CH615661A5

CH615661A5 -

Info

Publication number: CH615661A5
Application number: CH294775A
Authority: CH
Inventors: Masahiko Fujino; Tsunehiko Fukuda; Susumu Shinagawa
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1974-03-08
Filing date: 1975-03-07
Publication date: 1980-02-15
Also published as: FR2262995B1; GB1498048A; ES435405A1; DK149862B; AU7859475A; NL7502564A; FR2262995A1; DE2509783C2; NO145691B; AT348693B; NL181658B; NL181658C; JPS5726506B2; SE7502520L; ZA751306B; CA1072953A; FI750682A7; US3972859A; NO145691C; DK149862C

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Decapeptidamiden der Formel:

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Ri-R2-R3-Arg-Pro-Gly-NH2 (I)

worin R, Tyr oder Phe, R2 D-Nle, D-Nva, D-Abu, D-Phe, D-Ser, D-Thr oder D-Met und R3 Leu, Ile oder Nie bedeuten. Diese neuen Verbindungen besitzen eine starke ovulationsin-duzierende Wirkung.

In der Beschreibung und den Patentansprüchen sind Aminosäuren und Peptide und ihre aktivierten Carboxyl- oder Schutzgruppen mit Abkürzungen bezeichnet, wie sie entweder auf dem betreffenden Fachgebiet gebräuchlich sind oder vom Committee on Biochemical Nomenclature 1UPAC-IUB vorgeschlagen wurden. Wenn nicht anders angeführt, weisen die Aminosäuren L-Konfiguration auf.

Folgende Abkürzungen wurden beispielsweise verwendet:

Abu:

a-Aminobuttersäure

Arg:

Arginin

BOC:

tert.-Butoxycarbonyl

Bzl:

Benzyl

DCC:

N,N' -Dicyclohexylcarbodiimid

Gly:

Glycin

His:

Histidin

HONB:

N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid

Ile:

Isoleucin

Leu:

Leucin

Nie:

Norleucin

Nva:

Norvalin

Met:

Methionin

OMe:

Methylester

OBzl:

Benzylester

ONB:

N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester

OSu:

N-Hydroxysuccinimidester

Phe:

Phenylalanin

Pro:

Prolin

(Pyr)Glu:

Pyroglutaminsäure

Ser:

Serin

Thr:

Threonin

Tos:

Tosyl

Trp:

Tryptophan

Tyr:

Tyrosin

Es ist seit Jahren bekannt, dass der Hypothalamus Faktoren enthält, welche auf höherer Ebene die Sekretion tropischer Hormone aus der Hypophyse regeln.

Nach der Isolation eines Thyrotropin freisetzenden Hormons (TRH), wurde ein Hormon, das luteinisierende Hormone freisetzt (LH-RH), in reiner Form aus Schweinen und Schafen extrahiert und als ein Decapeptid der folgenden Struktur identifiziert: (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. [A. V. Schally et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 43, 1334 (1971): R. Guillemin et al., Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 69, 278 (1972)]. Auf diese Erkenntnis folgte die Herstellung einer Anzahl ähnlicher Peptide; mit den analogen Peptiden wurden auch biologische Tests durchgeführt. Da jedoch die physiologische Wirksamkeit des Peptids selbst durch geringfügige Modifikationen in der oben angeführten Aminosäurezusammensetzung stark beeinträchtigt wird, muss die oben angeführte chemische Struktur als wesentlich für die Erzielung der maximalen physiologischen Wirksamkeit angesehen werden. [A. V. Schally et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 48, 366 (1972)].

Kürzlich veröffentlichten Monahan et al. in «Bioche-mistry», Band 12, Nr. 23, Seiten 4616 bis 4620 (1973), dass unter den von ihnen hergestellten LH-RH-Analogen wie z. B. [Ala6]LH-RH, [D-Ala6]LH-RH, [Val5]LH-RH, [D-Val6]LG-RH, [Pro6]LH-RH und [D-Pro6]LH-RH jene der Formel [D-Ala6]LH-RH die stärkste Wirksamkeit aufweist, nämlich 350 bis 450% der Wirksamkeit der Stamm-LH-RH-Verbindung. Die Literatur lehrt weiters, dass LH-RH-Analoge, die in Stellung 6 eine D-Aminosäure mit einer grösseren Anzahl von Seitenketten aufweisen als D-AIa, weniger wirksam sind als das Stammhormon. Trotz des oben angeführten Standes der Technik ist es gelungen, Polypeptide der Formel (I), in welchen die D-Aminosäure in Stellung 6 eine grössere Anzahl von Seitenketten aufweist als D-Ala, herzustellen und auf ihre LH-RH-Wirksamkeit zu testen. Dabei wurde überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäss hergestellten Polypeptide der Formel I um wenigstens 1000%

