CH587014A5

CH587014A5 - Microbial insecticide prodn. from Bacillus thuringiensis - by fermentation without premature cell lysis

Info

Publication number: CH587014A5
Application number: CH750472A
Authority: CH
Original assignee: Crc Ricerca Chim
Priority date: 1972-05-19
Filing date: 1972-05-19
Publication date: 1977-06-15
Also published as: BE862430Q

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Biosynthese'eines mikrobiellen Insektizides, enthaltend Sporen und kristallines Endotoxin, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Mikroorganismus Bacillus thuringiensis oder einen verwandten Bazillus derart in einem Nährmedium unter Sporenbildung züchtet, dass die durch die Belüftung im Laufe der submersen Kultivierung vor Beendigung der Sporenbildung hervorgerufene frühe Zell-Lyse verhindert wird.

Es ist bekannt, dass die frühe Lyse von Zellen im Laufe der Züchtung zu niederen Ausbeuten und herabgesetzter Wirksamkeit des Bioinsektizides sowie zu einer Erhöhung seiner Toxizität führt.

Die vorliegende Erfindung liefert eine verbesserte Methode zur Erzeugung von Sporen und kristallinem Endotoxin in dem Verfahren, bei welchem frühe Lyse von Bakterienzellen üblicherweise auftritt als Resultat enzymatischer Vorgänge, welche durch die Belüftung induziert werden.

Die Verzögerung der Sporenbildung während des vegetativen Wachstums von Bakterien wird der Wirkung von einem oder mehreren Inhibitoren von eiweissartiger Natur zugeschrieben. Die proteolytische Zersetzung von vorgeschlagenen Inhibitoren führt zu einem Beginn der Sporenbildung. Abgesehen davon, wurden verschiedene Theorien betreffend der Funktion der Protease vorgelegt, welche eine der frühen Erscheinungen ist, die mit dem Einsetzen der Sporenbildung verbunden ist (J. Mandelstam und W. M. Waites, Biochem. J. Vol. 109, Seiten 793 bis 801, 1968).

Gemäss Schaeffer wurde vorgeschlagen, dass im Laufe des Wachstums von Bakterien in einem rasch metabolisierten Nährsubstrat und in Gegenwart einer verwendbaren Stickstoffquelle Stoffwechselprodukte entstehen, welche die Synthese extracellularer Proteasen und eines für die Sporenbildung spezifischen Enzyms unterdrücken würden, möglicherweise ähnlich wie im Krebs-Zyklus (P.

Schaeffer, Bacteriol. Rev., Vol. 33, Seiten 48 bis 71, 1969).

Die Resultate einer derartigen Unterdrückung ist die Anhäufung von Essigsäure und Brenztraubensäure, wodurch ein Abfall des pH-Wertes und frühe Lyse von Bakterienzellen im allgemeinen hervorgerufen werden.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es nun gelungen, bei der Sporulierung die frühe Lyse von Bakterienzellen zu verhindern, indem man die Biosynthese unter anaeroben Bedingungen während 4 bis 6 Stunden durchführt und den pH-Wert im Laufe der Biosynthese im Bereich von 6,3 bis 7 hält.

Es wurde unter anderem mit Hilfe der vorliegenden Erfindung möglich, die proteinkristall-parasporalen Körper (a Endotoxin) zu gewinnen und vom wasserlöslichen Exotoxin (ss-Exotoxin) zu reinigen, welches infolge seiner Toxizität für Säugetiere entfernt werden muss. Die beste Methode zur Entfernung des Exotoxins gemäss der vorliegenden Erfindung bedient sich semipermeabler Membranen.

Es ist bekannt, dass die Bacillus thuringiensis-Gruppe von Mikroorganismen gekennzeichnet ist durch die Bildung von proteinhaltigen parasporalen Endotoxin-Kristallen. Die insektenpathogene Natur von Bacillus thuringiensis auf eine grosse Reihe von lepidoptären Larven durch Ingestion ist in erster Linie auf die Wirkung von Endotoxin zurückzuführen. Gewisse Stämme von Bacillus thuringiensis bilden neben intracellularem Endotoxin ein extracellulares, wasserlösliches, wärmestabiles Exotoxin. Unter der Bezeichnung Exotoxin wird hier ein aktiver Stoff von lebenden Zellen verstanden, welcher in das Medium ausgeschieden wird, im Gegensatz zu Endotoxin, welches erst nach der vollständigen Auflösung der Zellen freigesetzt wird.

Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung werden die Charakteristiken der oben erwähnten Toxine eingehender beschrieben.

Das kristalline Endotoxin
Ein proteinhaltiger kristalliner Einschluss wurde aus der sporulierten Kultur von Bacillus thuringiensis durch Hannay und Fitz-James isoliert (C. L. Hannay und P. Fitz-James, Can. J. Microbiol., Vol. 1, Seiten 694 bis 710, 1955). Die elektronenmikroskopischen Studien zeigten, dass während der Sporenbildung von Bakterien von Bacillus thuringiensis ein asporaler kristalliner Körper zusammen mit den Sporen entwickelt wurde. Es wurde ferner gefolgert, dass eine neue Beziehung zwischen der Bildung der Sporen und der Endotoxin Kristalle vorhanden ist. Kürzliche Untersuchungen zeigten, dass das kristalline Endotoxin aus einer hochmolekularen Proteinkomponente und einem Siliciumskelett besteht. Die Sporen und die Endotoxin-Kristalle können aus dem Kulturmedium im Sediment einer Hochleistungszentrifuge gewonnen werden.

Die Abtrennung des kristallinen Endotoxins von den Sporen wurde auf verschiedene Weise durchgeführt, z. B.

durch fraktionierte Sedimentation, stufenweise Sedimentation und Abtrennung in einem zweiphasigen System.

Das Exotoxin
Zusätzlich zum kristallinen Endotoxin scheiden gewisse Stämme von Bacillus thuringiensis während der vegetativen Wachstumsphase eine toxische Fraktion in das Medium aus, welche chemisch verwandt ist mit den Adeninnucleotiden. Es besteht kein Zusammenhang zwischen der Erzeugung von kristallinem Endotoxin und Exotoxin. Gemäss Untersuchungen kann Exotoxin nur von gewissen Genotypen von besonderen Varietäten von Bacillus thuringiensis gebildet werden.

Die Methode für die Erzeugung von Exotoxin wurde von De Barjac entwickelt. Gemäss dieser Methode wird Bacillus thuringiensis in einem Medium gezüchtet, welches Mineralsalze zusätzlich zu Pepton 0,75% und Glucose 1 % enthält, und zwar während 70 Stunden bei 30 C.

Die Herstellung der mikrobiellen Insektizide gemäss der vorliegenden Erfindung erfolgt vorzugsweise mittels folgender Stufen:
A. Kultivierung
Die Kulturen werden erhalten, ausgehend von den Sporen einer Stammkultur der Bakterien Bacillus thuringiensis.

Das Nährmedium zur Herstellung des vegetativen Inoculums in Schüttelfiaschen enthält folgende Bestandteile:
Gewichtsprozent
Bacto-trypton ( Difco ) 0,8
Glucose 2,5 MgSO4 7H2O 0,2 ZnS04 zu 7H20 0,2 Fe2(SO4)4 0,2 MnSO4 5H2O 0,1
Das Medium für Schrägagarkulturen war dasselbe wie oben mit einem Zusatz von 2% Agar.

Gute Resultate wurden erhalten, wenn die Züchtung in folgenden Medien erfolgte:
Medium I
Gewichtsprozent
Melasse (50% Feststoffe) 1,4
Hefe 0,3 (NH4)2S04 0,1
C.S.L. (Maiseinweich flüssigkeit) 0,1 CaC03 0,1
Der pH-Wert nach der Sterilisation 6,8.

Oder mit dem Medium, welches anstelle von Melasse Stärke enthält.

Medium II
Gewichtsprozent
Stärke 1,3
Hefe 1,0
Na2HP04 0,4
C.S.L. (Maiseinweich flüssigkeit) 0,2 CaCO3 0,8 pH-Wert nach dem Sterilisieren 6,8.

