark säurelabile Aminoschutzgruppen, wie Trityl, werden unter den Reaktionsbedingungen abgespalten.
Wenn beim vorliegenden Verfahren Cystin-haltige geschützte Peptide erhalten werden, können diese direkt für die Synthese von Peptiden mit längerer Aminosäurekette verwendet werden, oder, wenn erwünscht, können die Schutz gruppen in bekannter Weise abgespalten werden.
Als Aminoschutzgruppen sind beispielsweise zu nennen:
Acylgruppen wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, p-Toluolsulfonyl, Benzylsulfonyl, Benzolsulfenyl, o-Nitrophenylsulfenyl, oder vor allem von der Kohlen säure oder Thiokohlensäure sich ableitende Gruppen, wie gegebenenfalls im aromatischen Rest durch Halogen atome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxy oder Niedercarbalkoxygruppen substituierte Carbobenzoxy gruppen, z.B.
Carbobenzoxy, o-Brom, p-Brom oder p-Chlor carbobenzoxy, 2,4-Dichlorcarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy, p-Methoxycarbobenzoxy, farbige Benzyloxycarbonylgruppen, wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonyl, Tolyloxycarbonyl, (a,a-Dimethyl-3 ,5-dimethoxybenzyl)-oxycarbonyl, Benzhydryloxycarbonyl, 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-Tolylisopropyloxycarbonyl und vor allem 2-(para-Biphenylyl)-2-propyloxycarbonyl, ferner aliphatische Oxycarbonylgruppen, wie z.B. 1-Methylcyclobutyloxycarbonyl, Isonicotinyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, und in erster Linie tert.-Butyloxycarbonyl.
Carboxylgruppen können beispielsweise durch Amid- oder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt sein.
Zur Veresterung geeignet sind z.B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole, wie Methanol, Äthanol, Cyanmethylalkohol, Benzoylmethylalkohol oder insbesondere tert.-Butanol, ferner Aralkanole, wie Arylniederalkanole, z.B. gegebenenfalls durch Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Halogenatome substituierte Benzyl- oder Benzhydrylalkohole, wie p-Nitrobenzylalkohol oder 2,4,6-Trimethylbenzylalkohol, oder Phenole und Thiophenole, wie Phenol, Thiophenol, Thiokresol.
Die Hydroxygruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste können z.B. durch Veresterung oder Verätherung geschützt werden. Als Acylreste bei der Veresterung sind z.B. Niederalkanoylreste, wie Acetyl, Aroylreste, wie Benzoyl und vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Reste, wie Benzyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl oder Äthyloxycarbonyl, geeignet. Zur Verätherung geeignete Gruppen sind z.B.
Benzyl-, m-Brombenzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Tetrahydropyranyl- oder tert.Butylreste. Ferner eignen sich zum Schutz der Hydroxylgruppen die in Ber. 100 (1967), 3838-3849 beschriebenen 2,2,2-Trifluor- 1-tert.-butyloxycarbonylamino- oder -1benzyloxycarbonylaminoäthylgruppen (Weygand).
In erster Linie verwendet man acidolytisch, z.B. durch Essigsäure, Trifluoressigsäure, Salzsäure oder Fluorwasserstoff abspaltbare Schutzgruppen, insbesondere Gruppen vom tert. Butyl-Typ, wie die tert.Butyloxycarbonylgruppe, die tert. Butylester- und tert.-Butyläthergruppe. Dabei ist dem Umstand Rechnung zu tragen, dass beim Aufbau der Sequenzen durch Kettenverlängerung am Aminoende die verschiedenen Ketten selektiv gegenüber einander abspaltbare Aminoschutzgruppen tragen müssen, wie dies in der deutschen Offenlegungsschrift 2 346 147 oder dem belgischen Patent 805 147 (Case 4-8418) beschrieben ist.
Wie dort ausgeführt, benötigt man sog. stabile Schutzgruppen als konstant beizubehaltende Gruppen, z.B. zum Schutz von Amino-, Hydroxy- und Carboxylgruppen der Seitenketten und dem Schutz von Endcarboxylgruppen, ferner zwei Arten von sog. labilen Schutzgruppen für die a-Aminogruppen der im Aufbau befindlichen verschiedenen Ketten. Das Verfahren ist in der deutschen Offenlegungsschrift 2 346 147 an einer Teilsequenz des menschlichen Insulins, nämlich A-Kette 14-21 + B-Kette 17-30, die auch in dem in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verfahren zur Herstellung des menschlichen Insulins verwendet wird, illustriert. Dabei werden als Aminoschutzgruppen für die beiden Ketten die 2-(p-Biphenylyl)-2-isopropyloxycarbonyl gruppe und die Tritylgruppe verwendet.
Die Ausgangsstoffe für das Verfahren der vorliegenden
Anmeldung, nämlich cysteinhaltige Aminosäuresequenzen, in denen die Cysteinreste durch Mercaptoschutzgruppen Rt oder R2 geschützt sind, sind bekannt und können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden, vgl. z.B. die Schweizer Patente 498 805 und 517 705, in denen auch die Abspal- tung dieser Schutzgruppen beschrieben ist. Die Cystein-haltigen Aminosäuresequenzen können auch eine oder mehr Cystin-S-S-Brücken, die in einem früheren Zeitpunkt der Synthese auf gleiche oder andere Weise gebildet wurden, enthalten.
Die cysteinhaltigen Ausgangsstoffe sowohl als auch die mittels cystinhaltiger Sequenzen herzustellenden Endprodukte, z.B. Insulin, werden erhalten, indem man die zum Aufbau des Peptids nötigen Aminosäuren unter Bildung von CONH Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende funktionelle Gruppen intermediär geschützt und zu einem belieb;- gen Zeitpunkt die Cysteinreste zu Cystinresten oxidiert werden.
Das Verfahren gemäss der Erfindung kann bei der Synthese beliebiger Cystin-haltiger Peptide oder Peptidderivate verwendet werden. Unter Derivaten sind insbesondere Peptidamide zu verstehen, ferner Peptide oder Peptidamide, in denen funktionelle Gruppen, wie z.B. Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, in bekannter Weise geschützt sind, ferner Verbindungen, die statt einer oder mehrerer der Cystinhälften ss-Mercaptopropionsäurereste (Desaminocystein) aufweisen.
