**ATTENTION** debut du champ DESC peut contenir fin de CLMS **.
REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un antibiotique dit TM-743, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la souche de microorganisme Bacillus circulans TM-743 (FERM-P- No. 2633) dans un milieu de culture, à extraire le TM-743 ainsi produit à partir du milieu de culture, sous forme d'une solution, et à séparer le TM-743 de la solution d'extrait.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le
Bacillus circulans TM-743 est cultivé dans un milieu de culture aqueux contenant des sources de carbone et d'azote assimilables, à une température de 30-350C, pendant 72120 heures.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue l'extraction de l'antibiotique TM-743 à l'aide d'un alcool inférieur non miscible à l'eau.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le
TM-743 est séparé de la solution extraite par évaporation sous vide du solvant d'extraction.
La présente invention a pour objet un procédé de fabrication d'un antibiotique dit TM-743, en cultivant une souche de
Bacillus circulans TM-743 (FERM-P No. 2633).
Comme antibiotiques qui sont fortement efficaces contre les bactéries Gram-négatives et qui ont une faible toxicité, les substances suivantes ont été préalablement mises au point ou utilisées en pratique: la colistine: J. Biochem, 54, 25 (1963), la polymyxine: Antibiotics, 2, 255 (1967), la circuline: Experientia, 24, 656 (1968), la polypeptine: J. Biol. Chem., 198,405 (1952) le produit dit BN-7: Demande de brevet japonais
no. 56 895/7 et le produit dit EM-49: J. Antibiotics, 26,444 (1973).
Ces antibiotiques sont des substances de la série des polypeptides et, plus particulièrement, certains de ces antibiotiques
sont appelés antibiotiques du type polymyxine en se basant sur
leurs constituants d'aminoacides et d'acides gras.
Ces antibiotiques possèdent la thréonine en tant qu'un de
leurs constituants d'aminoacides, sauf le produit dit EM-49 qui
est produit par une souche de Bacillus circulans.
L'antibiotique dit TM-743, est également produit par un
microorganisme du groupe des Bacillus circulans et il lui man
que la thréonine. En outre, le TM-743 a les mêmes consti
tuants d'aminoacides que le EM-49, c'est-à-dire qu'il contient
de l'acide 2,4-diaminobutyrique, de la leucine et de la phényla
lanine suivant un rapport moléculaire de 5:2:1. Cependant,
leurs constituants d'acides gras diffèrent. Ainsi le TM-743
contient des acides gras en C8 et Cs, alors que l'EM-49 con
tient des acides gras en Cio et Cl respectivement. En consé
quence, on peut dire que l'antibiotique, dit TM-743, est une
nouvelle substance.
Il s'est avéré que cet antibiotique possède
une forte activité antibactérienne contre des microorganismes
pathogènes, particulièrement contre les bactéries Gram-négati
ves.
La présente invention vise notamment à fournir un procédé
pour la production de l'antibiotique dit TM-743 avec une
grande pureté.
L'antibiotique dit TM-743 peut être obtenu sous forme de
son chlorhydrate constitué par une poudre blanche.
Le TM-743 est un genre d'antibiotique de la série des poly
peptides, plus spécifiquement il peut être appelé antibiotique
du type polymyxine.
La souche de microorganismes, appartenant au Bacillus circulans et produisant l'antibiotique TM-743, a été isolée à partir d'un échantillon de sol et a été désignée par Bacillus circulans TM-743 (ATCC no 31 154) par la titulaire.
La présente invention sera maintenant décrite en relation avec les dessins ci-joints dans lesquels:
La fig. 1 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet du chlorhydrate de TM-743 dans le méthanol.
La fig. 2 représente le spectre d'absorption dans l'infrarouge du chlorhydrate de TM-743 avec une tablette de KBr; et
la fig. 3 représente le spectre de résonance magnétique nucléaire du chlorhydrate de TM-743 dans le diméthylsulf oxyde-di.
L'antibiotique dit TM-743 est préparé par culture, dans des conditions contrôlées, d'une nouvelle souche de Bacillus circulans qui a été identifiée selon Manual of Determinative Bacteriology de Bergey, 7ème édition, et Handbook of Microbiology, volume 1 (publié par A. I. Laskin et H. A. Lechevalier).
