CH603790A5 - Antibiotics S 7481-F-1 and 2 - Google Patents
Antibiotics S 7481-F-1 and 2Info
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die neuen Antibiotika S 7481/F-1 (Formel I)
EMI1.1
und S 7481/F-2 und Verfahren zur Herstellung dieser Anti biotika.
Erfindungsgemäss gelangt man zu den neuen Antibiotika 5
7481/F-1 und S 7481/F-2, indem man einen Stamm der Pilz species Tolypocladium inflatum Gams in einem Nährmedium züchtet, die neuen Antibiotika aus der Fermentationsbrühe auf an sich bekannte Weise durch extraktive und/oder adsorptive
Arbeitsmethoden isoliert und hierauf chromatographisch oder mittels Gegenstromverteilung reinigt.
Der neue erfindungsgemäss verwendete Stamm der Pilz- species Tolypocladium inflatum Gams wurde aus einer in
Norwegen gefundenen Erdprobe isoliert und eine Kultur davon beim United States Department of Agriculture (Northern
Reserach and Development Division), Peoria, Ili., USA unter der Nummer NRRL 8044 deponiert.
Der neue Stamm NRRL 8044 von Tolypocladium inflatum
Gams wächst auf 2% Malzextraktagar zwischen 6 und 33 , das Wachstumsoptimum liegt um 240, wo in 12 Tagen 40 bis 45 mm im Durchmesser messende, reinweisse, oberflächlich samtartige und ungefältete Kolonien gebildet werden. Bei der höchsten, noch gutes Wachstum erlaubenden Temperatur(33 ) wird hingegen überhaupt kein Luftmycel, dafür eine sehr stark gefältete Kolonie gebildet. Mit zunehmender Kulturtemperatur bildet sich an der Kolonieunterseite vermehrt ein gelbes Pig- ment, welches bei 27 und noch ausgeprägter bei 30 bis 33 in den Agar diffundiert.
Zur Bildung der Konidiophoren, welche sowohl zerstreut, als auch in dichteren Gruppen, vor allem aber am Kulturgefäss- rand stehen, benötigt der neue Stamm von Tolypocladium inflatum Gems bei 24 auf Malzextraktagar 15 bis 20 Tage. Der Hauptast der Konidienträger erreicht einen Durchmesser von 2,0 bis 3,8 . Die Phialiden des neuen Stammes von Tolypocladium inflatum Gams sind, insbesondere am Ende ihrer Entwicklung, lang ausgezogen. Die Konidien haben folgende Dimensionen: 2,0-3,1 X 1,5-2,0 . Der vorliegende Tolypocladium inflatum Gams Stamm NRRL 8044 bildet unter allen genannten Kulturbedingungen keine echten Chlamydosporen.
Der neue Stamm NRRL 8044 lässt sich auf den verschiedensten Nährböden mit der üblichen Nährstoffzusammen- setzung züchten. Als Kohlenstoffquelle können diese Nährböden Glucose, Stärke, Saccharose, Malzextrakt etc. enthalten, ferner die üblichen anorganischen und organischen Stickstoffquellen wie Sojapepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat etc., sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenelemente.
Die neuen Antibiotika S 7481/F-1 und 9 7481/F-2 kann man in der Weise herstellen, indem man ein flüssiges Nähr- medium mit einer Sporen- oder Mycelsuspension des Stammes NRRL 8044 beimpft und die Kultur 11 bis 18 Tage, vorzugs- weise 13 Tage, bei 25 bis 30 , vorzugsweise bei 27 , und bei einem pH-Wert von 4,3 bis 6,2, vorzugsweise von 5,6, in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) inkubiert wird.
Sobald eine maximale Menge an Antibiotika produziert ist, werden diese aus der Kulturbrühe durch extraktive und/oder adsorptive Methoden auf an sich bekannte Weise gewonnen. Eine Methode, die sich als zweckmässig erwiesen hat, besteht in der Extrak tion der Kulturbrühe mit Hilfe eines mit Wasser nicht mischba- ren Lösungsmittels, gegebenenfalls nach vorhergehender mechanischer Zerkleinerung.