Das Nährmedium für das vegetative Inoculum (300 ml) war in sterilisierbaren Flaschen mit flachem Boden und einem Liter Fassungsvermögen enthalten. Das Nährmedium in den Flaschen wurde während 45 Minuten bei 121" C sterilisiert.

Die Glucose wurde getrennt sterilisiert nach der Tindalisationsmethode und aseptisch zum sterilisierten Medium zugesetzt. Das Nährmedium für die Kultivierung in Fermentatoren wurde hergestellt und portionenweise im Fermentator während 45 Minuten bei 121" C sterilisiert. Die Kultivierung wurde in Fermentatoren aus rostfreiem Stahl durchgeführt.

Die Kultur wurde mit 150 Umdrehungen pro Minute bewegt, und die Belüftung betrug 0,5 Liter pro Liter pro Minute und die Inkubationstemperatur 28 bis 30 C. Die Anwendung eines anaeroben Schocks wurde durchgeführt durch Unterbrechung der Belüftung während 3 bis 6 Stunden in der zwölften Stunde der submersen Kultivierung. Die Zeit für den Unterbruch der Belüftung wurde mit Hilfe des Sauerstoffanalysators bestimmt. Die Kultivierung kann durchgeführt werden ohne frühe Lyse von Zellen und ohne Anwendung des beschriebenen anaeroben Schocks , wenn im Laufe der Kultivierung der pH-Wert derart reguliert wird, dass er nicht unter 6,3 fällt. Die Sporenbildung unter Freisetzung von Endotoxin-Kristallen ist in 35 bis 40 Stunden Kultivierung beendet.

B. Abtrennung und Reinigung
Nach vollständiger Auflösung der Bakterien unter Freisetzung von Sporen und Endotoxin-Kristallen wird die Trennung der Sporen und des kristallinen Endotoxins vom Exotoxin ausgeführt. Wasserlösliches Exotoxin wird vorzugsweise mittels Dialyse entfernt. Nach dieser Methode wird ein Gemisch von Sporen und kristallinem Endotoxin, welches für Säugetiere nichttoxisch ist, erhalten. Die Gegenwart oder Abwesenheit von wasserlöslichem Exotoxin wurde durch den biologischen Test bestimmt, welcher von Bond et al. beschrieben ist. Ein Nährmedium für den biologischen Test wurde hergestellt durch Erhitzen des Gemisches von 10 g pulverisiertem Agar, 500 ml frischer Milch und 7 g Hefe. Eine 10-ml-Probe wurde sodann in eine Petri-Schale von 9 cm Durchmesser übertragen, in welcher 250,ul der Testlösung bereits eingefüllt worden waren.

Sobald sich die Gele verfestigt hatten, wur den 20 Eier von Musca domestica zugesetzt. Die Platten wurden während 48 Stunden in einem Inkubator bei 30 C gehalten. Die Entwicklung von Larven und die Disturbanz des Agargels wurden beobachtet (R. P. M. Bond, C. B. C. Boyce und S. J. French, Biochem. J. Vol. 114, Seiten 477 bis 488, 1969). Das erhaltene Produkt, welches vom wasserlöslichen Exotoxin befreit ist, kann auf die für die Herstellung von Insektiziden übliche Weise weiterverarbeitet und verwendet werden.

C. Trocknung
Die Trocknung kann nach einer der folgenden Methoden erfolgen: - Durch Vermischen des erhaltenen Gemisches von Sporen und Endotoxin-Kristallen mit bentonitischen Tonen und Einführen in einen belüfteten Trockner mit Platten in Form von dünnen Filmen bei einer Temperatur von etwa 40 bis 45 C.

- Das erhaltene Gemisch wird in Wasser suspendiert und in rotierenden oder pneumatischen Trockner getrocknet.

- Durch Versprühen des erhaltenen Gemisches in einer Sprühtrocknung.