Les propriétés microbiologiques de la nouvelle souche, le
Bacillus circulans TM-743 (ATCC no. 31 154), sont les suivantes:
1. Caractéristiques au microscope
1) Cellules végétatives: tiges à extrémités rondes, 0,81,0 sur 3-7 microns (en moyenne 0,9 sur 4,5 microns); motilité active; une chaîne n'est pas formée, aérobies, de manière facultative anaérobies; Gram-négatives; non résistantes vis-àvis des acides.
2) Spores: ellipsoïdales; 0,7 à 0,1 sur 1,2 à 1,5 micron (en moyenne 0,8 sur 1,3 micron); placés centralement ou paracentralement.
3) Sporanges: gonflés et en forme de fuseau.
2. Caractéristiques de colonies
Croissance sur de l'agar-agar nutritif contenant un extrait de viande, de la peptone et NaCI: une lente expansion est observée. La colonie isolée est de dimension petite ou moyenne et non ronde (rebord non entier); colonie mince, translucide ou transparente, lustrée et fortement visqueuse.
3. Croissance sur certains milieux typiques
1) Agar-agar nutritif avec du glucose: plus importante que sur de l'agar-agar nutritif normal.
2) Bouillon nutritif: Mauvais aspect trouble, mais une pellicule épaisse et visqueuse se forme. Riche sporulation dans la pellicule.
3) Agar-agar-soja-produit dit Trypto, contenant de la tryptone, de la peptone de soja et du NaCI, agar-agar-jus de tomate contenant du jus de tomate, de la peptone et du lait peptonisé ou agar-agar-dextrose-pomme-de-terre: ordinairement pas de croissance.
4. Propriétés physiologiques
1) Hydrolyse de l'amidon +
2) Utilisation de: Caséine +
Citrate
Azote minéral
3) Formation de: Catalase +
Uréase +
Oxydase +
Indole +
Dihydroxyacétone
Pigment
H2S
Acétoïne (test de Voges-Proskauer)
4) Liquéfaction de la galatine +
5) Réduction de nitrates +
6) Coagulation de la caséine +
7) Rougissement de: Lait de tournesol +
Rouge méthyle
8) Acide à partir de: Amidon +
Lactose +
Glucose +
Galactose +
Mannitol
Arabinose
Xylose
Fructose
Saccharose
Inositol
Glycérol 9) Gaz à partir d'hydrates de carbone
10) Température de croissance 20-37"C 11) Croissance: dans NaCI à 7%
à pH 5,7
Ces caractéristiques de la présente souche sont semblables à celles du Bacillus polymixa, du Bacillus circulans, du Bacillus alvei, du Bacillus macerance et du Bacillus stearothermophilus selon Manual of Determinative Bacteriology de Bergey,7ème édition, et Handbook of Microbiology, volume 1 (par A. I.
Laskin et collaborateurs). Spécialement, elle ressemble intimement au Bacillus circulans par diverses propriétés morphologiques et physiologiques. Il y a cependant, une légère différence entre les deux microorganismes, c'est-à-dire que le Bacillus circulans produit de l'acide à partir d'arabinose et de xylose.
D'après ces caractéristiques, on conclut que la présente souche appartient à l'espèce Bacillus circulans et, ainsi, cette souche a été désignée par Bacillus circulans TM-743.
Cette souche a été déposée au Fermentation Research
Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Image,
Chiba City, Japon, sous la désignation FERM-P-2633, le 9 juillet 1974, et à l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique, sous la désignation
ATCC no. 31154.
L'antibiotique TM-743 peut être ordinairement obtenu en inoculant la souche de Bacillus circulans TM-743 dans un bouillon nutritif, en cultivant cette souche par le procédé de culture par secouage et en séparant l'antibiotique TM-743 ainsi produit du bouillon de culture. Cette séparation est réalisée en extrayant le TM-743, sous forme de solution, à partir du milieu de culture, et ensuite en séparant le TM-743 de la solution d'extrait.
Le bouillon nutritif pour cultiver la souche TM-743 contient des sources d'azote et de carbone assimilables et certains éléments peu importants. L'amidon, le glycérol et divers genres de saccharides peuvent être utilisés comme sources de carbone.
Surtout, le glucose et le saccharose sont ordinairement utilisés.