Als Cystin-haltige Peptide sind gemäss dem erfindungsge mässen Verfahren sowohl Peptide zu verstehen, weIche 2 Cystinreste in derselben Kette enthalten, als vor allem auch solche, in welchen die Disulfidbrücke verschiedene Aminosäuresequenzen verbindet, wie es z.B. beim Insulin in bezug auf den Cystinrest der A-Kette (7-Stellung) und der B-Kette (7 Stellung) und der A-Kette (20-Stellung) und der B-Kette (19 Stellung) der Fall ist. Ein Beispiel für das Vorhandensein einer Disulfidbrücke in derselben Kette und einer zweiten Disulfidbrücke in einer anderen Kette wäre die Cystingruppe der Stellungen 6 und 11 der A-Kette des Insulins und die Cystingruppe der Stellung 7 der A-Kette und der Stellung 7 der B Kette.
Acm = Acetylanriuomethyi Trt = Trityl Z = Carbobenzoxy Me = Methyl Bpoc = 2-(p-Biphenylyl) -2-propyloxycarbonyl.
ONp = p-Nitrophenylester OSu = N-Hydroxysuccinimidester DMF = Dimethylformamid.
In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet: System 3: Essigester-Pyridin-Wasser (65:20:15) System 43A: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (67:26:7) System 43C: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (51:21:28) System 43E: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (32:32:36) System 45: sec.
Butanol-3 %iges wässeriges Ammoniak (70:30) System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7,5:21) System 52A: n-Butanol-Eisessig-Wasser (67:10:23) System 70: Äthylacetat-Pyridin-Wasser (40:20:40), Oberphase System 87: Isopropanol-Ameisensäure-Wasser (77:4:19) System 100: Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6:11) System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (38:24:8:30) System 101A: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (42:24:4:30) System 102A:
Essigester-Methyläthylketon-Ameisensäure-Wasser (50:30:10:10) System 107: Äthylacetat-Pyridin-Wasser (49:24:27) System 110: Äthylacetat-n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (42:21:21:6:10) System 112A: n-Butanol-Pyridin-Ameisensäure-Wasser (42:24:4:20) System 115: Äthylacetat-Pyridin-Ameisensäure-Wasser (63:21:10:6).
Die Temperaturen in nachfolgenden Beispielen sind in Celsiusgraden angegeben. Folgende Abkürzungen werden verwendet:
Beispiel 1 H-Cys-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys-Ser(But) Leu-OH
0,47 g H-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile-Cys- (Trt)-Ser(But)-Leu-OH in 15 ml Trifluoräthanol werden innert 10 Minuten zu einem stark gerührten Gemisch von 18 ml mit Jod gesättigtem Methylenchlorid und 180 ml Tri fluoräthanol gegeben. 2 Minuten nach beendetem Eintragen wird eine Lösung von 3,2 g Ascorbinsäure in 60 ml Wasser in 30 ml 1 - m. Ammoniumacetat zugegeben, die Lösung mit verdünntem Ammoniak auf pH 5,6 gebracht und bei vermindertem Druck das Trifluoräthanol grösstenteils entfernt. Das Gemisch wird dann in 100 ml Chloroform-Methanol (95 : 5) aufgenommen und die organische Phase zweimal mit Wasser gewaschen.
Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und das Titelprodukt durch eine Gelfiltration an Sephadex-LH 20 (Säule: 2 x 100 cm) gereinigt. Elutionsmittel: Chloroform-Methanol (1: 1).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rfloo = 0,32; Rf52 = 0,35.
Das Ausgangspeptid kann wie folgt hergestellt werden: 1. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OMe
7,0 g Trt-Cys(Trt)-OSu und 2,0 g H-Cys(Acm)-OMe werden in 50 ml Chloroform 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Lösung wird dann mit 100 ml Chloroform verdünnt und mit ln. Citronensäure, ln. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigester-Äther umkristallisiert.
F.197-198 , 2. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OH
5,63 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OMe werden in 75 ml Di oxan aufgelöst und die Lösung vorsichtig mit 17,5 ml WasseI und 3,71 ml 2n. Natronlauge versetzt. Nach einer Stunde bei 200 wird auf 0O gekühlt, 3,71 ml 2n. Salzsäure zugegeben, die Lösung bei vermindertem Druck und Raumtemperatur auf ca.
30 ml eingeengt und dann mit 200 ml Chloroform verdünnt.
Die Lösung wird dreimal mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Beim Abdampfen des Lösungsmittels erhält man das dünnschichtchromatographisch reine Produkt als weissen Schaum.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf4s = 0,45; Rfioo = 0,65.
3. Z-Thr(But)-Ser(But)-OMe
Zu 200 ml Essigester werden 16,25 g Z-Thr(But)-OSu und 8,47 g H-Ser(But)-OMe,HCl, bei 0" mit 5,6 ml Trifluoramin versetzt und 15 Stunden bei 20 gerührt und mit ln. Citronensäure, 1n Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die Lösung eingedampft, wobei das dünnschichtchromatographisch reine Produkt als Öl erhalten wird.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,60 in Chloroform-Methanol (95 : 5) und Rf = 0,75 in Toluol-Aceton (1: 1).
4. H-Thr(But)-Ser(But)-OMe
3,27 g Z-Thr(But)-Ser(But)-OMe werden in 50 ml Essigester in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle (10%) hydriert.
Nach beendeter Wasserstoffaufnahme (eine Stunde) wird vom Katalysator abfiltriert und die Lösung eingedampft. Das als Öl anfallende Produkt ist dünnschichtchromatographisch einheitlich.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,30 in Chloroform-Methanol (95 : 5).
5. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-OMe
5,43 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-OH und 2,33 g H-Thr (But)-Ser(But)-OMe werden in 70 ml Essigester gelöst und bei 0" mit 1,55 g Dicyclohexylcarbodiimid und 1,02 g N Hydroxybenzotriazol versetzt. Nach 4 Stunden bei 0O und 17 Stunden bei 4 wird filtriert, die Lösung mit 200 ml Essigester verdünnt und mit ln. Citronensäure, In. Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und der Rückstand aus Essigester Petroläther umgefällt.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,60 in Toluol-Aceton (1 : 1) und Rf = 0,45 in Essigester.
6. Trt-Cys(Trt)-Cys (Acm) -Thr(But) -Ser(But)-NHNHz
4,7 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Asm)-Thr(But)-Ser(But)-OMe in 11 ml Methanol werden nach Zugabe von 2,2 ml Hydrazinhydrat 6l/2 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Das Hydrazid wird mit 50 ml eiskaltem Wasser gefällt, abgenutscht und gut mit Wasser gewaschen. Das getrocknete Rohprodukt wird in 80 ml heissem Toluol gelöst, etwas eingeengt und bei 600 mit 80 ml Hexan versetzt. Es wird langsam auf 0" gekühlt, das ausgefallene Produkt abgenutscht und mit Toluol-Hexan 1 : 2 und Hexan gewaschen. Ausbeute 4,06 g.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,26 in Chloroform-Methanol.