D. Zerkleinern und Sieben
Wenn das Trocknen in einem Sprühtrockner erfolgt, benötigt das erhaltene Produkt keine Zerkleinerung mehr. Beim Trocknen in belüfteten Trocknern auf Platten wird das Produkt in einer Vorrichtung zum Typ Alpina zerkleinert und durch ein Sieb gesiebt, dessen Feinheit mindestens derjenigen eines Siebes No. 180 entspricht.

E. Bestimmung der Wirksamkeit
Die Bestimmung wurde nach folgenden Methoden durchgeführt. Durch Zählen von vorhandenen lebenden Sporen nach der Plattenmethode und durch Ausführung von Bioversuchen an Testinsekten.

Die erhaltenen Produkte werden gemäss den Standard Bestimmungen, welche von den französischen Laboratoires de Lutte Biologique et de Biocinetique de la Miniere (I.N.R.A.) standardisiert.

Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden im folgenden Beispiele beschrieben, welche jedoch in keiner Weise eine Beschränkung der vorliegenden Erfindung darstellen.

Beispiel 1
Ausgehend von der Kultur vom Bacillus thuringiensis, var. Berliner, wird die Kultivierung in flüssigem belüftetem Medium unter Verwendung von Medium I (siehe oben) nach der beschriebenen Methode durchgeführt. Die Inkubationstemperatur im Laufe der submersen Kultivierung beträgt etwa 28" C. Die Kultur wird mit 150 Umdrehungen pro Minute bewegt und die Belüftungsgeschwindigkeit beträgt 0,5 Liter pro Liter pro Minute. Bei der zwölften bis vierzehnten Kultivierungsstunde wird die Belüftung für 3 bis 6 Stunden unterbrochen. Der Zeitpunkt der Unterbrechung der Belüftung wurde mit Hilfe des Sauerstoffanalysators bestimmt; die Belüftung wurde unterbrochen, sobald der Prozentsatz an Löslichkeit und an Verbrauch von Sauerstoff abnimmt und der pH auf etwa 5,8 abfällt.

Nach 3 bis 6 Stunden wird die Belüftung in derselben Geschwindigkeit von 0,5 Liter pro Liter pro Minute weitergeführt. Die Kultivierung ohne frühe Lyse kann ohne Anaerobiose durchgeführt werden, wenn der pH des Mediums im Bereich von 6,3 bis 6,5 gehalten wird. Die submerse Kultivierung wird weitergeführt, bis die Sporen und das kristalline Endotoxin in das Medium abgegeben werden (durchschnittlich 35 bis 40 Stunden). Das Kulturmedium wird sodann in den Behälter gegeben, in welchem die Reinigung vom wasserlöslichen Exotoxin durchgeführt wird. Die Reinigung erfolgt mittels Dialyse. Hierzu kann eine Vorrichtung verwendet werden, wie in der beiliegenden Figur dargestellt. Das Kulturmedium wird aus dem Fermentator in den Behälter A eingefüllt, welcher mit einem Rührer e und einer Dialysemembran a ausgerüstet ist.

Die Membran kann kolloidal sein oder von jedem anderen in der Praxis üblichen Typus. Die Dialyse erfolgt rascher, wenn deionisiertes Wasser b in den Behälter B zugesetzt wird. Die Gegenwart oder Abwesenheit von wasserlöslichem Exotoxin wird durch den oben beschriebenen Biotest bestimmt. Zu dem erhaltenen Gemisch von Sporen und kristallinen Endotoxinen wird ein pulverförmiges Füllmaterial zugesetzt und das Gemisch in einem Trockenofen auf Platten getrocknet. Das erhaltene Produkt wird in einem Zerkleinerungsapparat vom Typ Alpina gemahlen und gesiebt, um ein Pulver zu erhalten.

Beispiel 2
Das Verfahren wird wie in Beispiel 1 ausgeführt, jedoch für die submerse Kultivierung im Fermentator das Nährmedium II (siehe oben) verwendet.

Beispiel 3
Das Verfahren wird wie in Beispiel 1 ausgeführt, jedoch nach der submersen Kultivierung der Bakterien und nach Durchführung der Dialyse, d. h. nach der Reinigung vom Exotoxin, wird das erhaltene Produkt in einem Zentrifugaltrockner getrocknet und anschliessend in einer Alpina-Vorrichtung vermahlen.