s io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

615 661

wirkungsvoller sind als ihre Stamm-LH-RH-Hormone. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Erkenntnissen.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von neuen Decapeptidamiden der Formel (I) mit starker ovulationsinduzierender Wirksamkeit.

Das Decapeptidamid der Formel (I) wird erfindungsgemäss hergestellt, indem man die zum Aufbau des Dekapeptids der Formel (I) nötigen Aminosäuren bzw. deren aktivierte Derivate gegebenenfalls unter intermediärem Schutz der von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven Gruppe in beliebiger zeitlicher Reihenfolge unter Bildung von Peptid-Bindungen miteinander kondensiert bzw. die Verbindung der Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R,-R2-R3-Arg-Pro-Gly-OH oder deren aktiviertes Derivat gegebenenfalls unter intermediärem Schutz der von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven Gruppen mit Ammoniak kondensiert, wobei in den genannten Ausgangsverbindungen anstelle des Pyroglutamylrestes auch der Rest R4OC—CH2-CH2-CH(NH2)-CO— stehen kann, worin R4 eine Alkoxy-, Aralkoxy- oder Aminogruppe bedeutet, welcher im Laufe des Verfahrens oder anschliessend daran zum Pyroglutamylrest ringgeschlossen wird.

Grundlegende Kombinationsmöglichkeiten der Reaktan-ten sind aus der nachstehenden Tabelle 1 ersichtlich.

Tabelle 1

Reaktant

(A)

(B)

Kombination

1

(Pyr)Glu-OH

H-His-Trp-Ser-Rj-Rj-

R3-Arg-Pro-Gly-NH2

2

(Pyr)Glu-His-OH

H-Trp-Ser-Ri-R2-R3-

Arg-Pro-Gly-NH2

3

(Pyr)Glu-His-Trp-OH

H-Ser-Ri-R2-R3-Arg-

Pro-Gly-NH2

4

(Pyr)Glu-His-Trp-

H-Ri-R2-R3-Arg-Pro-

Ser-OH

Gly-NH2

5

(Pyr)Glu-His-Trp-

H-R2-R3-Arg-Pro-

Ser-Ri-OH

Gly-NH2

6

(Pyr)Glu-His-Trp-

H-R3-Arg-Pro-Gly-

Ser-Ri-R2-OH

NH2

7

(Pyr)Glu-His-Trp-

H-Arg-Pro-Gly-NH2

Ser-Ri-R2-R3-OH

8

(Pyr)Glu-His-Trp-

H-Pro-Gly-NH2

Ser-Ri-R2-R3-Arg-OH

9

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-

H-Gly-NH2

R1-R2-R3-Arg-Pro-OH

10

(Pyr)Glu-His-Trp-

nh3

Ser-R1-R2-R3-Arg-

Pro-Cly-OH

Es ist auch bekannt, dass eine geschützte L-Glutamyl-gruppe der allgemeinen Formel (II)

R4CO-CH2CH2CH(NH2)CO- (II),

worin R4 eine Alkoxygruppe wie z. B. Methoxy, Äthoxy, n-Propoxy, iso-Propoxy, n-Butoxy od. dgl., eine Aralkyloxy-gruppe wie z. B. Benzyloxy od. dgl., oder Amin bedeutet, leicht in die L-Pyroglutamylgruppe der Formel

H

0^ KySiO-

durch in Kontaktbringen mit einer Base wie z. B. Ammoniak u. dgl. oder einer Säure wie z. B. Essigsäure od. dgl. umgewandelt werden kann und dass die Gruppe der Formel (II) in dieser Hinsicht der L-Pyroglutamylgruppe selbst äquivalent ist. Wenn das (Pyr)Glu- des Reaktanten (A) die Gruppe II darstellt, wird die Gruppe II leicht im Laufe des Verfahrens in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umgewandelt.