7. Z-Ser(But)-Leu-OMe
5,9 g Z-Ser(But)-OH in 20 ml Essigester werden bei -10' mit 2,75 ml Triäthylamin und 2,63 ml Ghlorameisensäure- isobutylester versetzt. Nach 10 Minuten werden 4,0 g H-Leu OMe-HCl und 3,05 ml Triäthylamin zugefügt. Nach 11/2 Stunden Rühren im Eisbad wird mit Phosphorsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt und nach Trocknen über Natriumsulfat der Essigester vollständig verdampft. Man erhält 8,2 g einer wachsartigen Masse. F. (nach Kristallisation aus Hexan): 56-580.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,58 in Essigester.
8. Trt-Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe
8,5 g des obigen Dipeptids werden in 130 ml Essigester gelöst, nach Abkühlen auf 0O mit 19,4 ml ln. Salzsäure und 0,6 g 10% Palladiumkohle versetzt und hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird der Essigester verdampft, der Rückstand in 60 ml Methylenchlorid aufgenommen und mit 14,7 g Trt-Cys(Trt)-OSu und 2,2 ml N-Methylmorpholin versetzt. Nach 48 Stunden bei Raumtemperatur wird mit Essigester verdünnt und mit kalter, verdünnter Phosphorsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Der nach Trocknen und Verdampfen der Lösungsmittel erhaltene Rückstand wird im System Methanol-Hexan-Wasser (20 : 20:1) durch Craig-Verteilung über 600 Stufen gereinigt, k = 0,33.
Man erhält 10,1 g eines farblosen Schaums.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,46 in Essigester-Hexan (1 : 1).
9. Bpoc-Ile-Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe
1,72 g des obigen, geschützten Tripeptids werden bei Raumtemperatur in 17,2 ml Eisessig gelöst, mit 4,2 ml Wasser versetzt und 30 Minuten gerührt. Nach Zugabe von 5 ml Eisessig wird gefriergetrocknet, der Rückstand in 35 ml 70% tert. Butanol suspendiert, noch mit 5 ml Wasser versetzt, das Triphenylcarbinol abfiltriert und das Filtrat erneut gefriergetrocknet. Man erhält 1,3 g eines weissen Pulvers, Rf 0,30 in Essigester, das zu dem wie folgt bereiteten gemischten Anhydrid gegeben wird: 830 mg Bpoc-Ile-OH in 4 ml Dimethylformamid werden bei - 15" mit 0,25 ml N-Methylmorpholin und 0,295 ml Chlorameisensäureisobutylester versetzt. Nach 10 Minuten wird das oben erhaltene Tripeptid zugesetzt, gefolgt von 0,166 ml N-Methylmorpholin und 4 ml Dimethylformamid.
Man lässt über Nacht bei 0O stehen, fällt das Produkt durch Eindampfen in eiskalte wässrige Kaliumhydrogencarbonatlösung, nutscht ab, wäscht gut mit Wasser und trocknet bei 40O. Das eiskalte Produkt (1,98 g) ist rein genug für die weitere Verwendung, kann jedoch auch aus Methanol-Wasser umkristallisiert werden.
F.: 175-1770.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,55 in Essigester-Hexan (8 : 2).
10. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-fle- Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe
5,1 g Bpoc-Ile-Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OMe in 44 ml Eisessig und 11 ml Wasser werden 18 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Nach Zugabe von 20 ml Eisessig wird lyophilisiert, dann noch zweimal aus tert.-Butanol gefriergetrocknet.
Das klebrige Material wird mit 10 ml Äther zerrieben, nach Zugabe von 70 ml Hexan abgenutscht und mit Äther-Hexan 1 : 9 gewaschen. Ausbeute 2,92 g.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,16 in Essigester.
3,96 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-NHNH2 in 15 ml Dimethylformamid werden bei -30' mit 3,3 ml 3,3n.
Salzsäure in Dioxan und bei - 15 mit tert.Butylnitrit versetzt.
Nach 15 Minuten bei - 20" werden das obige Tetrapeptid und 2,4 ml N-Methylmorpholin zugefügt und über Nacht bei 0O belassen. Das mit eiskaltem Wasser gefällte Rohprodukt wird nach Trocknen mit Essigester-Hexan 8 : 2 an 290 g Kieselgel chromatographiert. Die dünnschichtchromatographisch reinen Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne verdampft, man erhält 4,6 g eines weissen Pulvers
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,38 in Essigester.
11. Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile- Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OH
3,6 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-fle-Cys- (Trt)-Ser(But)-Leu-OMe werden in 50 ml Dioxan gelöst und 17 ml Wasser und 4 ml ln. Natronlauge zugegeben. Nach eine Stunde bei 200 wird auf 0O abgekühlt und tropfenweise 4 ml ln Salzsäure zugegeben. Bei 20" und vermindertem Druck wird dann das Dioxan weitgehend abgedampft, 20 ml Wasser zugegeben, der Niederschlag abfiltriert und über Kaliumhydroxid getrocknet.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf4s = 0,55 und Rf3 = 0,60.
12. H-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-I 1 e- Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OH
6,94 g Trt-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Thr(But)-Ser(But)-Ile- Cys(Trt)-Ser(But)-Leu-OH werden in 72 ml Trifluoräthanol gelöst, 8 ml Wasser zugegeben und mit 1,2n. Salzsäure in 90% Trifluoräthanol ein pH von 4,0 eingestellt und mittels eines pH-States bei dieser Säurestärke gehalten. Nach 50 Minuten werden 50 ml tert.Butanol zugegeben, das Trifluoräthanol bei vermindertem Druck abgedampft und die Lösung lyophilisiert.
Rf3 = 0,40.
EMI5.1
Das in Beispiel 1 erhaltene
EMI5.2
wird in Methanol, das eine äquivalente Menge Chlorwasserstoff enthält, gelöst und mittels ätherischer Diazomethanlösung in den Methylester übergeführt. Dieser zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Chloroform Methanol (85 : 15) Rf = 0,32.
55 mg des erhaltenen Octapeptidmethylester-hydrochlorids und 19 mg Boc-A1a-Cys(Acm)-OMe werden in 8,5 ml Methanol gelöst und mit 1,5 ml 0,5M. Jodlösung in Methanol versetzt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur lässt man das Gemisch in 30 ml 1 %ige wässrige Ascorbinsäurelösung, die 260 mg Ammoniumacetat enthält, eintropfen. Dabei fällt das Titelprodukt aus, zusammen mit einer kleinen Menge der beiden symmetrischen Disulfide I und II,
EMI5.3
Der Niederschlag wird abzentrifugiert, mit Wasser gewaschen und an Dickschicht-Silicagelplatten in Chloroform Methanol (85 : 15) chromatographiert. Das Titelprodukt mit Rf = 0,55 in dem genannten System wird abgetrennt. Das symmetrische Peptid I weist Rf = 0,41 auf, das symmetrische Peptid II Rf = 0,64.