Als Lösungsmittel kommen in Frage vorzugsweise Aethylenchlorid, jedoch können auch Chloroform, Essigester, Methylenchlorid oder Butylacetat verwendet werden. Die organische Phase wird abgetrennt, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert, vorzugsweise mit einer Methanollösung an Sephadex LH-20, wobei die gegen Aspergillus niger aktiven Fraktionen vereinigt' werden und nochmals an Aluminiumoxid mit Toluol, dem 10 bis 50% Aethylacetat zugesetzt wurde,
chromatogra phdert. Die Erkennung der Aktivstoffe erfolgt wieder durch Aktivitätsprüfung gegen Aspergillus Liter. Die Reinigung der beiden Antibiotika erfolgt durch erneutes Chromatographieren.
Die neuen Antibiotika S 7481/F-l und S 7481/F-2 zeichnen sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakolo gische Eigenschaften aus und können daher als Heilmittel verwendet werden. So hemmen beide Antibiotika das Wachstum von Aspergillus niger. Insbesondere zeichnen sich aber die beiden neuen Wirkstoffe durch eine immunosuppressive und entzündungshemmende Wirkung aus.
Die immunosuppressive Wirkung kann wie folgt gezeigt werden: a) Lokale Hämolyse im Gel in vitro, Jerne-Test:
Die Hemmung der Homolysenhöfe in % gegenüber Kontrollen beträgt bei einer Dosis von 2 x 60 mg/kg i.p. 99%, bei einer Dosis von 1 x 150 mg/kg p.o. 90% und bei einer Dosis von 3x200 ma/kg p.o. 99,5%.
b) Hämagglutinationstest (HAT) an der Maus: Erfasst werden die gegen Schaferythrozyten gebildeten Antikörper. Die Hemmung wird im suppressiven Index (SI) ausgedruckt, wobei die unbehandelte Kontrolle mit 1,00 angegeben wird; SI=0,3 nach p.o. 5 x 200 mg/kg.
c) Hauttransplantationstest bei der Maus:
Bei H-2 histoinkompatiblen Mäusen wird die Überlebenszeitverlängerung des Hauttransplantates gegenüber unbehandelten Kontrolltieren nach einer Dosis von 7 X 200 mg/kp p.o.
knapp signifikant verlängert.
d) Experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) an der Ratte:
Die experimentell hervorgerufenen Nervengewebsschädigungen, die bei unbehandelten Kontrolltieren 8 von 10 Tieren lähmte, ergab bei der gleichen Anzahl Versuchstieren, die mit
13 x 25 mg/kg i.p. behandelt worden sind, einen 100%igen Schutz.
e) Oxazolon-Test an der Maus:
Die Abnahme der Ohrschwellung wird als suppressiver Index (SI) ausgedrückt: SI=0,6 nach 6 X 75 mg/kg p.o.
Aufgrund ihrer immunosuppressiven Wirkung können die Verbindungen zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die mit der Beeinflussung der Abwehrreaktion im negativen Sinn zusammenhängen angewandt werden.
Die neuen Antibiotika besitzen ebenfalls eine Arthritis hemmende Wirkung. So wirken sie z. B. im Freund-Adjuvans- Arthritis- Latenzzeitversuch an der Ratte in Dosen von ca.
50 mg/kg Körpergewicht stark schwellungshemmend.
Aufgrund ihrer Arhtirits-hemmenden Wirkung können die Antibiotika zur Prophylaxe und Behandlung von Arthritis und reheumatischen Krankheiten angewandt werden.
Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach
Art des Antibiotikums, der Administration und des zu behan dekaden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtie- ren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 10 bis 200 mg/kg Körpergewicht erzielt. Diese Dosis kann nöeigen- falls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Petardform verabreicht werden.
Für grössere säugetiers liegt die Tagesdosis bei etwa
50 bis 900 mg. Für orale Applikationen können die Teildosen beispielsweise etwa 25 bis 300 mg der neuen Antibiotika neben festen und flüssigen Trägersubstanzen enthalten.
Als Heilmittel können die neuen Antibiotika allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten
Hilfsstoffen verabreicht werden.
In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutert, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel 580 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 5 g Caseinpepton, 5 g MgSO4.7H2O, 2 g KH2PO4 3 g NaNO3, 0,5 g KCl, 0,01 g FeSO4 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit SO Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlö sung) t3 Tuge hei 27 inkubiert.