Die erfindungsgemässe Kondensationsreaktion kann nach für die Herstellung von Peptidbindungen bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispiele für solche Kondensationsverfahren sind das DCC/HONB-Verfahren (BE-PS 796 399), das Azidverfahren, das Chloridverfahren, das Säureanhydridverfahren, das gemischte Säureanhydridverfahren, das DCC-Verfahren, das Aktivesterverfahren, das des Woodward-Reagens K-Verfahrens, das Carbodiimidazolverfahren, das Oxidationsreduktionsverfahren und andere [vgl. The Peptides Band 1 (1966), Schröder und Lubke, Academic Press, New York, USA],

Vor der Kondensation können die Carboxyl- und Amino-gruppen, welche an der beabsichtigten Reaktion nicht teilnehmen sollen, geschützt werden oder die an der Reaktion teilnehmenden Carboxyl- und/oder Aminogruppen nach an sich bekannten Verfahren aktiviert werden. Die Carboxylgruppen in den Ausgangsstoffen können in Form von Metallsalzen (z. B. Natrium- und Kaliumsalzen) oder von Estern (wie z. B. Methyl, Äthyl, Benzyl, p-Nitrobenzyl, tert.-Butyl- oder tert.-Amylestern) geschützt werden.

Als Schutzgruppen für die Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien sind alle bei der Herstellung der Peptide gebräuchlichen Schutzgruppen für Aminogruppen, wie z. B. die Benzyloxycarbonyl-, tert.-Butoxycarbonyl-, Isobornyloxy-carbonylgruppen geeignet. Die Iminogruppe des Histidins kann durch jede herkömmliche Schutzgruppe wie z. B. die Benzyl-, Tosyl-, 2,4-Dinitrophenol-, tert.-Butoxycarbonyl-oder Carbobenzoxygruppe geschützt werden. Die Hydroxylgruppe des Serins kann durch jede herkömmliche Schutzgruppe wie z. B. die Benzyl-, tert.-Butylgruppe und andere ätherbildende Gruppen geschützt werden. Die Hydroxylgruppe des Tyrosins kann mit der Benzyl-, tert.-Butyl- und anderen ätherbildenden Gruppen, die Guanidinogruppe des Arginins mit Gruppen wie z. B. die Nitro-, Tosyl-, Carbo-benzoxy-, Isobornyloxycarbonyl- oder Adamantyloxycarbonyl-gruppe geschützt werden. Als Beispiele für aktivierte Carboxylgruppen in den Ausgangsmaterialien seien das entsprechende Säureanhydrid, Azid oder aktive Ester [d. h. Ester mit Alkoholen wie z. B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethylalkohol, p-Nitrophenol, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, N-Hydroxysuc-cinimid, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxybenztriazoll, genannt. Die aktivierten Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien können z. B. das entsprechende Phosphorsäureamid sein.

Aus der nachstehenden Tabelle sind Beispiele für Kombinationen solcher Formen von Carboxyl- und Aminogruppen in den Produkten (A) und B) ersichtlich.

Tabelle 2

Beispiele Ausgangsmaterialien für Kombi- (A) (B)

nationen COOH NH2 COOH NH2

1* frei geschützt geschützt frei

2 aktiviert geschützt frei frei

3 frei geschützt geschützt aktiviert

Anmerkung: In dem mit * bezeichneten Fall liegt im Reaktionssystem vorzugsweise ein Dehydratisierungsmittel wie z. B. ein Carbodiimid wie Dicyclohexylcarbodiimid vor. Eine Ausführungsform der Erfindung mit vorangehender Ausgangsstoffherstellung ist im nachstehenden Reaktionsschema dargestellt.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

615 661

(Pyr)Glu-His-Trp + Ser-Ri-Schutzgruppe

Kondensation (z. B. DCC/HONB) (Pyr)GIu-His-Trp-Ser-Ri-Schutzgruppe

Entfernung einer Schutzgruppe (z. B. katalytische Reduktion mit Pd Katalysator)

no2

Z-R2-R3-Arg-Pro-Gly-NH2

Entfernung einer Schutzgruppe (z. B. in Gegenwart von HBr)

(Pyr) Glu-His-Trp-S er-Ri no2

R2 -R3 - Arg-Pro- Gly-NH2

Kondensation (z. B. in Gegenwart von DCC/HONB oder DCC/l-Hydroxybenztriazol)