Beispiel 3 Synthese von menschlichem Insulin der Formel (A-Kette)
EMI5.4
Das obige Produkt wird mittels des in Beispiel 1 erhaltenenBruchstückes der Aminosäuren 613 der A-Kette, nämlich
EMI5.5
und der folgenden weiteren Bruchstücke hergestellt:
EMI5.6
Das Bruchstück IV ist in der Schweizer Anmeldung Ges.
Nr. 13865/72, deutsche Offenlegungsschrift Nr. 2 346 147 beschrieben.
Das Bruchstück II kann wie folgt hergestellt werden: 1. Boc-Gly-ne-Val-Glu(OBut)-Gln-OCH3
Zu einer Suspension von 8,80 g Boc-Gly-Ile-Val-Glu (OBut)-NH-NH2 (vgl. Zahn et al, Z. Naturf. 21b, 763 [1966]) in 60 ml abs. DMF werden bei -35" 15 ml 3n.HCl in Dioxa und 2,24 ml tert.Butylnitrit gegeben. Nach 15minütigem Rühren bei -20" werden zu der klaren Lösung nacheinander 2,95 g H-Gln-OCH3, HCl und 10 ml N-Methylmorpholin hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wird während 28 Stunden im Eisbad gerührt. Man fällt das Produkt mit 450 ml kaltem Wasser aus, wäscht den Niederschlag und trocknet ihn. Nach mehrfachem Verreiben mit Methanol-Essigsäureäthylester (1 : 20) verbleiben 8,60 g eines farblosen Pulvers.
F. 223 2260 (Zers.) [a]20 = - 13 + 1 (c = 1 in DMF).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rfs2 = 0,70, Rf im System Chloroform-Methanol-Trifluor äthanol (7 : 2 1) = 0,65; Rf im System Methyläthylketon Pyridin-Wasser (65 : 5 : 20) = 0,65.
2. Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-NH-NH2
7,15 g Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-OCHs werden in 100 ml Methanol-DMF (1 : 7) gelöst und mit 10 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 22stündigem Stehen bei Raumtemperatur verdünnt man die feste Masse mit 70 ml Methanol, rührt im Eisbad und filtriert. Der Niederschlag wird mit Methanol verrieben. Man erhält 6,2 g eines farblosen Pulvers. Es schmilzt unter Zersetzung bei 243-270". [o]D20 = - 37' + 1o (c = 0,75 in Trifluoräthanol). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rfs2 = 0,40; Rf im System Chloroform-Methanol-Trifluoräthanol (7 : 2 1) = 0,23; Rf im System Methyl äthylketon-Pyridin-Wasser 65 : 5 : 20 = 0,57.
Die Bruchstücke I und II können wie folgt kondensiert werden zum Bruchstück V(A-Kette 1-13).
EMI6.1
3,33 g Boc-Gly-Ile-Val-Glu(OBut)-Gln-NH-NH2 in 40 ml DMF werden bei -15' mit 5,59 ml 2,5n. Chlorwasserstoff in Essigester und 0,7 ml tert.-Butylnitrit versetzt. Nach 10 Minuten bei dieser Temperatur wird eine Lösung von 2,48 g
EMI6.2
und 2,64 ml N-Äthylmorpholin in 12 ml DMF zugetropft. Man lässt eine Stunde bei -10' und 15 Stunden bei 0" stehen, engt dann die Reaktionslösung auf ein kleines Volumen ein und fällt mit Äther aus. Das erhaltene Rohprodukt wird einer Gegenstromverteilung unterworfen. System: Methanol0,075m.-Ammoniumacetat (pH 4,75)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10 : 3 : 8 : 4). Nach 740 Verteilungsschritten befindet sich die Substanz in den Rohren 50-83. K = 0,1.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf3 = 0,35, Rfs2 = 0,70.
Das Bruchstück III kann wie folgt hergestellt werden: 4. Boc-Cys(Acm)-Gly-OMe
20,5 g Boc-Cys(Acm)-OH und 7,5 g H-Gly-OCH3 (letztes frisch aus dem Hydrochlorid freigesetzt) werden in 250 ml Chloroform gelöst, mit 4,7 g N-Hydroxybenzotriazol und 17,3 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und während 4 Stunden bei 25o gerührt. Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffs wird mit weiteren 200 ml Chloroform verdünnt und nacheinander mit wenig In. Zitronensäure, lm. NaHCO3 und mit Kochsalzlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und zur Trockne eingeengt. Den öligen Rückstand reinigt man durch Chromatographieren an einer Säule mit 300 g Silicagel, eingefüllt mit Essigester-Petroläther (2 : 1).
Das reine Produkt wird mit Essigester eluiert; es ist ein Öl, das aus Essigester Petroläther kristallisiert werden kann, F. 83-860.
Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel: Rf43A = 0,49; Rf im System Chloroform-Methanol (9: 1) = 0,42.
5. H-Cys(Acm)-Gly-OMe HCl
5 g Boc-Cys(Acm)-Gly-OMe werden in 20 ml Methanol gelöst und mit 50 ml 4,4n. HCI in Dioxan versetzt. Nach 10 Minuten bei 25o engt man das Volumen auf die Hälfte ein und gibt 100 ml Äther zu. Die Mutterlauge wird vom entstandenen amorphen Niederschlag abgetrennt und dieser getrocknet.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf in Chloroform-Methanol (7 : 3) = 0,45; Rfs2 = 0,21.
6. Boc-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe
32,45 g H-Cys(Acm)-Gly-OMe HCl und 12,5 ml N Methylmorpholin werden in 130 ml DMF gelöst, auf 0" gekühlt und mit 46 g Boc-Leu-ONp versetzt. Man rührt während einer Stunde bei 0O, dann 2 Stunden bei 25 , gibt nochmals 11,8 ml N-Methylmorpholin zu und lässt über Nach bei 250 stehen. Man kühlt sodann auf 0O, filtriert vom auskristallisierten N-Methylmorpholinhydrochlorid ab und engt das Filtrat im Hochvakuum ein.
Der ölige Rückstand wird in 300 ml Essigester gelöst und nacheinander mit KOH-Lösung (5,4 g KOH in 100 ml H2O), 0,5n. Na2CO3, ln. Zitronensäure und NaC1- gesättigtem Wasser gewaschen und zur Trockne eingeengt.