500 Liter Kulturbrühe werden mit dem Ultraturrax aufgeschlossen und mehrmals mit je 500 Liter 1,2-Dichloräthan extrahiert. Die organische Phase wird abgetrennt, über Na triumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Eindampfrückstand wird an der 100-fachen Menge Sephadex LH 20 mit Methanol chromatographiert. Die gegen Aspergillus niger aktiven Fraktionen werden vereinigt und das Gemisch an der 100-200-fachen Menge neutralem Aluminiumoxid (Aktivitätsstufe I) chromatographiert. Die Elution erfolgt mit Toluol dem 10-50% Aethylacetat zugesetzt ist. Es werden zuerst vorwiegend Nebenprodukte, dann S 7481/F-1 und anschliessend S 7481/F-2 eluiert.
Die Erkennung der Aktivstoffe in den Fraktionen erfolgt wieder durch Aktivitätsprüfung gegen Aspergillus niger; zur Reinheitskontrolle wird dünnschichtchromatographisch auf Kieselgelplatten mit Chloroform Methanol (96:4) geprüft, wobei die Antibiotika mit Joddampf sichtbar gemacht werden. Die reinen Fraktionen werden vereinigt und mit Hexan verrieben, wobei die Antibiotika S 7481/F-1 und S 7481/F-2 in Form eines weissen amorphen Pulvers anfallen, das im Hochvakuum bei 50 getrocknet wird.
Das neue AntibiotikumS 7481/F-1 hat folgende Eigenschaften:
Amorphes, farbloses Pulver vom Smp. 137-140 (Zers.); 20 20 = -2360(CHCl3,c=0,5)
D UV: siehe Fig. 1 IR: siehe Fig. 2 Protonen-NMR: siehe Fig. 3 t3C-NMR: siehe Tabelle Massen-Spektrum (CEC Massenspektrometer 21-1108,
Ionenquelle E.
B., Einlass-System: direkt, Elektronenenergie:
70 eV, lonenbeschleunigung: 4 kV, Temperatur Ionenquelle: 290 , Druck: 5.10-6 Torr, Peak-Matching-Verfahren, Refe renz-Substanz PCR 8 [Tris-pentadekafluorheptyl- 1,3,5 triazan, M= 1184, 9374]: Höchster Massen-Peak m/e =
1183,831 (#0,004), entsprechend der Masse des lons
C62H109N11O11, des Produktes der Eliminierung von Wasser aus dem genuinen Molekül C62H111N11O12. Löslichkeit: Leicht löslich in den meisten gebräuchlichen organischen Lösungsmit teln, praktisch unlöslich in Petroläther und Wasser.
Verhalten im Dünnschichtchromatogramm (Substanzflecken sichtbar gemacht mit Joddampf): a) Kieselgel auf Glasplatten; Chloroform +4% Methanol als Fliessmittel: Rf = 0,52.
b) Kieselgel auf Folien Polygram ; Hexan/Aceton 1:1 als
Fliessmittel: Rf=0,37; Chloroform/Aceton 2:1 als Fliessmittel:
Rf=0,34.
Elementaranalyse (Probe in Benzol gelöst, Lösung zur
Trockene eingedampft, Rückstand im Hochvakuum 5 Stunden bei 1000 getrocknet): Gefunden C 61,8 H 9,4 N 13,00 15,7% Die @e gefundenen Werte stehen in Übereinstimmung mit der
Bruttoformel C62H111N11O12.
Im Hydrolysat, das man durch Kochen der Verbindung
S 7481/F-1 mit 6 N Salzsäure erhält (20 Stunden), können die
Aminosäuren Alanin, α-Aminobuttersäure, N-Methylleucin,
N-Methylglycin und Valin nachgewiesen werden.
Das neue Antibiotikum S 7481/F-2 hat folgende Eigen schaften:
Amorphes, farbloses Pulver vom Smp. 127-130 (Zers.); [α]D20 = -243 (Chloroform, c=0,5)
UV: siehe Fig. 4 lR: siehe Fig. 5
Protonen-NMR: siehe Fig. 6 Massen-Spektrum (Aufnahmebedingungen siehe Antibiotikum
S 7481/F-1):
HöchsterMassen-Peakm/e = 1169,815 (l0,006), entsprechend der Masse des Ions C61H107N11011, des Produktes der Eliminierung von Wasser aus dem Molekül C61H109N11o12.
Löslichkeit: Leicht löslich in den meisten gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln; praktisch unlöslich in Petroläther und Wasser.