NO,

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1-R2-R3-Arg-Pro-Gly-NH2

Entfernung einer Schutzgruppe (z. B. in Gegenwart von SnCl2 in Ameisensäure-Wasser, katalyti-scher Reduktion mit einem Pd Katalysator oder HF)

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1-R2-R3-Arg-Pro-Gly-NH2

Diese Reaktion kann in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt werden. Das Lösungsmittel kann das gleiche sein wie es bei Peptidkondensationsreaktionen verwendet wird, z. B. können wasserfreies oder wässeriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Dichlorme-than, Tetrahydrofuran sowie geeignete Mischungen solcher Lösungsmittel als Beispiele angeführt werden.

Die Reaktionstemperatur liegt innerhalb eines Bereichs, welcher als für Reaktionen zur Peptidbindungsbildung geeignet bekannt ist, d. h. gewöhnlich innerhalb eines Bereichs von etwa —20 bis etwa 30° C. Die Precursorprodukte (die geschützten Peptide) der erfindungsgemäss herzustellenden Verbindungen können leicht nach dem Festphasensynthese-verfahren hergestellt werden.

Nach Beendigung der Kondensationsreaktion können die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen nach bekannten Verfahren entfernt werden. Als Beispiele hiefür seien katalytische Reduktionen in Gegenwart eines Katalysators wie Palladiumschwarz, Palladium auf Kohle, Platin od. dgl., Solvolyse mittels Fluorwasserstoff, Trifluoressigsäure od. dgl., und Reduktion mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak genannt.

Das so hergestellte Peptid der Formel (I) kann aus dem Reaktionsgemisch nach an sich für die Gewinnung von Peptiden bekannten Verfahren wie z. B. Extraktion, Verteilung, Säulenchromatographie u. dgl. gewonnen werden.

Die erfindungsgemässe Reaktion kann nach jedem an sich bekannten herkömmlichen Festphaseverfahren durchgeführt werden.

Das Peptid der Formel (I) kann auch in Form eines Salzes oder einer Metall-Komplexverbindung gewonnen werden.

Als Säuren, die mit den Peptiden der Formel (I) Salze bilden, seien anorganische Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Rhodanwasserstoff-säure, Schwefelsäure, Phosphorsäure u. dgl. und organische Säuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glycol-säure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranylsäure, Zimtsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanylsäure genannt.

Beispiele für Metalle, die mit den Peptiden der Formel (I) Metall-Komplexverbindungen bilden können, sind wie oben

30

35

45

50

55

60

65

Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen. Derartige Metall-Komplexverbindungen können nach herkömmlichen Verfahren wie z. B. Umsetzen des Peptides der Formel (I) mit dem Hydroxid oder Oxid eines der vorstehend angeführten Metalle bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 8 hergestellt werden.

Die erfindungsgemäss hergestellten Polypeptide der Formel (I) besitzen LH-RH-Wirkung (d. h., sie setzen ein luteinisierendes Hormon frei) und fördern daher die Sekretion von luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem Hormon (FSH). Die Polypeptide der Formel (I) sind daher für die Verwendung zur Förderung der Ovulation bei Frauen und Tieren wie z. B. Ratten, Schafen, Schweinen, Kühen, Stuten, Wachteln oder Hühnern geeignet, sie können auch für andere pharmazeutische Zwecke, für welche bisher herkömmliche LH-RH, LH und FSH-Präparate eingesetzt worden sind, verwendet werden.

Da die LH-RH-Wirkung der Polypeptide der Formel (I) etwa 10- bis 25mal stärker ist als die LH-RH-Wirkung der in der Natur vorkommenden Verbindungen, kann ihre Dosierungsmenge für jede Anwendung auf der Basis dieses Vielfachen ermittelt werden, wobei auch andere Faktoren (wie z. B. der Empfänger der Verabreichung oder die Art der Krankheit) in Betracht zu ziehen sind. So kann z. B. eine geeignete Dosierungsmenge innerhalb eines Bereiches von etwa 5 ng (Nanogramm) bis 10 «g täglich pro Kilogramm Körpergewicht liegen.