La peptone, des aminoacides, la caséine, de la farine de poisson et de la farine de soja peuvent être utilisés comme sources d'azote. Un extrait de viandé, un extrait de levure, de la liqueur de maïs macéré, et d'autres extraits d'origines végétales et animale peuvent être utilisés comme éléments peu importants. Des lipides, des graisses, des huiles et divers composés d'azote minéral peuvent être aussi utilisés de manière subsidiaire. Dans certains cas, on peut également employer des sels minéraux tels que le chlorure de sodium et le carbonate de calcium. Une résine de silicone peut être ajoutée, si cela est nécessaire, comme agent s'opposant à la formation de mousse.
La solution de milieu est neutralisée avant la stérilisation par passage à l'autoclave à 1200C pendant 15 minutes. La culture est réalisée à 30-350C avec aération. Le développement de cellules bactériennes est plutôt lent et la substance active, la TM-743, apparaît à l'extérieur des cellules après environ 50 heures à partir de l'inoculation. La production maxima de la substance dite TM-743 est ordinairement obtenue après 72-120 heures dans le milieu de culture.
Après la culture, les cellules bactériennes sont retirées par centrifugation et la partie surnageante est chargée sur des résines échangeuses de cation, telles que celles dite Amberlite
IRC-50, et éluées avec un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou un mélange d'un solvant organique soluble dans l'eau et d'un acide minéral. L'éluat contenant la substance active est décoloré par du charbon activé et concentré sous vide. La substance active peut être aussi extraite de la partie surnageante du bouillon ou de l'éluat avec un alcool inférieur non miscible avec l'eau, tel que le n-butanol. L'extrait est alors concentré sous vide et additionné d'un solvant organique tel que l'acétone pour obtenir le précipité de la substance recherchée. Le séchage du précipité sous vide donne une poudre brute de la substance recherchée.
La poudre brute peut être en outre purifiée par une combinaison efficace de filtration par du gel sur le produit dit Sephadex, la chromatographie avec échange d'ions sur de la carboxyméthylcellulose, la chromatographie sur colonne sur du gel de silice et par un procédé de distribution à contre-courant. Par exemple, l'éluat actif passant à travers le produit dit Sephadex
LH-20 avec de l'eau est concentré, réglé à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique et additionné d'acétone. Le précipité résultant est rassemblé par centrifugation et séché sous vide pour donner le chlorhydrate de TM-743 sous forme de poudre blanche.
La poudre obtenue, le chlorhydrate de TM-743, présente les propriétés physicochimiques suivantes:
1. Valeurs d'analyse élémentaire
C H N Cl 49,31% 8,19% 14,57% 12,10%
2. Point de fusion 2002200C (coloration brunâtre)
3. Pouvoir rotatoire optique [a] j'z3= -52" (C = 1%,eau)
4. Spectre d'absorption dans l'ultraviolet (fig. 1)
La solution méthanolique de l'antibiotique présente les maxima d'absorption suivants (E'lcm) : 251 m- 1,69, 257 mll- 1,85, 263 m- 1,46 et 266 mF (0,94) (épaulement)
5.
Spectre d'absorption dans l'infrarouge (fig. 2)
Le spectre d'absorption dans l'infrarouge déterminé avec une tablette de KBr présente des bandes caractéristiques à 3400, 3220, 3030, 2960, 1640-1650, 1520-1540, 1465, 1440, 1385, 1370, 1330, 1280, 1240, 1170, 1080, 1030, 920, 865, 745 et 700 cm-l.
6. Spectre de résonance magnétique nucléaire (fig. 3)
Le spectre de résonance magnétique nucléaire, à 60 MHz, du chlorhydrate de TM-743 dans une solution de diméthylsulf oxyde-ds présente les signaux caractéristiques suivants à o4,0- 4,9 (8H, - NCHCO), 728 (5H,C6Hs) et 7,5-9,2 (-NH3+ et -CONH-).
7. Solubilité
Soluble dans l'eau, dans le méthanol, dans l'éthanol, dans le n-butanol contenant de l'eau et dans le diméthylsulfoxyde mais insoluble dans l'acétate, dans l'acétate d'éthyle, dans le chloroforme, dans l'éther éthylique, dans le benzène et dans l'éther de pétrole.