Beispiel 4
Das Verfahren wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch wurde das nach der submersen Kultur der Bakterien und nach Durchführung der Dialyse erhaltene Produkt in einer gewissen Wassermene wieder suspendiert und diese Suspension in einem Sprühtrockner versprüht. Die Temperatur des Trocknens betrug 90 bis 100" C. Am besten eignen sich zu diesem Zweck Sprühtrockner, welche Scheiben mit 10 000 bis 15 000 Umdrehungen pro Minute aufweisen. Das Produkt ist ein sehr feines Pulver, welches weder vermahlen noch gesiebt zu werden braucht. Das Exotoxin ist in diesem Endprodukt nicht vorhanden.

A. Pulverförmiges Präparat BACTUCIDE-P
4,0 Gewichtsprozent der aktiven Komponente mit einer
Wirksamkeit von 15 000 IU/mg 25,0 Gewichtsprozent Aerosil ( Vesalon )
5,0 Gewichtsprozent Jugopon 66,0 Gewichtsprozent Porzellanerde (China-clay)
B. Flüssiges Präparat BACTUCIDE-S
8,0 Gewichtsprozent der aktiven Komponente mit einer
Wirksamkeit von 6000 IU/mg
1,0 Gewichtsprozent Carboxymethylcellulose
0,3 Gewichtsprozent Emulgator
3,0 Gewichtsprozent Erdöl-Kohlenwasserstoffe 87,7 Gewichtsprozent Wasser pH 6,8 bis 7,2
C. Körniges Präparat BACTUCIDE-G 98,0 Gewichtsprozent Calciumcarbonat
2,0 Gewichtsprozent aktive Komponente (2,4- 109 Sporen/g)
Diese Präparate sind besonders wirksam gegen Insekten der Gruppe Lepidoptera.

Die insektizide Wirkung des erfindungsgemäss erhaltenen Sporen des B. thuringiensis und kristallines Endotoxin enthaltenden Produktes kann entweder in Anzahl Sporen pro Gramm des Produktes oder in internationalen Einheiten (I.U.) ausgedrückt werden.

Die in den nachstehenden Präparate-Beispielen enthaltene, nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte aktive Komponente wies eine Wirksamkeit von
1010 Sporen/Gramm der aktiven Komponente
6000 bis 15 000 I.U./mg der aktiven Komponente auf. Hierbei ist zu beachten, dass 100 IU/mg der insektiziden Wirksamkeit einer Standard-Probe E-61 (einem Gemisch von Sporen der Endotoxinkristalle von B. thuringiensis) entspricht, die an Ephestia Kühniella als Testinsekt bestimmt wurde.

Folgende insektizide Präparate wurden hergestellt:
Das flüssige Präparat wird im allgemeinen in einer Menge von 0,8 bis 1,5 Liter/ha, verdünnt mit 500 bis 1000 Liter Wasser, verwendet. Die Verdünnung hängt vor allem von der Art der Applikation, der Anzahl der Insekten und der Dichte der Pflanzen ab. Das Produkt eignet sich auch sehr gut zum Versprühen aus der Luft.

Das pulverförmie Präparat weist ähnliche Eigenschaften und Anwendungsbereiche auf wie das flüssige Präparat. Seine Dosierung beträgt im allgemeinen 0,6 bis 1,0 kg/ha.

Das körnige Präparat (C) eignet sich vor allem zur Bekämpfung von Pyrausta nubilalis in Maisfeldern. Die Dosierung beträgt vorteilhafterweise 30 kg/ha.

Das erfindungsgemäss hergestellte aktive Produkt lässt sich ohne weiteres mit chemischen Insektiziden mischen und weist gute Verträglichkeit damit auf.