Polypeptide der Formel (I) werden vorwiegend nichtper-oral, d. h. mittels Injektion, rektal oder vaginal verabreicht, obgleich sie in manchen Fällen auch peroral verabreicht werden.

Als Beispiele für geeignete Darreichungsformen seien Injektionen, Suppositorien, Pessarien und Pulver genannt. Die Injektionen können durch Lösen von etwa 10—500 y eines Polypeptides der Formel (I) in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung hergestellt werden. Die Polypeptide der Formel (I) können auch durch Zugabe von Mannitol als Excipienten in lyophilisierte Ampullenprodukte übergeführt werden und sind in dieser Form jederzeit als In jektionen gebrauchsfertig.

Die als Ausgangsmaterialien im erfindungsgemässen Verfahren geeigneten Peptide können u. a. nach für die Peptid-herstellung bekannten Verfahren hergestellt werden.

5

615 661

Die Erfindung wird anhand der nachstehend angeführten Beispiele näher erläutert.

In den Beispielen bedeuten folgende Abkürzungen den Rf-Wert bei Dünnschichtchromatographie an Silikagel mit den folgenden Lösungsmittelsystemen :

Rf1: Chloroform/Methanol/Essigsäure 9:1:0,5

Rf2: Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 30:10:3:5

Rf3: n-Butanol/Äthylacetat/Essigsäure/Wasser 1:1:1:1

Beispiel 1

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Nva-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 a) Herstellung von Z-(D)-Nva-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2

Einer Lösung von Z-(D)-Nva-OH (380 mg), H-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 (690 mg) und HONB (300 mg) in 5 ml Dimethylformamid werden 340 mg DCC bei 0° C unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden lang bei 0° C und weitere 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird abfiltriert, um den entstandenen Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, das Filtrat wird zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst und die Lösung mit einer 4%igen wässerigen Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die gewaschene Lösung wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit einem Gemisch aus Äthylacetat (25 ml) und Äther (25 ml) digeriert, man erhält ein weisses Pulver, das abfiltriert und aus Äthanol-Äther nochmals ausgefällt wird. Die Ausbeute beträgt 1,12 g, [a]D23 -50,5° (c= 1,1 in Methanol), Rf1 = 0,32. Analyse für C32HS2O9N10

berechnet: C 53,32 H 7,27 N 19,43 gefunden: C 53,49 H 7,56 N 19,19

b) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Nva-

Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 Z-(D)-Nva-Leu-Arg(N02)-Pro-Gly-NH2 (1,0 g) wird in 10 ml 25%igem Bromwasserstoff in Essigsäure gelöst und die Lösung 50 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit 200 ml trockenem Äther verdünnt, um einen Niederschlag zu erhalten, dieser wird abfiltriert und gut mit trockenem Äther gewaschen. Das gesammelte Pulver wird über Natriumhydroxid bei vermindertem Druck getrocknet. Dieses Pulver wird in 10 ml Dimethylformamid zusammen mit (Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Phe-OH (1,0 g) und HONB (440 mg) gelöst. Die Lösung wird auf 0° C gekühlt und unter Rühren mit 400 mg DCC versetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden lang bei 0° C und weitere 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch filtriert, um den entstandenen Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, das Filtrat wird unter Zugabe von 100 ml Äther digeriert, um einen Niederschlag zu erhalten, welcher abfiltriert wird. Der gesammelte Niederschlag wird in 10%igem wässerigem Äthanol gelöst und die Lösung über eine mit Polystyrolharz [Amberlite XAD-2,150 bis 250 Mesh, 3,5 x 25 cm, Rohm & Haas Co, Ltd. USA] gefüllte Kolonne geleitet. Die Kolonne wird nach dem Gradien-tenelutionsverfahren mit 10%igem wässerigem Äthanol und 100%igem Äthanol (500:550 ml) eluiert. Die Hauptfraktion (380-520 ml) wird gesammelt und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 5 ml heissem Methanol gelöst und durch Zugabe von Äthylacetat nochmals ausgefällt, um das geschützte Decapeptidamid zu erhalten. 1,41 g [a]D24 - 35,4° (c = 0,12, in Methanol), Rf2 = 0,20, Rf3 = 0,56.