Das rohe Produkt wird durch Zerreiben mit Äther und durch Umfällen aus Benzol-Petroläther gereinigt, wobei man ein amorphes Pulver vom F. 112-113 erhält.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rfs2 = 0,62; Rfloo = 0,90; Rf in Chloroform-Methanol (8 : 2) = 0,65.
7. H-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe HCI
30 g des unter 6. erhaltenen Produktes werden in 120 ml Methanol gelöst, mit 300 ml 4,1n. HCI in Dioxan versetzt und während 20 Minuten bei 250 stehen gelassen. Man engt sodann auf das halbe Volumen ein, gibt 600 ml Äther zu, pulverisiert die anfänglich schmierige Fällung, filtriert ab, wäscht mit Äther und trocknet den Rückstand im Hochvakuum über KOH. Das Produkt enthält gemäss Titration mit 0,1n. NaOH 1,1-1,3 Äquivalent HCI, je nach Trocknungsbedingungen.
Auf Silicagel ist Rfs2 = 0,20; Rfloo = 0,23; Rf in Chloroform-Methanol (8 : 2) = 0,31.
8. Boc-Gln-His-NH-NH2
27,9 g Boc-Gln-His-OCH3 (Marchioro et al, J. Chem.
Soc.(C) 1967, 81) werden in 280 ml reinstem Methanol gelöst, mit 28 ml Hydrazinhydrat versetzt und während 20 Stunden bei 25o stehen gelassen. Man engt im Hochvakuum zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Methanol Essigester-Petroläther um.
F. 187-1890.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf52 = 0,12; Rfioo = 0,1.
9. Boc-Gln-Hos-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe
25,3 g des gemäss 8. erhaltenen und fein pulverisierten Produktes werden in 260 ml DMF suspendiert und bei -20' mit 40 ml 3,2n. HC1 in Dioxan und anschliessend mit 9,45 ml tert.-Butylnitrit versetzt. Man rührt während 15 Minuten bei - 12' und gibt dann eine auf 0O vorgekühlte Lösung von 28,6 g des unter 7. erhaltenen Produktes in 120 ml DMF und 28 ml N-Methylmorpholin zu. Nach einstündigem Rühren bei 0O gibt man nochmals 10,5 ml N-Methylmorpholin zu und lässt dann während 20 Stunden bei 0" stehen.
Das auskristallisierte Methylmorpholin-hydrochlorid wird abfiltriert, das Filtrat im Hochvakuum eingeengt, zweimal mit Essigester verrieben und der pulverige Rückstand getrocknet Man reinigt durch Gegenstromverteilung über 200 Stufen im System Methanol-Puffer Chloroform (2 : 1 : 4) (Puffer: 38,5 g Ammoniumacetat + 57,2 ml Eisessig + 1000 ml Wasser). Das chromatographisch reine Pentapeptidderivat erhält man aus den Rohren 54-88 (rmax = 71; K = 0,55) durch Einengen zur Trockne und Wegsublimieren des Puffersalzes im Hochvakuum bei 45 .
Es wird nochmals 5 %ig in Wasser gelöst und lyophilisiert; man erhält auf diese Weise das Acetat des Produktes.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf43c = 0,4; Rollo = 0,5; RflolA = 0,73.
10. H-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe 2 HC1
28 g des unter 9. erhaltenen Produktes werden in 140 ml Trifluoräthanol und 140 ml Methanol gelöst, auf 0O gekühlt und mit 280 ml 4,4n. HCI in Dioxan versetzt. Man lässt während 5 Minuten bei 250 reagieren, kühlt wieder auf 0O, fällt durch Zugabe von 560 ml Essigester und 280 ml Petroläther aus und dekantiert die überstehende Lösung. Der amorphe Rückstand wird durch Zerreiben mit Essigester-Petroläther (2: 1) pulverisiert und im Hochvakuum über KOH bei Raumtemperatur getrocknet.
Auf Silicagel ist RflolA = 0,4; Rf107 = 0,35.
11. Boc-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe
27,3 g des unter 10. erhaltenen Produktes und 40,5 g Boc Asn-ONp werden in 140 ml DMF gelöst, mit 12,6 ml N Methylmorpholin versetzt, eine Stunde bei 250 gerührt, nochmals mit 8,4 ml N-Methylmorpholin versetzt und über Nacht stehen gelassen. Nach Abkühlen auf 0O wird das Methylmorpholin-hydrochlorid abfiltriert, das Rohprodukt aus dem Filtrat mit Essigester ausgefällt und durch Umfällen aus Methanol-Äther gereinigt.
Man erhzält das Hexapeptiddeivat als amorphes Pulvervorr F. 175-770 (Zers.).
Auf Silicagel ist RflolA = 0,6; Ruf107 = 0,65; Rf43C = 0,3; Rfno = 0,45.
12. H-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe 2 HC1
26 g des unter 11. erhaltenen Produktes werden in 130 ml Trifluoräthanol und 130 ml Methanol gelöst, mit 260 ml 4,8n.
HC1 in Dioxan versetzt und während 20 Minuten bei 25o stehen gelassen. Das Hexapeptidderivat wird alsdann durch Zufliessenlassen von 520 ml Essigester und 260 ml Petroläther bei 0O in pulveriger Form ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum über KOH getrocknet.
Auf Silicagel: RflolA = 0,3; Rf43c = 0,12.
13 .Boc-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OMe
33 g Boc-Val-ONp, 27 g des unter 12. erhaltenen Produktes und 18 ml N-Methylmorpholin werden in 400 ml DMF gelöst und während 6t/2 Stunden auf 50O erwärmt. Man engt sodann im Hochvakuum bis zum Öl ein und fällt das Rohprodukt durch Zugabe von Äther aus. Es wird durch Umfällen aus Methanol-5 %iger NaHCO3-Lösung und aus Methanol-Essigester gereinigt, F. 210-12".
Auf Silicagel: RflolA = 0,6 Rf52 = 0,15; Rf43c = 0,35.
14. Boc-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OH
20,6 g des unter 13. erhaltenen Produktes werden in 164 ml Methanol und 226 ml Wasser unter Erhitzen zum Sieden gelöst, auf 10o abgekühlt, mit 82 ml ln. NaOH versetzt und dann während 8 Minuten bei 250 stehen gelassen. Man neutralisiert durch Zugabe von 82 ml in. HCI, engt auf ein Volumen von ca. 250 ml ein und unterwirft diese Lösung zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im System n-Butanol-Ammonacetatpuffer (7,7 g Ammoniumacetat + 5,72 ml Eisessig + 1000 ml Wasser; pH = 4,75).