Geeignete Mischungen sind z. B.: a) Malathion 0,2 Gewichtsprozent + aktive Komponente 0,12 Gewichtsprozent b) Dimethoat 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent + aktive Komponente 0,15 Gewichtsprozent c) Servin 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent + aktive Komponente 0,15 Gewichtsprozent
Dieselben Wirkungen können mit niedrigeren Konzentrationen an chemischen Insektiziden erzielt werden, indem die Toxizität herabgesetzt wird.

Auch andere chemische Insektizide sind verträglich mit dem erfindungsgemäss erhaltenen Produkt, wie z. B. Methylparathion , Diazinon , DDT , Pyrethrum , Phosdrin usw.

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäss erhaltenen Insektizide wurde an etwa 50 verschiedenen Insekten untersucht.

Im folgenden sind einige der wichtigsten Ergebnisse in Tabellen zusammengestellt, wobei in den Versuchen der Tabellen 1 bis 3 das flüssige Präparat BACTUCIDE-S , in denjenigen der Tabelle 4 das körnige Präparat BACTUCIDE-G verwendet wurde.

Tabelle 1
Wirksamkeit gegen Trychoplusia ni auf Kohlpflanzen Menge % getöteter Larven Total der Präparat Dauer des Testes untersuchten Larven Liter/ha 1-5 Tage 5-7 Tage 10 Tage 0,2 20 27 90 180 0,5 63 80 112 220 1,0 75 92 200 222 Kontrolle - - 650
Tabelle 2
Wirksamkeit gegen Hyponomeuta mallinellus auf Äpfeln Menge Insectarium Feldversuche Präparat % Mortalität korr. Mortalität % Mortalität korr.

Mortalität Liter/ha 0,4 15 13,8 12 11,05 0,6 32 31,2 31 30,2 1,0 85 84,2 86,0 85,2 1,5 100 100 100 100
Tabelle 3
Wirksamkeit gegen Heliothis virescens und Heliothis zea auf Tabak- und Baumwollpflanzen Konzentration Tage Baumwolle Tabak an Präparat % Mortalität % Mortalität Liter/ha 0,2 4 30 75 0,5 6 50 100 1,0 8 95 100 1,5 10 100
Tabelle 4
Wirksamkeit gegen Pyrausta nubilalis auf Maispflanzen Präparat Dosis Anzahl Pflanzen mit Durchschnittliche Wirksamkeit kg/ha Pflanzen lebenden Larven Anzahl Larven des Präparates (%) pro Pflanze in % BACTUCIDE-G 20 80 41,0 0,9 82
Die vorliegende Erfindung kann auch für andere Variationen derselben Bakterienart, z. B. Bacillus thuringiensis var.

sotto, Bacillus thuringiensis var. subtoxicus, angewandt werden Alle diese Bakterien sind in der Literatur eingehend beschrieben.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der höheren Wirksamkeit des erhaltenen Produktes auf Grund der ausgezeichneten Reinheit des Produktes in bezug auf Exotoxin bei hohen Ausbeuten an Sporen und kristallinen Endotoxinen.

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur Biosynthese eines mikrobiellen Insektizides, enthaltend Sporen und kristallines Endotoxin, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus Bacillus thuringiensis oder einen verwandten Bazillus derart in einem Nährmedium unter Sporenbildung züchtet, dass die durch die Belüftung im Laufe der submersen Kultivierung vor Beendigung der Sporenbildung hervorgerufene frühe Zell-Lyse verhindert wird.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene mikrobielle Insektizid mittels Dialyse vom toxischen wasserlöslichen Exotoxin reinigt.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentierung vom Bacillus thuringiensis ohne Lyse vor Beendigung der Sporenbildung dadurch erfolgt, dass man die Belüftung unterbricht und die Fermentierung zeitweise unter anaeroben Bedingungen durchführt.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentierung ohne Lyse der Zelle vom Bacillus thuringiensis vor Beendigung der Sporenbildung derart durchgeführt wird, dass man den pH-Wert im Laufe der Kultivierung im Bereich von 6,3 bis 7 hält.

4. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Material, welches die Sporen und das kristalline Endotoxin enthält, vom toxischen Exotoxin mittels Dialyse durch eine semipermeable Membran abtrennt.