Verhalten im Dünnschichtchromatogramm (Substanzflekken sichtbar gemacht mit Joddampf): a) Kieselgel auf Glasplatten; Chloroform +4% Methanol als Fliessmittel: Rf=0,46 b) Kieselgel auf Folien Polygram ; Hexan/Aceton 1:1 als Fliessmittel: Rf=0,28; Chloroform/Aceton 2:1 als Fliessmittel: Rf=0,26.
Elementaranalyse (Probe 5 Stunden im Hochvakuum bei 100" getrocknet): Gefunden C 61,7 H 9,1 N 13,1 0 16,5%.
Die gefundenen Werte stehen in Übereinstimmung mit der Bruttoformel C6tH1ogN11012-
Die als Ausgangsmaterial verwendete Vorkultur wird wie folgt erhalten:
Die zur Beimpfung verwendete Sporen- und Mycelsuspension wird aus einer Kultur des ursprünglich isolierten Stammes NRRL 8044 hergestellt, welche 21 Tage bei 27 auf einem Agarmedium, das pro Liter 20 g Malzextrakt, 20 g Agar, 4 g Hefeextrakt und entmineralisiertes Wasser enthält, gezüchtet wird. Die Sporen und das Mycel dieser Kultur werden in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.
Mit dieser Suspension werden 50 Liter einer Nährlösung, die die gleiche Zusammensetzung hat wie der 500-Liter Stahlfermenter, angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (200 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 3 Tage bei 27 inkubiert. Diese Fermentationslösung dient als Impfmaterial für den 500-Liter-Stahlfermenter.
Tabelle 13C-Spektrendaten von S 7481/F-1; 250 mg in 1,5 ml CDCI3 Bruker HX-90E; Sweep-width 6000 Hz Adresse Frequenz [Hz] 6 [ppm] Intensität 1260 3915.5273 173.0237 184 1264 3909.6679 172.7648 192 1293 3867.1875 170.3876 91 1299 3858.3984 170.4992 215 1312 3839.3554 169.6577 207 1317 3832.0312 169.3341 268 1937 2923.8281 129.2014 220 1992 2843.2617 125.6412 225 2745 1740.2343 76.8994 20 2785 1681.6406 74.3102 165 3027 1327.1484 58.6455 187 Adresse Frequenz [Hz] b [ppm] Intensität 3042 1305.1757 57.6745 223 3047 1297.8515 57.3509 253 3051 1291.9921 57.0929 40* 3081 1248.0468 55.1501 844 3159 1133.7890 50.1011 172 3184 1097.1679 48.4828 566 3189 1089.8437 48.1592 276 3239 1016.6015 44.9227 206 3305 919.9218 40.6505 158 3327 887.6953 39.2264 192 3332 880.3710 38.9028 222 3357
843.7500 37.2845 167 3363 834.9609 36.8961 30* 3380 810.0585 35.7957 567 3387 799.8046 35.3426 304 3411 764.6484 33.7891 182 3449 708.9843 31.3294 167 3454 701.6601 31.0057 518 3475 670.8984 29.6464 544 3478 666.5039 29.4522 179 3486 654.7851 28.9343 310 3543 571.2890 25.2447 287 3549 562.5000 24.8563 631 3553 556.6406 24.5974 843 3566 537.5976 23.7559 1000 3574 525.8789 23.2381 762 3582 514.1601 22.7202 58* 3596 493.6523 21.8140 606 3607 477.5390 21.1020 231 3622 455.5664 20.1310 165 3628 446.7773 19.7427 254 3645 421.8750 18.6422 285 3650 414.5507 18.3186 314 3654 408.6914 18.0597 278 3658 402.8320 17.8007 277 3674 379.3945 16.7651 224 3688 358.8867 18.8588 202 3781 222.6562 9.8389 139 3933 0.0000 0.0000 111 - Tetramethylsilan Registrierte Signale von CDCl3 und höheren Rauschspitzen
Claims (1)
- PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung der neuen Antibiotika S 7481/F1 (Formel I) EMI4.1 und S 7481/F-2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen neuen Stamm der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams auf oder in einem Nährmedium züchtet und hierauf die neuen Antibiotika S 7481/F-1 und S 7481/F-2 aus dem Nährmedium isoliert und reinigt.UNTERANSPRUCH Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als neuen Stamm der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams den Stamm NRRL 8044 verwendet.
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| PL | Patent ceased |