Nach 166 Stufen isoliert man das reine Heptapeptidderivat aus den Rohren 54-75 (rmax = 64; K = 0,63) durch Eindampfen zur Trockne, Absublimieren des Puffers und Trocknen bei 45O im Hochvakuum als amorphes Pulver vom F. 220" (Zers.).
Auf Silicagel: Rf43E = 0,45 Rflol = 0,5; Rfs7 = 0,55.
15. H-Val-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OH. 2 HCI
9 g des unter 14. erhaltenen Produktes werden in 225 ml 0,72n. HCI in 94%igem Eisessig suspendiert und während 30 Minuten bei 250 gerührt, wobei man nach ca. 20 Minuten eine klare Lösung erhält. Diese wird lyophilisiert und der Trockenrückstand im Hochvakuum bei 30O nachgetrocknet.
Auf Silicagel: Rf43E = 0,18; Rf4s = 0,18; RflolA = 0,3 16. Boc-Phe-Val-Asn-lGln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-OH
467 mg des unter 15. erhaltenen Produktes werden in 10 ml DMF und 0,5 ml Wasser gelöst, mit 765 mg (Boc-Phe)2O und 275 FI N-Methylmorpholin versetzt und während 3 Stunden bei 50O stehen gelassen. Man engt sodann im Hochvakuum bis zur Bildung eines gallertigen Rückstandes ein, der mit 0,1m.
Ammoniumacetatpuffer (pH 4,75) verrieben, abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet wird. Das Rohprodukt wird durch Verreiben mit Äther und anschliessend durch Umfällen aus Trifluoräthanol-Äther gereinigt.
Auf Silicagel: Rf43E = 0,45; Rf45 = 0,27; Rf52 = 0,21.
17. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-Ser(But) His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-OMe
1,66 g des unter 16. erhaltenen Produktes und 290 mg Toluolsulfonsäure-monohydrat werden unter Erwärmen auf 45O in 32 ml absolutem DMF gelöst und nacheinander mit einer Lösung von 1,7 g H-Ser(But)-His-Leu-Val-Glu(OBut)- Ala-Leu-Tyr(But)-OMe (vgl. Zahn et al, Ann. Chem. 731, 91 [1970]) in 18 ml DMF und von 467 g N-Hydroxybenzotriazol in 6 ml DMF versetzt; zuletzt gibt man noch 2,51 g Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form zu und rührt während 40 Minuten bei 45 . Die zu einer Gallerte erstarrende Masse wird mit 300 ml Äther homogenisiert, die sich bildende feinflockige Fällung abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet.
Zur Reinigung wird das Rohprodukt in 80 ml Trifluoräthanol Eisessig (19 : 1, Volumenteile) während 40 Minuten auf 50O erwärmt, durch Zugabe von 250 ml Äther ausgefällt, abfiltriert und im Hochvakuum über KOH getrocknet. Es ist ein amorphes, in den meisten Lösungsmitteln schwerlösliches Pulver vom Zersetzungspunkt bei ca. 250 . Gemäss Titrationen enthält es 1,15 Äquivalent Toluolsulfonsäure und 0,85 Äquivalent Essigsäure.
Auf Silicagel: Rfloo = 0,3; Rf43C = 0,35; Rf7o = 0,6; Rfiio = 0,6.
18. Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-Ser(But) His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-OH (III)
6,4 g des unter 17. erhaltenen Produktes werden bei 650 in 470 ml Trifluoräthanol gelöst, mit 145 ml Wasser und 191 ml ln. NaOH versetzt, während 5 Stunden bei 50O gerührt, auf 20 gekühlt und mit 191 ml ln. HCI neutralisiert. Durch Einengen auf das halbe Volumen und Zugeben von 950 ml Wasser wird das Rohprodukt ausgefällt. Man stellt das pH durch Zugabe von ln. NaOH auf 7,0, lässt über Nacht bei 0O stehen, filtriert ab, wäscht mit Wasser und trocknet.
Zur Reinigung verteilt man über 680 Stufen im System Methanol-ln.-Essigsäure-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10 : 3 : 5 : 4); Apparatur mit 200 Verteilungselementen und je 25 ml Pha senvolumen, Kreislaufverfahren. Das reine Hexadecapeptid isoliert man aus den Rohren 540-594 (rmax = 550; K = 4,2) durch Einengen bis zur Gelbildung und Lyophilisation. Zur Entfernung der gebundenen Essigsäure wird in Trifluoräthanol gelöst, das Sfache Volumen Wasser zugegeben, ein pH-Wert von 7,0 eingestellt, über Nacht bei - 10 stehen gelassen, abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Man erhält ein amorphes, schwerlösliches Pulver vom Zersetzungspunkt bei ca. 230' Auf Silicagel: Rf43C = 0,3; Rfs2A = 0,3; Rf70 = 0,5; Rftto = 0,45.
Das Bruchstück III kann wie folgt mit dem in der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 2 346 147 beschriebenen Bruchstück IV zur geschützten A-Kette 14-21 + geschützte B-Kette 1-30 (VI) kondensiert werden:
14 15 16 17 18 19 20 21
19. Bpoc-Tyr(But)-Gln-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr(But)-Cys-Asn-OBut Boc-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Acm)-Gly-Ser(But)-His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-Leu-Val-Cys-Gly
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Glu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
2,12 g des unter 18.
beschriebenen Produktes (III) und
EMI8.1
Lys(Boc)-Thr(But)-OBut
29 30 als Hydrochlorid sowie 0,94 g N-Hydroxybenzotriazol (Hydrat) werden in 92 ml DMF bei 45O gelöst, mit 0,63 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und während 41/2 Stunden bei 45O gerührt. Die Lösung wird dann in 850 ml Äther eingetropft, der feinflockige Niederschlag abfiltriert und mit Äther gewaschen.
Das Rohprodukt wird einer Gegenstromverteilung im System Methanol-0,1m. Ammoniumacetat (pH 7,0)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10 : 3 : 5 : 4) unterworfen. Nach 1200 Verteilungsschritten befindet sich das Produkt in den Rohren 15-42; K = 0,03.
Die Substanz zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte: Rflo2A = 0,50; Rfs2A = 0,55; Rfioo = 0,45.