8. Réaction colorée
Réactions positives avec la ninhydrine et le biuret
9. Composition
Une comparaison par chromatographie sur papier et une analyse quantitative des aminoacides de l'hydrolysat de chlorhydrate de TM-743 avec de l'acide chlorhydrique 6N, à 105 C, pendant 6 heures avec certains échantillons authentiques indiquent l'existence d'acide 2,4-diamino-butyrique, de leucine et de phénylalanine suivant le rapport moléculaire 5:2:1.
L'hydrolyse du chlorhydrate de TM-743 avec de l'acide chlorhydrique 6N à 90OC pendant 30 minutes fournit, en plus d'un mélange d'aminoacides, une fraction huileuse non miscible, qui peut être séparée de la solution hydrolysée par extraction avec de l'éther. La solution éthérée est traitée par un excès de diazométhane à la température ambiante. Le mélange résultant est examiné par chromathographie en phase gazeuse sur une colonne d'acier inoxydable (1000 mm x 3 mm) remplie de 15% du produit dit PEGS (traité par le produit dit Chromosorb W-AW passant au tamis dont l'ouverture de maille est 0,177 à 0,149 mm soit 80 à 100 mesh), He gazeux étant utilisé comme gaz porteur à 1 kg/cm2. Deux pics substantiels, avec un temps de rétention de 3,6 et 5,2 minutes, respectivement sont détectés.
La spectrométrie de masse révèle des pics de masses maxima (M+-H20) pour m/e = 156 pour le premier pic de chromatographie en phase gazeuse et m/e = 170 pour le dernier pic. Les pics d'ions fragmentaires des deux composants m/e = 82 et 96 sont considérés comme étant M+- (H20 +
CH2 = C (OH) OCH3). En conséquence, on peut éventuellement dire que les deux composants sont des esters méthyliques d'acides gras ss-hydroxylés. Ultérieurement, l'analyse couplée par chromatographie en phase gazeuse et une spectrométrie de masse des esters méthyliques triméthylsilylés révèlent les pics de masse maxima m/e = 231 et 254.
De plus, un pic d'ion fragmentaire commun pour les deux composants de chromatographie en phase gazeuse est détecté pour m/e = 175 et on estime que c'est le fragment à terminaison carboxylique dérivé de la scission entre le carbone ss et le carbone y de ces composants. En outre, deux pics d'ions fragmentaires sont également détectés pour m/e = 173 et 187, respectivement dont on estime que ce sont les fragments y-terminaux dérivés de la coupure entre le carbone a et le carbone ss.
D'après ces faits, on peut conclure que les acides gras contenus dans le TM-743 sont CsHllCH(OH)CH2COOH et C6Hl3CH(OH)CH2COOH. Le rapport des teneurs de ces acides gras diffère pour chaque lot d'échantillon de TM-743, alors que la teneur en acides ras totale conserve une bonne valeur constante par rapport à la teneur en aminoacides. Ceci peut suggérer que l'antibiotique TM-743 est constitué de deux composants, qui sont identiques au point de vue constituants d'aminoacides mais qui diffèrent légèrement au point de vue des constituants d'acides gras.
L'antibiotique constitué par le chlorhydrate de TM-743 présente une bonne activité antibactérienne contre des microorganismes pathogènes, spécialement contre les bactéries
Gram-négatives. Ainsi, ordinairement le chlorhydrate de TM743 présente une activité suffisante contre diverses souches de
Pseudomonas, comprenant des souches isolées par voie clinique, à une concentration de 1,6 à 6,25 11 g/ml. De plus, son activité élevée contre l'Escherichia coli résistant à la polymyxine B est le point le plus remarquable. De nombreuses bactéries Grampositives, de nombreuses levures et de nombreux champignons sont également fortement sensibles à cet antibiotique.
L'activité antibactérienne a été déterminée par le procédé suivant: divers microorganismes ont été inoculés dans des plaques d'agar-agar-infusion de coeur (ou, partiellement, milieu de Sabouraud) contenant l'antibiotique formé par le chlorhydrate de TM-743 suivant des concentrations graduelles et la concentration minima pour laquelle la croissance des microbes a été totalement inhibée a été déterminée. Le spectre antibactérien de l'antibiotique TM-743 ainsi obtenu est présenté dans le tableau suivant.