Das geschützte Decapeptidamid (500 mg) wird in 5 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff zusammen mit 0,5 ml Anisol bei - 70° C gelöst. Nach 30 Minuten langem Rühren bei -5°C wird der Fluorwasserstoff abgedampft. Der entstandene Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung zweimal mit 10 ml Äthylacetat extrahiert. Die wässerige Schicht wird über eine mit Carboxymethylcellulose (2 x 33 cm) gefüllte Kolonne geleitet, die Kolonne wird nach dem Gradien-tenelutionsverfahren unter Einsatz eines Ammoniumacetat-puffers als Eluens eluiert. [0,005M, pH 6,8 (500 ml)-0,2M, pH 6,8 (500 ml)]. Die Hauptfraktion wird gesammelt (420 bis 680 ml) und lyophilisiert, wobei ein weisses Pulver erhalten wird. Die Ausbeute beträgt 380 mg, [a]D22 — 32,4° (c = 0,52, in 5 %iger Essigsäure, Rf2 = 0,05, Rf3 = 0,68.

Aminosäureanalyse: His 1,01; Arg 0,98; Trp 0,87; Ser 0,94; Glu 1,00; Pro 1,02; Gly 1,00; Nva 1,01; Leu 1,00; Phe 0,97 (Peptidgehalt 84%).

Beispiel 2

Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Nle-

Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 nach dem Festphaseverfahren a) Herstellung von BOC-Gly-harz

In 60 ml Chloroform-Äthanol (2:1) werden 10 g Chlormethylharz eingebracht (CI-Gehalt 2,0 mMol/g), darauf folgt die Zugabe von 10,5 g BOC-Gly und 8,4 ml Triäthylamin. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt und dann 24 Stunden lang erhitzt. Das Harz wird abfiltriert und gut mit Dimethylformamid, dann mit Äthanol, Wasser, Äthanol und Äther in angegebener Reihenfolge gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 17,55 g. Die Aminosäureanalyse zeigt, dass dieses Harz 0,88 mMol/g BOC-Gly enthält.

b) Herstellung des (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr-(Bzl)-D-Nle-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-harzes

In das Reaktionsgefäss einer automatischen Peptidherstel-lungsvorrichtung (Modell APS-800 von Simadzu Seisakusho K.K., Japan) werden 2,177 g BOC-GIy-Harz, das wie oben angeführt hergestellt wurde, eingebracht und mit Dichlorme-than 12 Stunden lang angequollen. Dann werden folgende Aminosäuren nach dem unten angeführten Schema eingebracht:

BOC-Pro, BOC-Arg(Tos), BOC-Leu, BOC-D-Nle, BOC-Tyr(Bzl), BOC-Ser(Bzl), BOC-Trp, BOC-His(Tos), (Pyr)Glu.

Dichlormethan (3 Minuten x 3), —>50% Trifluoressigsäure/ Dichlormethan (10 bzw. 30 Minuten), —> Dichlormethan (3 Minuten x 3), —» Äthanol (3 Minuten x 3), —»Dichlormethan (3 Minuten x 3), —> 10% Triäthylamin/Chloroform (10 Minuten), —» Chloroform (3 Minuten X 3), —> Dichlormethan (3 Minuten x 2), BOC-Aminosäureanhydrid (hergestellt aus BOC-Aminosäure und DCC nach einem bekannten Verfahren) (30 und 60 Minuten), —» Acetylierung (mit Säureanhydrid in Dichlormethan und Triäthylamin) (1 Stunde), ^Dichlormethan (3 Minuten x 3) [nur (Pyr)Glu wird direkt mit DCC in Dimethylformamid kondensiert].

Das Harz wird mit Äthanol, Chloroform und Dimethylformamid, dann mit Äther gewaschen und getrocknet, die Ausbeute beträgt 6,20 g.

c) Herstellung von (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Nle-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH2

In 50 ml mit Ammoniak gesättigtem Methanol werden 2,622 g des nach b) hergestellten Harzes suspendiert, die Suspension wird bei Raumtemperatur 70 Stunden lang gerührt.

Das Harz wird abfiltriert und mit Dimethylformamid gewaschen. Das Filtrat und die Waschwässer werden zusammengegeben, bei vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und mit Äther behandelt. Nach diesem Verfahren erhält man 1,187 g rohes Pulver.

