CH619735A5 - - Google Patents

Description

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PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums S 7481/F-4 der Formel

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CH3 CHj dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm NRRL 8044 züchtet und das Antibiotikum S 7481/F4 aus der Kulturbrühe isoliert.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums S 7481/F-4 der Formel cu.

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Es ist aus der DOS Nr. 2 455 859 bekannt, dass man aus dem Pilzstamm NRRL 8044 pharmakologisch wirksame Metaboliten gewinnen kann. Es wurde nun gefunden, dass ein weiterer Metabolit S 7481/F-4 ein wertvolles Zwischenprodukt ist.

Das Antibiotikum S 7481/F4 ist verwendbar zur Herstellung von Dihydro-S 7481/F4. Letztere Verbindung zeichnet sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden.

Erfindungsgemäss gelangt man zum Antibiotikum S 7481/ F4, indem man einen Stamm NRRL 8044 züchtet und das Antibiotikum S 7481/F4 aus der Kulturbrühe isoliert.

Der Stamm NRRL 8044 ist in der DOS 2 455 859 beschrieben. Eine Kultur davon wurde beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, III. USA am 12. August 1974 unter der Nummer NRRL 8044 deponiert.

Die Züchtung des Stammes und die anschliessende Isolierung des Antibiotikums S 7481/F4 kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen.

In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

Beispiel

500 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 5 g Caseinpepton, 5 g MgS04- 7H20,2 g KH2PO4,3 g NaN03,0,5 g KCl, 0,01 g FeS04 und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/MinVLiter Nährlösung) 13 Tage bei 27° inkubiert (siehe DOS 2 455 859).

Durch Zentrifugieren wird aus der Kulturbrühe das Mycel abgetrennt, dieses durch Verrühren unter gleichzeitigem Auf-schliessen im Ultraturrax mit 150 Liter Methanol-Wasser (9:1) extrahiert und diese Operation nach jeweiligem Abtrennen des festen Materials durch Zentrifugieren noch zweimal wiederholt. Die vereinigten methanolischen Extraktlösungen werden im Vakuum bei 30-40° unter Zugabe von 50 Liter Wasser soweit konzentriert, dass das Methanol praktisch abdestilliert ist, worauf das zurückbleibende wässrige Gemisch dreimal mit dem gleichen Volumen Äthylenchlorid extrahiert und die vereinigte Äthylenchloridlösung, nach Waschen mit wenig Wasser, zur Trockene eingedampft wird.

Das nach Abtrennung des Mycels anfallende Kulturfiltrat wird ebenfalls dreimal mit dem gleichen Volumen Äthylenchlorid extrahiert, und der Rückstand der vereinigten eingedampften und mit wenig Wasser gewaschenen Äthylenchloridlösungen mit dem Extraktrückstand aus dem Mycel vereinigt.

Der gesamte Extraktrückstand wird zur Entfettung in der

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Weise zwischen Petroläther und Methanol-Wasser (9 :1) verteilt, dass er nach Lösen in 5 Liter Methanol-Wasser (9 :1) mit 3x je 5 Liter Petroläther (Siedepunkt 30-40°), die sich in drei Glasausrührgefässen befinden, gerührt wird, worauf die drei Petrolätherphasen hintereinander noch zweimal mit je 5 Liter Methanol-Wasser (9:1) extrahiert werden. Zu den vereinigten methanolischen Lösungen gibt man 6 Liter Wasser und konzentriert das Gemisch im Vakuum bei 30-40° auf ein Volumen von 4 Liter. Das wässrige Konzentrat extrahiert man durch viermaliges Ausschütteln mit je 4 Liter Äthylenchlorid; die Äthylenchloridlösungen werden mit je 1 Liter Wasser gewaschen, vereinigt und bei 30-40° im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Eindampfrückstand wird an der lOfachen Menge Sephadex LH-20 mit Methanol Chromatographien. Die gegen Aspergillus niger aktiven Fraktionen werden vereinigt und an der 20fachen Menge Kieselgel (Teilchengrösse 0,2-0,5 mm) chromatographiert. Als Durchlaufflüssigkeit wird vorerst Chloroform mit einem Zusatz von 1% Methanol verwendet, wobei ausser inaktiver Begleitsubstanz die Antibiotika 7481/F-l und 7481/F-2 aus der Säule eluiert werden. Die Elution der Substanz 7481/F4 erfolgt mittels anschliessender Anwendung von Chloroform mit 2% und darauf mit 5% zugesetztem Methanol. Ihr Nachweis in den Eluatfraktionen erfolgt mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie, wobei sie einen wesentlich niedrigeren RrWert aufweist als die beiden erstgenannten Substanzen, z. B. auf Silicagel-Fertigfolien «Polygram» mit Chloroform-Methanol (95 :5) als Fliessmittel, Rf = 0,26 (Rf von 7481/F-l 0,44, von 7481/F-2:0,37). Nach Vereinigung und Eindampfen der Eluatfraktionen, die nach der dünnschichtchromatographi-schen Prüfung ganz oder vorwiegend aus 7481/F4 bestehen, wird die chromatographische Reinigung wiederholt unter Verwendung der 80fachen Menge Silicagel und von Chloroform mit 2%, und darauf von Chloroform mit 4% Methanol als Durchlaufflüssigkeit. Die Eluatfraktionen werden wie oben im Dünn-schichtchromatogramm auf ihre Zusammensetzung geprüft und diejenigen von ihnen, die ganz aus 7481/F4 bestehen, vereinigt und im Vakuum bei 20-40° zur Trockene verdampft. Den Rückstand behandelt man nach Lösen in der lOfachen Menge Alkohol mit 5 Gewichtsprozent Aktivkohle, dampft nach dem Abfiltrieren der Kohle das Filtrat bei 20-40° im Vakuum ein und trocknet den Rückstand im Hochvakuum bei 55°.

Der letzte Reinigungsschritt besteht darin, dass man den Rückstand in der 5fachen Menge Äther löst und durch langsames Zufügen der 30fachen Menge Hexan unter Schütteln die feste Substanz ausfällt und sie nach Abkühlen des Gemisches auf 0 bis 5° abfiltriert, mit kaltem Hexan wäscht und im Hochvakuum bei 55° trocknet.

Amorphes, farbloses bis leicht gelbliches Pulver, das bei ca. 151-156° unter Zersetzung schmilzt.

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