14 15 16 17 18 19 20 21
20. H-Tyr(But)-Gln-Leu-Glu(OBut)-Asn-Tyr(But)-Cys-Asn-OBut Boc-Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu-Cys(Acm)-Gly- Ser(But)-His-Leu-Val-Glu(OBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-Leu-Val- > ys-Gly
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Mu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut (VII)
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Aus dem unter 19. beschriebenen Produkt (VI) kann die Bpoc-Gruppe nach dem Verfahren der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 2 346 147 abgespalten werden, wobei man das obige Produkt (VII) erhält:
1,1 g des unter 19 beschriebenen Produktes V werden in 150 ml 90%igem Trifluoräthanol gelöst, mit 0,12n.Chlorwasserstoff in 90%igem Trifluoräthanol auf pH 0,5 gestellt und mittels eines pH-Staten auf diesem Wert gehalten.
Nach 11/2 Stunden gibt man 1 ml Pyridin zu und dampft die Lösung zur Trockne ein. Der Rückstand wird zweimal mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet. Das Produkt (Hydrochlorid von VII) weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rfs2A = 0,25;
Rfioo = 0,30; Rf43C = 0,40; Rfl02A = 0,35
Das Bruchstück VII kann mit dem unter 3. beschriebenen Bruchstück V zu den über eine Disulfidbrücke verbundenen geschützten Sequenzen A und B des menschlichen Insulins (VIII) kondensiert werden:
EMI8.2
18 19 20 21 Asn-Tyr(But)-Cys-Asn-OBut
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Boc-phe-val-Asn-Gln-His-Leu-cys(Acm)-Gly-ser(But)-His-Leu-val-Glu(oBut)-Ala-Leu-Tyr(But)-Leu-val-cys-G
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Glu(OBut)-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr(But)-Thr(But)-Pro-Lys(Boc)-Thr(But)-OBut
EMI8.3
und 360 mg des unter 20. beschriebenen Produktes werden in 15 mi DMF gelöst, 70 RI N-Athylmorpholin, 136 mg N Hydroxybenzotriazol und 150 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben.
Die Lösung wird 5 Stunden bei 45O gehalten, dann abgekühlt und mit 100 ml Äther versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet.
Zur Reinigung wird das Rohprodukt einer Gegenstromverteilung im System Methanol-0,lm. Ammoniumacetat (pH 4,75)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (20 : 6:11 : 9) unterworfen.
Nach 1425 Verteilungsschritten befindet sich die Substanz in den Rohren 42-66; k = 0,05. Das Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf4s = 0,35; Rf52 = 0,40; Ruf115 = 0,60.
22. Menschliches Insulin (h-Insulin) a) Aus dem unter 21. beschriebenen Produkt werden die Schutzgruppen vom tert.Butyl-Typ mit Trifluoressigsäure und die Mercaptoschutzgruppen mittels Jod abgespalten, wobei gleichzeitig die zweite Disulfidbrücke zwischen den Ketten A und B gebildet wird:
55 mg des unter 21. beschriebenen Produktes werden bei Raumtemperatur 30 Minuten mit 95 %iger Trifluoressigsäure behandelt. Die Lösung wird mit 60 ml 50 %iger Essigsäure verdünnt und sofort zu 15 ml 0,1m. Jodlösung in Eisessig getropft. Nach 10 Minuten wird mit 1,8 ml lm. wässriger Ascorbinsäurelösung entfärbt und diese Lösung auf einer 450 ml-Säule aus Sephadex G 25 in 50%iger Essigsäure entsalzt. Das im UV bei 280 nm absorbierende Eluat wird im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet.
Aus diesem Rohprodukt wird das h-Insulin durch Verteilung im System tert. Butanol-lm. Ammoniumacetat (pH 7,1)-Chloroform (10 : 10 : 0,5) gewonnen; K = 0,35. Das Produkt kristallisiert aus einem 0,095m. Na-citrat-Puffer pH 6,0, enthaltend 0,03m NaCI, 0,012m. Zn Ch und 16 Vol.% Aceton, in den typischen rhomboedrischen Kristallen.
Im Dünnschichtchromatogramm an Cellulose ist Rflol s = 0,55; Rf112A = 0,45. Elektrophoresen auf Celluloseacetat: pH 1,9: Laufstrecke 9 cm gegen die Anode; pH 8,6: Laufstrecke 7 cm gegen die Kathode (Puffer nach Brandenburg et al, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 353, 599 [1972]).
b) Aus dem unter 21. beschriebenen Produkt werden zuerst die Mercaptoschutzgruppen mittels Jod abgespalten unter gleichzeitiger Bildung der zweiten Disulfidbrücke, anschliessend werden die Schutzgruppen vom tert.Butyl-Typ mit Trifluoressigsäure entfernt.
55 mg des unter 21. beschriebenen Produktes in 20 ml 87,5%iger Essigsäure werden zu 15 ml 0,1m. Jodlösung ir Eisessig, verdünnt mit 40 ml 50%iger Essigsäure, getropft und 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das überschüssige Jod wird mit 1,8 ml lm. wässriger Ascorbinsäurelösung entfärbt und das Reaktionsgemisch auf einer 450 ml-Säule aus Sephadex G 25 in 50 %iger Essigsäure entsalzt. Das im UV bei 280 nm absorbierende Eluat wird im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet. Der Rückstand wird 30 Minuten mit 95%iger Trifluoressigsäure behandelt und mit Äther gefällt.
Aus diesem Rohprodukt wird das h-Insulin wie bei 22.
beschrieben erhalten.
Beispiel 4
Bildung der Cystinverbindung aus S-Trityl-cysteinpeptid ketten in Anwesenheit einer S-Acm-Cysteinpeptidkette
Zu 2,7 mg (5 wohl) Acetyl-Gly-Cys(Trt)-Gly-OCH3 (I) und 2,7 mg (5 IlMol) Z-Phe-Cys(Acm)-Gly-OCH3 (II), gelöst in 0,8 ml 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol werden 0,3 ml 0,2m. Jodlösung in Methylenchlorid gegeben. Nach 10 Minutel Rühren bei Zimmertemperatur wird mit 0,4 ml lm. wässriger Ascorbinsäurelösung entfärbt.
Laut Dünnschichtchromatogramm an Silicagel enthält die Reaktionslösung als einziges Cystinpeptid das (Acetyl-Gly-Cys-Gly-O CH3)2 (III) und ausserdem unverändertes Acm-Cysteinpeptid (II). Die Rf Werte der Verbindungen I, II und III in den Systemen Chloroform-Methanol (85 : 15, V : V) = System A, und Chloroform-Trifluoräthanol (85 15, V : V) System B, Laufstrecke 15 cm, sind folgende: I II III
A 0,53 0,58 0,17
B 0,24 0,26 0,00
Die Ausgangsstoffe können wie folgt hergestellt werden: I. a) Trt-Cys(Trt)-Gly-OMe
Eine Suspension von 3,86 g H-Gly-OMe HCl in 60 ml DMF wird unter Rühren bei 220 mit 4,28 ml Triäthylamin und anschliessend mit 20 g Trt-Cys(Trt)-OSu C6H6 (B. Kamber et al, Helv. Chim.