588 mg dieses Produktes werden in einer trockenen Säule an 50 g Silikagel gereinigt, als Entwicklerflüssigkeit wird ein Lösungsmittelsystem aus Methanol und Chloroform verwendet. Man erhält 186 mg des gewünschten Produktes.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

615 661

6

d) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nle-

Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 In Gegenwart von 0,2 ml Anisol und 0,2 ml Mercapto-äthanol werden 173,3 mg des nach c) hergestellten, geschützten Peptides in 5 ml trockenem Fluorwasserstoff gelöst, die Lösung wird bei 0° C 1 Stunde lang gerührt. Nach Ablauf dieses Zeitraumes wird sie bei vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und das Konzentrat in 20 ml Wasser gelöst. Die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert und das Filtrat über eine Kolonne (1,5 cm Durchmesser x 20 cm) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes (Amberlite IRA-140 Acetat-Form, Rohm & Haas Co. Ltd., USA) geleitet. Die vorgereinigten Effluenten werden anschliessend mittels Carboxylmethyl-cellulose (1,5 x 22 cm; nach dem Gradientenelutionsverfahren unter Einsatz von 0,005-0,2 M Ammoniumacetat mit einem pH-Wert von 6,8) und hierauf über Polystyrolharz (Amberlite XAD-2, Rohm & Haas Co. Ltd. USA) (1,5 x 7,5 cm, nach dem Gradientenelutionsverfahren unter Verwendung von 5-bis 709figem wässerigem Äthanol) gereinigt. Das Eluat wird der Gelfiltrationschromatographie an Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) (0,9 x 53,5 cm, 0,ln Essig-s säure) unterworfen. Man erhält 39 mg der gewünschten Verbindung. [a]D24 —40,5° (c = 0,5 in 5%iger wässeriger Essigsäure).

Aminosäureanalyse (Säurehydrolyse in Gegenwart von Thioglycolsäure): Glu 0,97; His 0,97; Trp 0,94; Ser 0,88; io Tyr 1,0; Leu 1,00; Nie 1,06; Arg 1.03; Pro 1,00; Gly 1,03 (87% Ausbeute).

Beispiele 3—13 In der nachstehenden Tabelle sind Decapeptidamide der Formel (1) angeführt, welche nach einem in Beispiel 2 ange-15 führten ähnlichen Verfahren, jedoch unter Einsatz der in der Tabelle angegebenen Ausgangsmaterialien anstelle der in Beispiel 2 angeführten hergestellt wurden.

Tabelle

Beispiel Decapeptidamide

(I)

Ri R2 K3

Md24 (c=0,5) in 5 %iger wässriger Essigsäure

Aminosäureanalyse

Ausgangsmaterialien die anstelle der in Beispiel 2 angeführten eingesetzt wurden BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-Nle BOC-Leu

10

Tyr D-Ser Leu -44,8°C

Tyr D-Abu Leu -43,2 °C

Tyr D-Nva Leu -38,9°C

Tyr D-Thr Leu —37,5°C

Tyr D-Phe Leu -52,4°C

Tyr D-Met Leu -42,0°C

Phe D-Phe Leu -69,5 °C

Tyr D-Abu Ile -38,5°C

His 1,02; Arg 1,01; Trp 0,97; Ser 1,91; Glu 1,00; Pro 1,01; Gly 1,03; Leu 0,97; Tyr 0,96

His 0,96; Arg 1,00; Trp 0,89; Ser 0,92; GIu 1,00; Pro 1,00; Gly 0,99; Abu 0,97; Leu 1,00; Tyr 0,98 His 1,00; Arg 0,99; Trp 0,92; Ser 0,91; Glu 1,00; Pro 1,00; Gly 1,01; Nva 0,97; Leu 0,98; Tyr 0,98 His 1,01; Arg 0,98 Trp 0,95; Thr 1,00 Ser 0,92; Glu 1,00 Pro 1,00; Gly 0,99 Leu 1,00; Tyr 0,98 His 1,00; Arg 0,99; Trp 0,87; Ser 0,89; Glu 1,00; Pro 0,99; Gly 1,01; Leu 0,98; Phe 1,00; Tyr 0,96 His 0,98; Arg 1,00; Trp 0,89; Ser 0,92; Glu 0,99; Pro 0,98; Gly 1,00; Met 0,79; Leu 1,00; Tyr 1,00 His 1,00; Arg 0,98; Trp 0,87; Ser 0,98; Glu 1,01; Pro 0,98; Gly 1,00; Leu 1,00; Phe 1,98