La toxicité aiguë (DL5o) du chlorhydrate de TM-743 vis-àvis des souris, par injection intraveineuse, était 16 mg/kg.
Tableau
Spectre antibactérien du TM-743
Microorganismes testés Concentration
minima d'inhibi-
tion (!lg/ml)
Escherichia coli 055 6,25
E. Coli B 1,6
E. Coli SC 8600 (résistant à la polymyxine B) 3,2
Klebsiella pneumoniae 6,25
Proteus vulgaris HX-19 > 100
Pseudomonas aeruginosa 171-3 1,6
Ps. aeruginosa GNB 1-1 1,6
Ps. aeruginosa GNB 1-2 3,2
Ps. aeruginosa GNB 1-3 6,25
Ps. aeruginosa GNB 1-4 6,25
Ps. aeruginosa KB-1 3,2
Ps. aeruginosa P-32 6,25
Ps. fluorescens ATCC 27 6.25
Ps. ovalis IAM 1236 12,5
Salmonella enteritidis 6,25
Shigella sonnei 6,25
Staphylococcus aureus 209 P 25
St. aureus Smith 12.5
Bacillus subtilis PCI 219 12.5 Micrococcus lysodeikticus 0,8
Candida albicans 25
Les exemples suivants présentent des procédés pratiques pour réaliser le présent antibiotique, sans aucune limitation.
Exemple 1
Le Bacillus circulans TM-743, conservé sur une partie inclinée d'agar-agar-infusion de coeur, a été inoculé dans un bouillon d'infusion de cceur traité à l'autoclave, en quantité de
100 ml dans un ballon de Sakaguchi de 500 ml bouché par du coton. Après 24 heures de culture sur un agitateur à mouvement de va-et-vient à 30 C, 5 ml de la culture ont été retirés et placés dans un ballon de Sakaguchi de 2 litres, bouché par du coton, contenant 500 ml du bouillon traité à l'autoclave à ph 7, qui se composait de 20 g de glycérol, de 5 g de farine d'avoine, de 7,5 g de peptone, de 1,25 g d'extrait de levure, de 2 g de
NH4CI, de 2,5 g de CaCO et d'eau distillée pour remplir jusqu'à 500 ml.
La culture a été réalisée sur un agitateur à mouvement de va-et-vient, pendant 120 heures à 300C.
Exemple 2
10 litres du bouillon cultivé obtenu dans l'exemple 1 ont été centrifugés pour retirer les cellules bactériennes. La partie surnageante à pH 7,0-7,4 a été introduite dans une colonne de 200 ml de produit dit Amberlite IRC-50, de type H+, lavée à l'eau distillée et éluée avec HCl 0,2N. Les fractions actives ont été neutralisées à travers le produit dit Amberlite IR-45 (type
OH-), décolorées avec 1 % (en poids/volume) du produit dit
Norit A, et concentrées jusqu'à 60 ml sous vide, en dessous de 500C. Par addition de 900 ml d'acétone au concentré, le préci pité de la substance active a été obtenu. Le précipité a été rassemblé par centrifugation et séché sous vide. On a obtenu environ 4 g de poudre brute de TM-743.
Exemple 3
1 gramme de la poudre brute du produit TM-743 obtenu dans l'exemple 2 a été dissous dans 10 ml d'eau distillée et soumis à une filtration sur du gel, à travers une colonne de 2 litres du produit dit Sephadex LH-20 avec de l'eau distillée. La substance active a été éluée en plusieurs fractions au point correspondant à environ 1,3 litre. L'activité des fractions a été vérifiée par la réaction à la ninhydrine et par un test microbiologique. Pour confirmer la pureté des fractions actives, la chromatographie sur couche mince a été réalisée sur du gel dit
Kiesel (Merck) avec la couche supérieure du mélange de nbutanol, d'acide acétique et d'eau (4:1:3).
Les fractions actives exemptes d'impuretés ont été concentrées en dessous de 50OC sous vide jusqu'à 10 ml, réglées à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique et additionnées de 150 ml d'acétone. Le précipité résultant a été rassemblé par centrifugation, lavé à l'acétone et à l'éther éthylique, successivement, et séché sous vide à 500C. On a obtenu environ 750 mg de poudre blanche amorphe de chlorhydrate de TM-743.