Acta 53, 556 [1970]) versetzt, während 2 Stunden gerührt und über Nacht stehen gelassen. Man filtriert sodann das entstandene Triäthylamin-hydrochlorid ab und fällt das Dipeptidderivat durch Eintropfen des Filtrates in 500 ml Wasser bei 0" als amorphes Pulver aus. Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf im System Cyclohexan-Essig ester(1 1) = 0,51;RfinToluol-Aceton(8 2) = 0,6.
b) H-Cys(Trt)-Gly-OMe
4 g Trt-Cys(Trt)-Gly-OMe werden in 40 ml Eisessig gelöst und während 5 Minuten tropfenweise mit insgesamt 10 ml Wasser versetzt. Nach beendigtem Zutropfen rührt man noch während 30 Minuten bei Raumtemperatur, gibt weitere 30 ml Wasser zu, rührt noch während 30 Minuten bei 0" und filtriert dann das entstandene Triphenylcarbinol ab. Das Filtrat wird mit Essigester überschichtet und bei 0O mit gesättigter Sodalösung auf pH 9-10 gestellt. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen und zur Trockne eingeengt, wobei man ein gelbes, harziges Produkt erhält. Auf Silicagel ist Rf in CHCl3 MeOH (9 : 1) = 0,6; Rf in Butylacetat-MeOH (9 : 1) = 0,35; Rfs2 = 0,6.
c) Acetyl-Gly-Cys(Trt) -Gly-OMe
1,27 g Acetyl-Gly-OH und 1,51 ml Triäthylamin werden in 11 ml Essigester und 2 ml DMF gelöst, auf - 200 gekühlt und mit 1,33 ml Pivalinsäurechlorid versetzt. Man rührt während 15 Minuten bei -10', gibt dann eine Lösung von 3,62 g H Cys(Trt)-Gly-OMe in 15 ml Essigester und 1 ml DMF zu, rührt während einer Stunde bei 0O und lässt über Nacht bei 5 stehen. Man verdünnt mit Essigester, wäscht nacheinander mit Zitronensäurelösung, Natriumbicarbonatlösung und Wasser und engt zur Trockne ein Den Rückstand kristallisiert man aus Essigester-Petroläther; F. 192-193 .
Auf Silicagel: Rf in CHCl3-MeOH (9 : 1) = 0,36; Rf in Butylacetat-MeOH (8 : 2) = 0,35; Rf2 = 0,65.
II. Z-Phe-Cys(Acm)-Gly-OMe
1,95 g Z-Phe-OH und 0,77 ml N-Methylmorpholin werden in 10 ml Essigester gelöst, bei -20" mit 0,8 ml Pivalinsäurechlorid versetzt und während 15 Minuten bei -10' gerührt.
Man gibt sodann eine Lösung von 1,5 g H-Cys(Acm)-Gly OMe HCl (vgl. Beispiel 3 unter 5) in 5 ml DMF und 20 ml Essigester sowie 0,66 ml N-Methylmorpholin zu, rührt während einer Stunde bei 0O und lässt über Nacht bei 5" stehen.
Zur Aufarbeitung wird in n-Butanol aufgenommen und nacheinander mit Zitronensäurelösung, Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen und die organische Phase zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird aus Methanol-Essigester Petroläther umkristallisiert: F. 185-186". Auf Silicagel: Rf in CHC13-MeOH (9 1) = 0,6; Rfs2 = 0,65; Rf43c = 0,6.
In gleicher Weise wie oben beschrieben werden 2,7 mg Peptid I und 2,7 mg Peptid II, gelöst in 1,2 ml 2,2,2-Trifluor- äthanol mit 0,3 ml 0,2m. EQJ-haltiger wässriger Jodlösung (Titrisol-Merck) behandelt). Nach 10 Minuten bei Zimmertemperatur wird wie angegeben aufgearbeitet. In der Reaktionslösung werden das Cystinpeptid III und das Cysteinpeptid II als einzige Peptide dünnschichtchromatographisch eruiert.
Rf-Werte wie oben.
Zu denselben Resultaten gelangt man, wenn man statt des
Trifluoräthanols 2,2,2-Trichloräthanol oder 2,2,2-Tribrom äthanol verwendet.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung von Peptiden, welche mehr als eine Disulfidbindung enthalten, indem man die zum Aufbau des Peptids nötigen Aminosäuren unter Bildung von CONH
Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende funk tionelle Gruppen intermediär geschützt und zu einem beliebi gen Zeitpunkt die Cysteinreste zu Cystinresten oxidiert wer den, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer oder zwei cysteinhaltigen Aminosäuresequenzen, in welchen Disulfidbin dungen hergestellt werden sollen, zwei zu verbindende
Cysteinreste je einzeln durch eine Aralkyl- bzw.
Arylcycloal kylgruppe Rl und zwei weitere Cysteinreste je einzeln durch eine Acylaminomethylgruppe R2 schützt, die Schutzgruppen R1 durch Behandlung mit Jod in Gegenwart eines polyhaloge nierten Niederalkanols entfernt, wobei gleichzeitig die Disul fidbindung zwischen diesen Cysteinresten, die durch Rt geschützt waren, gebildet wird, und nach Entfernung des polyhalogenierten Niederalkanols die zweite Disulfidbrücke durch Behandlung mit Jod bildet.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als polyhalogenierten Niederalkanol 2,2,2 Trifluoräthanol oder 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol verwendet.
2. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man neben dem polyhalogenierten Niederalkanol als Jodlösungsmittel einen chlorierten Kohlenwasserstoff verwendet.
3. Verfahren nach Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Methylenchlorid verwendet.
4. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mercaptoschutzgruppe Rt eine Gruppe verwendet, in der das mindestens einen Arylrest tragende Kohlenstoffatom an den Schwefel der Mercaptogruppe gebunden ist.
5. Verfahren nach Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mercaptoschutzgruppe R1 die Tritylgruppe verwendet.
6. Verfahren nach Patentanspruch I oder einem der Unteransprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mercap toschutzgruppe R2 eine Niederalkanoylaminomethylgruppe verwendet.
7. Verfahren nach Unteranspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mercaptoschutzgruppe R2 die Acetylaminomethylgruppe verwendet.
l PATENTANSPRUCH II
Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch I bei der Synthese von Insulin.
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.