His 1,00; Arg 1,00; Trp 0,92; Ser 0,88; Glu 1,03; Pro 1,00; Gly 1,00; Abu 0,96; Ile 0,98; Tyr 0,98

BOC-Tyr(Bzl)

BOC-D-Ser BOC-Leu (Bzl)

BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-Abu BOC-Leu

BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-Nva BOC-Leu

BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-Thr BOC-Leu

BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-Phe BOC-Leu

BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-Met BOC-Leu

BOC-Phe

BOC-D-Phe BOC-Leu

BOC-Tyr(Bzl) BOC-D-Abu BOC-Ile

Tabelle (Fortsetzung)

Beispiel

Decapeptidamide

(«lo24

Aminosäureanalyse

Ausgangsmaterialien die anstelle der in Beispiel 2

(1)

(c=0,5)

angeführten eingesetzt wurden

Ri r2

r3

in 5 %iger wässriger Essigsäure

BOC-Tyr(Bzl)

BOC-D-Nle BOC-Leu

11

Phe

D-Ser

Nie

-32,5 °C

His 0,96; Arg 0,94; Trp 0,87; Ser 1,87; Glu 1,00; Pro 0,99; Gly 1,00; Nie 0,96; Phe 1,02

BOC-Phe

BOC-D-Ser BOC-Nle (Bzl)

12

Phe

D-Nle

Nie

-35,1 °C

His 1,00; Arg 1,01; Trp 0,81; Ser 0,89; Glu 1,02; Pro 1,00; Gly 1,00; Nie 2,03; Phe 0,97

BOC-Phe

BOC-D-Nle BOC-Nle

13

Phe

D-Nva

Ile

-35,5 °C

His 0,96; Arg 1,00; Trp 0,86; Ser 0,89; Glu 1,00; Pro 1,00; Gly 0,98; Nva 0,90; Ile 0,92; Phe 0,99

BOC-Phe

BOC-D-Nva BOC-Ile

Claims

615 661

1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Ri-R2-R3-Arg-Pro-Gly-NH2 (I)

worin Ri Tyr oder Phe, R2 D-Nle, D-Nva, D-Abu, D-Phe, D-Ser, D-Thr oder D-Met und R3 Leu, Ile oder Nie bedeuten und wobei die Aminosäuren, ausser bei der Angabe D, stets die L-Konfiguration haben, dadurch gekennzeichnet, dass man die zum Aufbau des Dekapeptids der Formel I nötigen Aminosäuren bzw. deren aktivierte Derivate gegebenenfalls unter intermediärem Schutz der von der Reaktion auszuschlies-senden reaktiven Gruppe in beliebiger zeitlicher Reihenfolge unter Bildung von Peptid-Bindungen miteinander kondensiert bzw. die Verbindung der Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1-R2-R3-Arg-Pro-Gly-OH oder deren aktiviertes Derivat gegebenenfalls unter intermediärem Schutz der von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven Gruppen mit Ammoniak kondensiert, wobei in den genannten Ausgangsverbindungen anstelle des Pyroglutamylrestes auch der Rest

R4OC-CH2-CH2-CH(NH2)-CO-

stehen kann, worin R4 eine Alkoxy-, Aralkoxy- oder Amino-gruppe bedeutet, welcher im Laufe des Verfahrens oder anschliessend daran zum Pyroglutamylrest ringgeschlossen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri für Tyr, R2 für D-Nle und R3 für Leu stehen.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Tyr, R2 D-Ser und R3 Leu bedeuten.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Tyr, R2 D-Abu und R3 Leu bedeuten.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Tyr, R2 D-Nva und R3 Leu bedeuten.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Tyr, R2 D-Thr und R3 Leu bedeuten.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Tyr, R2 D-Phe und R3 Leu bedeuten.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Tyr, R2 D-Met und R3 Leu bedeuten.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Phe, R2 D-Phe und R3 Leu bedeuten.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Tyr, R2 D-Abu und R3 Ile bedeuten.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Phe, R2 D-Ser und R3 Nie bedeuten.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Phe, R2 D-Nle und R3 Nie bedeuten.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Phe, R2 D-Nva und R3 Ile bedeuten.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rj Phe, R2 D-Nva und R3 Leu bedeuten.